Содержание к диссертации
ОГЛАВЛЕНИЕ 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
Глава 1. Стафилококки, их биологические свойства, роль в патологии
человека 12
Глава 2. Метициллинорезистентные стафилококки 19
Глава 3. Генетические аспекты развития метициллинорезистентности
стафилококков, способы ее преодоления 30
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ... 38
Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 38
Штаммы микроорганизмов 38
Питательные среды 38
Видовая идентификация стафилококков 39
Определение чувствительности стафилококков к метициллину (оксациллину) 39
Определение минимальной подавляющей концентрации метициллина (оксациллина) 40
Определение чувствительности метициллинорезистентных штаммов стафилококков к антибиотикам других групп 41
Определение гетерогенности популяций стафилококков по признаку метициллинорезистентности 42
Изучение факторов вирулентности стафилококков 43
Определение плазмокоагулазной активности 43
Определение гемолитической активности 44
Определение лецитиназной активности 44
Определение гиалуронидазной активности 45
Определение индекса вирулентности 46
4.9. Получение метициллиноустойчивых мутантов S.aureus 46
4.10. Выявление носительства метициллинорезистентных штаммов
стафилококков 47
4.11. Выявление гена ПСБ2а методом латекс - агглютинации 47
Глава 5. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 49
5.1. Распространенность метициллинорезистентных штаммов
стафилококков в некоторых лечебных учреждениях г. Саратова 49
5.2. Частота выделения метициллинорезистентных штаммов
стафилококков из различного патологического материала 62
5.3. Уровень резистентности к метициллину клинических штаммов
стафилококков 65
5.4. Чувствительность метициллинорезистентных штаммов
стафилококков к антибиотикам других групп 70
Стабильность метициллинорезистентности 72
Гетерогенность популяций стафилококков по признаку метициллинорезистентности 76
Вирулентные свойства метициллинорезистентных стафилококков....80
Активность стафилококковой плазмокоагулазы 81
Гемолитическая активность стафилококков 83
Лецитиназная активность стафилококков 86
Активность стафилококковой гиалуронидазы 88
Показатели вирулентности 90
5.8. Получение метициллиноустойчивых мутантов из S.aureus и изучение
их биологической активности 103
4
5.9. Носительство метициллинорезистентных штаммов стафилококков у
подростков 104
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 108
ВЫВОДЫ 118
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 121
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 122
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТСС — Американская коллекция типовых культур
ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения
ЖСА — желточно-солевой агар
КА - кровяной агар
КОЕ - колонии образующие единицы
МПА — мясо-пептонный агар
МПБ - мясо-пептонный бульон ,
МПК — минимальная подавляющая рост концентрация
МПК5о— минимальная концентрация, подавляющая рост 50% штаммов
МУК — Методические указания
НИИ - научно-исследовательский институт
НИЦФ - научно-исследовательский центр фармакологии
НПО — научно-производственное объединение
ОРИТ — отделение реанимации и интенсивной терапии
ПСБ - пенициллинсвязывающий белок
СГМУ — Саратовский государственный медицинский университет
СОБМК — Саратовский областной базовый медицинский колледж
CNS - коагулазонегативные стафилококки
EPIC - Европейский контроль за инфекционными заболеваниями в палатах
интенсивной терапии
ICARE - контроль за антимикробной резистентностью в палатах интенсивной
терапии
MRCNS - метициллинорезистентные коагулазоотрицательные стафилококки
MR - метициллинорезистентные штаммы
MRS -метициллинорезистентные стафилококки
MRSA — метициллинорезистентные штаммы S.aureus
MRSE - метициллинорезистентные штаммы S.epidermidis
MRSS - метициллинорезистентные штаммы S.saprophyticus
MS - метициллиночувствительные штаммы
MSS — метициллиночувствительные стафилококки
MSSA метициллиночувствительные штаммы S.aureus
MSSE метициллиночувствительные штаммы S.epidermidis
MSSS метициллиночувствительные штаммы S.saprophyticus
SA - S.aureus
SCGmec - стафилококковая хромосомная кассета
SCOPE - научный комитет по проблемам окружающей среды
SE - S.epidermidis
SENTRY - программа антимикробного контроля
SS - S.saprophyticus
VISA - штаммы S.aureus умеренно чувствительные к ванкомицину
VRSA - штаммы S.aureus резистентные к ванкомицину
Введение к работе
Актуальность проблемы. Стафилококки играют значительную роль в возникновении различных заболеваний человека, как в госпитальных условиях, так и вне стационара. Рїх роль в этиологии инфекций, вызванных грамположительными микроорганизмами, неуклонно растет. Так в госпиталях США к концу 2-го тысячелетия отмечено двукратное возрастание заболеваний, вызванных Staphylococcus aureus, и четырехкратное - Staphylococcus epidermidis [73]. Согласно данным SENTRY (1997-1998 г.г.) S.aureus оказался наиболее распространенным возбудителем внутрибольничных инфекций [125]. Особенно велико значение стафилококков в отделениях реанимации и интенсивной терапии, где на их долю приходится до 50% всех случаев инфекции [55, 60]. Необходимо отметить ведущую роль S. aureus и коагулазонегативных стафилококков среди возбудителей инфекций кровотока (SCOPE Program, 1995-1996 г.г.) [173].
Наряду с возрастанием значимости грамположительной флоры в структуре инфекционных заболеваний в последние два десятилетия лечение стафилококковых инфекций представляет серьезную проблему, что связано с формированием и распространением в популяции стафилококков явления антибиотикорезистентности. Наиболее актуальным является нарастание удельного веса стафилококков, устойчивых к метициллину (MRS), как маркеру резистентности ко всем Р-лактамным препаратам. Кроме того, у таких штаммов нередко отмечается ассоциированная устойчивость к препаратам других классов [45]. Так, частота устойчивости метициллинорезистентных стафилококков к макролидам, линкозамидам, тетрациклинам, хлорамфениколу превышает, по мнению ряда авторов, 80% [188, 164].
Развитие лекарственной устойчивости является результатом адаптации микроорганизма в процессе лечения антибиотиками, но при изучении антибиотикорезистентности установлено, что наряду с ростом устойчивости происходит изменение целого ряда признаков бактерий. Вероятно, что в
7 зависимости от механизма приобретения устойчивости изменения, происходящие в бактериальной клетке, могут иметь различное значение и по-разному отражаться на различных биологических характеристиках, в том числе определяющих свойства патогенности новых измененных штаммов [57].
Формирование резистентности стафилококков к метициллину связано с наличием гена тесА, входящего в состав «стафилококковой хромосомной кассеты - тес», который кодирует дополнительный пенициллинсвязывающий белок в мембране микроорганизма, обладающий низкой аффинностью к |3-лактамам [140, 154]. Причины появления этого генетического элемента в настоящее время не известны. Распространение штаммов, содержащих ген тесА, вероятно произошло от одного или более генетических предшественников в естественных популяциях стафилококков за счет горизонтальных переносов и рекомбинаций [31, 29]. Исходные штаммы выживали в условиях селективного прессинга антибактериальных препаратов в стационарах и давали многочисленное потомство, что повлекло за собой неоднократные эпидемические вспышки нозокомиальных инфекций, вызванные этими штаммами.
В настоящее время MRS стали эндемичными во многих стационарах, являясь причиной более 30% всех инфекций, вызванных стафилококками [206]. Наибольшая частота выделения метициллинорезистентных штаммов стафилококков отмечена в отделениях гематологического, онкологического и травматологического профилей [52, 159], причем в этих стационарах устойчивость к метициллину чаще наблюдается у коагулазонегативных стафилококков (CNS). Большинство исследователей указывают на то, что 1/4 всех S.aureus и более чем 1/2 CNS обладают резистентностью к метициллину [155, 173,219].
Существуют факты, указывающие на то, что MRS являются возбудителями более тяжелых форм госпитальной инфекции [5] и чаще ведут к летальному исходу по сравнению с MSS [103, 149]. Так, летальность от инфекций, вызванных резистентными штаммами, составляет 21%, в то время
8 как при инфекциях, вызванных чувствительными стафилококками, соответственно 8% [210]. По мнению ряда авторов среди возможных причин выявленного факта наряду с назначением неадекватной антибактериальной терапии и исходным статусом больного немаловажное значение может иметь и изменение биологических свойств метициллиноустойчивых штаммов, в том числе вирулентности и факторов ее обеспечивающих [4, 47].
Распространение штаммов стафилококков, устойчивых к метициллину, имеет географические отличия [76, 237], а также зависит от профиля стационара или специфики отделения [33, 90, 109].
Весьма неблагоприятным является факт обнаружения среди здорового населения носительства штаммов метициллинорезистентных стафилококков [47, 128, 200].
Определенные перспективы лечения MRS-инфекций связаны с применением препаратов нового поколения фторхинолонов, гликопептидов и линезолида. Однако в последнее десятилетие отмечен факт появления умеренно резистентных и устойчивых к ванкомицину штаммов S.aureus [9, 56], что еще больше обостряет проблему противомикробной химиотерапии инфекционных заболеваний, вызванных резистентными штаммами стафилококков.
Учитывая вышеизложенное, изучение распространенности
метициллинорезистентных штаммов стафилококков в некоторых стационарах г. Саратова, их биологических особенностей, причин формирования носительства таких штаммов является весьма интересной и актуальной задачей.
Целью настоящей работы явилось выявление распространенности метициллинорезистентных стафилококков в некоторых стационарах г.Саратова и среди здорового населения, изучение их биологических особенностей, оценка чувствительности MRS к антибиотикам для оптимизации лечения инфекций, вызванных такими штаммами. Задачи исследования: 1. Изучить распространение MRS в некоторых стационарах г. Саратова.
Определить зависимость частоты выделения MRS от профиля лечебного учреждения и характера исследуемого материала.
Дать оценку уровня резистентности MRS штаммов к метициллину, определить их чувствительность к линезолиду и ванкомицину.
Изучить некоторые биологические свойства MRS штаммов.
5. Выявить носительство MRS среди здорового населения г. Саратова.
Научная новизна. Впервые проведен анализ частоты выделения MRS в
лечебных учреждениях г. Саратова, который показал, что во всех обследованных стационарах г. Саратова встречаются метициллино-резистентные штаммы стафилококков, но их распространенность колеблется в зависимости от профиля лечебного учреждения и характера патологического материала.
Впервые определены уровни резистентности выделенных штаммов к метициллину. Это позволило установить, что в стационарах г. Саратова существенно преобладают стафилококки с высоким и средним уровнем устойчивости.
Выявлено, что феномен гетерогенности популяций MRS, циркулирующих в стационарах, более характерен для штаммов с низким или средним уровнем устойчивости.
Впервые выявлена зависимость стабильности признака устойчивости к оксациллину в зависимости от уровня метициллинорезистентности.
Впервые дана качественная и количественная оценка факторов вирулентности метициллинорезистентных штаммов стафилококков, выделенных в Саратовском регионе.
Впервые, используя математический метод, определены индексы вирулентности метициллинорезистентных штаммов стафилококков. Установлена взаимосвязь уровня метициллинорезистентности и степени вирулентности микроорганизмов.
Среди студентов медицинских учебных заведений г. Саратова выявлены носители устойчивых к метициллину штаммов стафилококков.
Теоретическая и практическая значимость. Проведенное исследование вносит существенный вклад в решение вопросов профилактики формирования метициллинорезистентных штаммов, дальнейшего распространения инфекций, а также адекватного лечения заболеваний, вызванных такими микроорганизмами.
Результаты проведенной работы являются убедительным свидетельством
возрастания в Саратовском регионе роли метициллинорезистентных
стафилококков в патологии человека и их серьезной эпидемиологической
значимости. Результаты изучения распространенности
метициллинорезистентных штаммов стафилококков в некоторых лечебных
учреждения г. Саратова представлены в виде информационного письма,
изданного совместно с Министерством здравоохранения Саратовской области и
предназначенного для руководителей лечебно-профилактическими
учреждениями разного профиля и организаторов здравоохранения.
Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе со студентами и слушателями ФПК ППС Саратовского государственного медицинского университета.
Предложенная в диссертационной работе количественная оценка вирулентности клинических штаммов стафилококков на основании формализации факторов патогенности конкретного штамма оформлена как рационализаторское предложение.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции студентов и молодых ученых Саратовского государственного медицинского университета «Молодежь и наука: итоги и перспективы» (2005г.), Межрегиональных конференциях студентов и молодых ученых Саратовского государственного медицинского университета «Молодежь и наука: итоги и перспективы» (2006, 2007г.г.), Международных конгрессах по антимикробной терапии МАКМАХ (2006, 2007г.г.), итоговой 67-й научной конференции СГМУ «Молодые ученые здравоохранению
региона» (2006г.), на IX съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (2007).
Структура работы. Диссертация изложена на 147 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, заключения, практических рекомендаций, выводов, списка использованной литературы, включающего 241 источник 63 отечественных и 178 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 21 таблицей, 18 рисунками и 2 фотографиями.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
«Резистентность создается человеком,
и только человек может решить эту проблему».
(Декларация по борьбе с антимикробной резистентностью)
