Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы. 11
2.1 Современные методы индикации листерий 11
2.2. Идентификация и типирование культур Listeria monocytogenes 18
2.3. Контаминированность продуктов и кормов листериями 30
3. Собственные исследования 38
3.1. Материалы и методы исследований 38
3.2. Результаты собственных исследований 43
3.2.1. Оптимизация ПЦР для анализа проб из объектов ветеринарного надзора 43
3.2.2. Сравнительная оценка эффективности различных питательных сред и условии культивирования при выделении Listeria monocytogenes 55
3.2.3. Определение сроков выживания листерий в мясных и молочных продуктах 59
3.2.4. Исследования по выявлению Listeria monocytogenes в объектах внешней среды 62
3.2.5. Анализ кормов на содержание Listeria monocytogenes 66
3.2.6. Исследования контаминации Listeria monocytogenes растительных продуктов и сырья. 69
3.2.7. Результаты анализа на содержание Listena monocytogenes молока и молочных продуктов 72
3.2.8. Определение контаминации листериями мяса и мясопродуктов 74
3.2.9. Биологические свойства выделенных культур листерий 76
3.2.9.1 Результаты изучения культурально-морфологических и биохимических свойств изолятов 76
3.2.9.2 Определение вирулентности и агглютинабельности выделенных изолятов 85
3.2.9.3 Изучение опасности контаминированных листериями объектов для лабораторных животных 89
4. Обсуждение результатов исследований 93
5. Выводы 110
6. Практические предложения 112
7. Список литературы 113
8. Приложения 139
- Современные методы индикации листерий
- Контаминированность продуктов и кормов листериями
- Оптимизация ПЦР для анализа проб из объектов ветеринарного надзора
- Результаты изучения культурально-морфологических и биохимических свойств изолятов
Введение к работе
Актуальность проблемы: Несмотря нато,.что с первого установления листериоза у животных прошло более 100 лет, проблема этой инфекции привлекает все возрастающее внимание ветеринарных и медицинских работников. Это обусловлено широкой?распространенностью листерий в; природе, увеличением числа заболевших листериозом людей, высоким уровнем летальности при генерализированных формах инфекции, бессимптомным листерионосительст-вом, значительным экономическим ущербом.от заболеваемости и падежа;сельскохозяйственных животных и затратами на профилактические мероприятия (J.1 Evans, et:al.v 1983; S. Ortel; 1983; 1989; I: Garnie, 1991;_И:А. Бакуловс соавт., 199г, 1994; B:M: Котляров,.1999; АЗМСнизе, А.И: Бузун; 1999; ВІВ; Красов-ский с соавт., 2000; F.M.i Маненкова с соавт., 2000; И:И. Гуславский с соавт;, 2003; Л:В; Родина с соавт., 2003).
Возбудитель листериоза выделен? от более 90 видов диких и домашних животных, птиц, рыб; насекомых и клещей І (P. Andre, 1966; Г.Р; Искаков, 1966; И;А. Бакулов, 1999; В: И: Г ершу н, 1988; И.С. Тартаковский с соавт., 2000; И. А. Бакулов, В;М; Котляров,2003). Листерий; обладая выраженными адаптивными: способностями и высокой метаболической лабильностью, могут не только длительно выживать в объектах окружающей среды и различных природных субстратах, но и размножаться в них, а также переходить от сапрофической фазы к паразитической и наоборот. В связи с этим наряду с традиционными представлениями о связи листерий с теплокровными животными отдельные исследователи рассматривают листериоз как типичную сапронозную инфекцию (FIT Сомов, В:Ю; Литвин, 1988; 1996; В:Ю: Литвин с соавт., 1996; ВЖ.Пушкарева с соавт, 1997),
Начиная с 80-х годов прошлого века в:результате многолетних эпидемических вспышек и спорадических случаев листериоза среди людей в ряде высо коразвитых стран (США, Великобритания; Канада; Франция, Швейцария), возникших в результате употребления готовых пищевых продуктов, данное заболевание стали рассматривать как пищевую инфекцию (В. Gellin, С. Broome et al., 1991; J; Farber, P. Peterkin, 1991; И;А. Бакуловїссоавт., 1991; И.С. Тартаков-ский с соавт., 1994).
Хотя в Российской і Федерации заболеваемость людей листериозом официально регистрируется начиная с 1992 года, но отсутствие эффективной системы санитарно-эпидемиологического надзора за этой инфекцией во всех,регионах страны и неудовлетворительное состояние лабораторной диагностики не позволили установить реальное значение листерии в патологии человека, так как диагностика листериоза чаще всего была связана с работой ветеринарных специалистов или энтузиазмом отдельных исследователей (Э.Ф; Опочинский с соавт., 1999; В:М. Котляров, 1999; А.В; Книзе с соавт., 1999).
Следует отметить и недостаточную изученность контаминированности возбудителем листериоза продуктов, кормов и ; других объектов ветеринарного и медико-санитарного надзора, о чем свидетельствуют лишь единичные сообщения-в отечественной; литературе (В:И. Гершун; 1983; ДА. Васильев, 1992; И.А. Бакулов с соавт., 1997; Р.К. Шарма; 1999; Г.М. Маненкова с соавт., 2000). Они указывают на циркуляцию листерии в природе, растительной; и животноводческой продукции, что свидетельствует о необходимости систематического их контроля на наличие листерии; Однако применяющиеся лабораторные, исследования шри обнаружении листерии основаны на бактериологических методах (Н:Э. Минаева, В.И: Ладный, 1999; Э.Ф. Опочинский с,соавт., 1999). Низкая чувствительность диагностических препаратов, длительность сроков проведения анализа, высокие цены селективных питательных сред не позволяют в полной мере определять состояние инфицированности листериями продуктов и кормов и установить. истинное положение и? уровень заболеваемости людей и животных листериозом (Т.М; Маненкова с соавт., 2000). Поэтому разработка и внедрение в лабораторную практику высокочувствительных и экспресс методов индикации листерий остается актуальной проблемой. В этом аспекте большой интерес представляет полимеразная цепная реакция, которая по данным отдельных авторов (S. Kholer et al., 1990; С.А. Ермолаева с соавт., 1994; А. Bubert et al., 1997; М. Monzano et al, 1997; B.B. Красовский с соавт., 2000; И.С. Тартаковский с соавт., 2001) обладает высокой чувствительностью и эффективностью; Однако ПЦР пока еще не получила практического применения из-за недостаточной ее апробации в лабораторной практике в сравнительном аспекте. Поэтому систематические исследования контаминированности объектов ветеринарного надзора4 листериями и изучение, биологических свойств: циркулирующих штаммов листерий стали насущной проблемой, решение. которой может способствовать установлению эпизоотического и эпидемического значения контаминированных листериями объектов и проведению целенаправленных мероприятий по недопущению возникновения листериоза среди людей и сельскохозяйственных животных.
Сравнительное изучение бактериологического метода и ПЦР для обнаружения листерий в объектах ветеринарного надзора позволит дать объективную оценку их эффективности и роли последней в лабораторной практике.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось определение контаминированности объектов ветеринарного надзора возбудителем, листериоза бактериологическим методом и ПЦР, а также изучение биологических свойств выделенных культур.
Для достижения данной цели были выдвинуты следующие задачи:
1. Оптимизировать полимеразную цепную реакцию для анализа объектов ветеринарного надзора и определить ее эффективность для индикации листерий.
2. Сравнительно оценить эффективность различных питательных сред для выделения возбудителя листериоза.
3. Определить сроки выживания листерий в мясных и молочных продуктах:
4. Установить контаминированность Listeria monocytogenes различных объектов бактериологическими исследованиями и полимеразной цепной реакцией.
5: Изучить основные биологические свойства выделенных культур листерий.
Научная новизна. Впервые широкомасштабными систематическими исследованиями бактериологическим методом и полимеразной цепной реакцией установлена степень контаминированности различных объектов внешней среды, кормов, пищевых продуктов, сырья растительного и животного происхождения возбудителем листериоза и их биологическая опасность для животных. Изучением биологических свойств 32 выделенных культур Listeria monocytogenes . показано, что на территории Республики Татарстан, Московской области и г. Москвы циркулируют патогенные листерий преимущественно I серогруппы, а с импортными мясными продуктами и полуфабрикатами попадают представители II серогруппы (12.2% от общего количества выделенных культур).
Оптимизированы методика подготовки, проб и, режим проведения ПНР для обнаружения ДНК листерий в различных объектах ветеринарного и медико-санитарного надзора.
Установлено, что сроки выживания листерий в контаминированных продуктах (молоко, кефир, мясо) варьируют в широком диапазоне в зависимости от объекта и температурного режима хранения.
Практическая значимость. Для первичного выделения листерий из различных объектов рекомендуется синтетическая элективная питательная среда, которую можно использовать в жидкой и плотной формах, что повышает эффективность обнаружения возбудителя листериоза.
Выявленную значительную контаминированность объектов ветеринарного надзора возбудителем листериоза и их способность длительно сохраняться в продуктах, кормах и объектах внешней среды необходимо учитывать при проведении противоэпидемических и противоэпизоотических мероприятий, в процессе переработки продукции растениеводства и животноводства, а при подготовке пищи соблюдать режим термической обработки.
Для предупреждения возникновения листериоза среди людей и животных в результате потребления контаминированных его возбудителем: продуктов, и, кормов целесообразно систематическое исследование объектов ветеринарного надзора на наличие в них листерий; для чего эффективно и наиболее удобно использование полимеразной цепной реакции согласно разработанных нами методических рекомендаций, утвержденных директором ВНИВИ 12 сентября 2000 г. и 19 августа 2002 г.
Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на: Юбилейной научной конференции, посвященной 50-летию Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии? МО РФ (Екатеринбург, 1999); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИТИБП, (Щелково, 2000); Международной научной конференции • посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета КГАВМ (Казань, 2000); Научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2001, 2002 г.г.); IV Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" (Москва, 2002); Международной научной конференции "Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине" (Москва, 2003) и ежегодных научных отчетных сессиях ВНИВИ за 1999-2003 г.г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Результаты анализа контаминированности возбудителем листериоза различных объектов ветеринарного надзора и эффективность бактериологического метода и ПЦР для их выявления;
- Биологические свойства выделенных культур листерий и экспериментальное обоснование биологической опасности контаминированных ими объектов;
- Выживаемость листерий в мясе и молочных продуктах при различных режимах хранения.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Работа изложена на 152 страницах, содержит 17 таблиц и 7 рисунков. Список использованной литературы включает 246 источников, в том числе 155 иностранных.
Современные методы индикации листерий
Возбудителями листериозаі являются грамположительные, неспорооб-разующие, палочковидные бактерии, объединенные в род Listeria. В; этот род входит. 7 видов, из которых наиболее патогенной для человека и животных является Listeria monocytogenes (И:А; Бакулов, 1967; Л.П: Лемешкина; 1972).
Кроме того, факторами патогенности обладают еще 2 вида: Listeria ivano-vii и Listeria seeligeri (Д. Стоянов и др., 1981; Н. SeeUger, 1985; J. Forsyth, 1991; E.T. Ryser, E.H. Marth; 1991; Т.И.Кольпикова с соавт., 2000): Для этих микроорганизмов характерен выраженный полиморфизм морфологических и;биологических, признаковой. Seeliger, 1961, 1973; И;А. Бакулов, 1967; Л.П: Лемешкина, 1972). Поэтому диагностика листериоза индикация и идентификация; его возбудителя связаны с определенными трудностями:
Наиболее эффективным? и» доказательным? является; бактериологическое выделение листерийІ (И:А. Бакулов, 1967; Э.Н1 Шляхов с соавт., 1979; Б.И: Ан-типов и др:, 1986).
Бактериологическая-диагностика предусматривает микроскопические:исследования: исходного материала, посевы на питательные среды, биопробу на лабораторных животных и идентификацию выделенных культур.
Учитывая особенность листерий; размножаться при 4G, был предложен: метод "холодного обогащения" (SM: George et al:, 1988; J:A. Fraser,.W:H. Sper-ber, 1988; B: Swaminathan, P.S. Hayes, 1989;J.M; Wensel, E.H: Marth; 1990; И: A. Бакулов; Д:А. Васильев, 1991). Данная, методика предполагает помимо обычного высева исследуемого образца в бульон 5и: агар и термостатирование при 3 5-3 7С, хранение части исследуемого материала в холодильнике при 4С в течение 2-3 месяцев: Несмотря -наt то, что инкубация: при 4С способствует: обогащению листериями, данный метод не удовлетворяет требованиям практики из-за длительности. Хотя для выращивания листерий пригодны; обычные питательные среды, многие авторы (С. Fulga, N. Bichirgin; 1966; И:А. Бакулов ,. 1967; К.В! Негода с соавт., 1970; В;А. Никитина с соавт., 1972; А.М! Алимов, О.А. Коты-лев, 1974; МЛХ Бутко, 1974; ЛЯ. Телишевская, М.И. Трусова, 1974) рекомендуют питательные среды более сложного состава: Для предотвращения; роста посторонней микрофлоры, особенно при ис следованиях продуктов, кормов и«объектов внешней среды предложены элек v тивные питательные среды. В качестве селективного фактора использовали теллурит калия, который подавляет рост многих грамотрицательных бактерий и: редуцируется листериями в теллурин, имеющий черный цвет, в связи с чем колонии имеют черный цвет (О.В. Кривоносова с соавт., 1970; А.А. Гукасян, В:М:. Трифонов, 1971; МЛ. Бутко, 1972; G. Obiger, A. Schonberg, 1973). В качестве селективного фактора при индикации листерий испытан ши рокий спектр - химических веществ и антибиотики (Н. Seeliger et al., 1970; А. Schonberg, 1973; В. Вгопка, 1975; В. Skalka, J. Smola, 1983; S. Ester etal:, 1986; Ф M;B. Call etal;, 1990; A. Schuchat et al., 1991;J:M; Farber, P.J1 Peterkin, 1991). За; последние годы разработаны ряд селективных сред для; выделения листерий, (J; Klinger, 1988; G. Curtis et al., 1989; В: Swaminathan et al., 1989), применение которых способствует повышению эффективности индикации. AM. Алимов с соавт. (1980) с зачетом питательных потребностей г листе рий сконструировали синтетическую элективную среду, где в; качестве селек тивных агентов включали налидиксовую кислоту, теллурит калия, полимиксин и нистатин. Данную среду рекомендуют применять в жидкой и плотной фор мах, что позволяет.проводить обогащение и выделение культуры листерий. D. Lucas с соавт. (1984) испытали три сложные синтетические среды для транспортировки, обогащения и выделения листерий; Они; используя данную методологию, из 100 образцов фекалий овец выделили 286 культур листерий. Традиционными методами из этих проб было выделено только 18 культур. Селективные факторы в той или иной степени могут ингибировать и рост листерий, поэтому принципиально важной: стала разработка методики выделения листерий с использованием эскулина; и цитрата железистого аммония (М.Е. Мс Bride, K.f.Girard, 1960; LA. Eraser, W.H. Sperber, 1988; J.D.W. Curtis et al, 1989; B. Swaminathan, P.S. Hayers, 1989; PJ Van-Netten et all, 1989). Добавление эскулина в качестве единственного источника углевода и цитрата железистого аммония в качестве индикатора , гидролиза углеводов позволяет дифференцировать Ь. monocytogenes от посторонней? микрофлоры. L.D. Rodriguez с соавт. (1986) впервые использовали среду с добавлением эскулина шцитрата железистого аммония в сочетании с налидиксовой кислотой и акрифлавином. В настоящее время в качестве обогатительного бульона за рубежом применяют различные варианты триптиказо-соевого бульона; с дрожжевым экстрактом и селективным компонентом, включающим акрифлавищ налидиксо-вую кислоту и циклогексимид (J.D.W. Curtis et al, 1989; В; Swaminathan, P.S. Hayer,1989).
При; выделении листерий обычно проводится непосредственный посев-исследуемого клинического образца на- селективный агар и обогащение материала в селективном бульоне при;30С в течение 24 часов с последующим Івысевом на селективный агар; Для выделения і листерий из і сильно; загрязненных объектов используют процедуру так называемого вторичного обогащения на бульоне UVM-2 или бульоне Фразера (Е.Т. Ryser, EH: Marth, 1987; PLC. Тарта-ковский с соавт., 2000):
Схема вторичного обогащения в среде UVM-2 получила наибольшее распространение для: выделения листерий прежде всего из мясных продуктов; Бульон Фразера используется для выделения листерий из более широкого спектра продуктов питания и образцов окружающей среды. Среда рекомендована Комитетом Международной организации (JS О) для обогащения при выделении L. monocytogenes из готовых продуктов питания и сырья животного: происхож дения (Е.Т. Ryser, Е.Н: Marth, 1987; J A. Varquer-Boland et al., 1996; Н:Д. Карли-канова с соавт., 1999).
L. Rollier с соавт. (1991) при выделении листерий из проб искусственно контаминированной колбасы наилучшие результаты получили в бульоне UVM I и П. В большинстве случаев для выделения культуры листерий; было достаточно одного дня для инкубации.
Контаминированность продуктов и кормов листериями
Режим амплификации: Первый цикл - денатурация при.94С в течение 4 мин, отжиг праймеров при 5 5С в течение 1 мин, синтез олигонуклеотидов при 72С в течение 2,5 мин. Затем денатурация при температуре 94С в течение 1 мин, отжиг праймеров при 57С в, течение 1 мин и синтез олигонуклеотидов і при 72С -1,5 мин. Данный режим выдерживался при 30 последующих циклах: В отдельных случаях (при: слабых полосах: амплификата) проводили повторную амплификацию. Для этого 5 мкл первичного амплификата вносили;в новую реакционную смесь и амплифицировали еще 20-25 циклов в том же режиме.
Амплификаты анализировали гель-электрофорезом в 1,2% агарозном геле, содержащем. этидий бромид. Пробы вносили в лунки агарозного геля І В количестве 10-15 мкл; Электрофоретическую камеру заливалшТАЕ буфером содержащим- этидий бромид так, чтобы толщина слоя жидкости; над поверхностью ; геля составила 1 -2 мм. Электрофорез проводили при силе тока, 10 В/см в течение 1-1,5 часов: По окончании электрофореза.пластины;геля просматривали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Результаты отдельных опытов документировали фотографированием. Результаты опыта по определению чувствительности ПЦР по описанному режиму с праймерами Ы и L2 представлены на рисунке 21 При этом использовалась ДНК, выделенная из исходного определенного количества клеток листе-рий (1 млрд. М.К.), которую последовательно разводили и использовали для амплификации в ПНР: Анализируя полученные данные, следует отметить, что наименьшее количество ДНК, давшая положительную реакцию, соответствует эквиваленту 10 бактериальных клеток. Следовательно, полученные данные свидетельствуют о достаточно высокой чувствительности и специфичности ПЦР, проводимой по разработанному нами режиму. Поэтому данная методика нами использовалась при исследовании различных объектов медико-санитарного и ветеринарного надзора. При индикации листерий методом ПЦР важное значение имеет подготовка проб к анализу. Для этого разные авторы использовали различные подходы, которые значительно варьировали- в зависимости от объекта исследования. Нами разработаны и успешно апробированы следующие процедуры подготовки? проб для ПЦР; Пробы жидких объектов (вода; молоко, растительное масло и др.) вобъеме не менее 100 см центрифугировалишри; 5000 g в течение 5-10 мин. При постановке ПЦР без предварительного обогащения: полученный осадок ресуспендировали в 200 мкл ТЕ-буфераї и переносили; в пробирки, эппен-дорфа. Затем? к этой суспензии добавляли 5 мкл 10 н раствора гидроокиси натрия. Содержимое пробирок смешивали, переворачивая несколько раз в течение 3-5;сек. Затем смесь нейтрализовали добавлением 50 мкл 2М трис-НСІ! буфера, рН 7,4 и центрифугрировали при 5000 g в течение 10 мин; После центрифугирования надосадочную жидкость, предположительно содержащую ДНК листерий переносили г в сухие: пробирки эппендорфа и использовали для проведения ПЦР или, при необходимости І проводили процедуру выделения! ДНК. При.этом к жидкости добавляли! смесь хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1), тщательно перемешивали и центрифугировали при 1000 g в течение 5-10 мин. Верхнюю фазу осторожно отсасывали s и переносили в чистую пробирку. ДНК осаждали добавлением равного объема холодного этанола (96%). Полученный J осадок слегка подсушивали на воздухе и; растворяли в деионизи-рованной воде.
Исследуемые пробы почвы, навоза, кормов (мясо-костная мука, силос; сенаж, трава) и зерновых продуктов (зерносмеси, корма) в количестве не менее 100 г помещали в колбы и заливали тремя объемами физиологического раствора хлористого натрия и І шуттелировали в течение 15 мин. Затем оставляли, чтобы отстаивалось. Жидкую часть фильтровали через широкопористые быст-рофильтрующие бумажные фильтры; Фильтраты центрифугировали при, 1000 g в течение 10 мин. Полученные осадки подвергали; дальнейшей обработке, как было описано ранее (осадки от жидких проб).
При исследовании образцов мяса,\ сыра; патологического материала пробы; измельчали ножницами или ножом и гомогенизировали в тканевом; гомоге-незаторе. В отдельных случаях при» необходимости І производили растирание этих проб в ступке с кварцевым песком: После гомогенизации пробы заливали физиологическим; раствором хлористого натрия І в соотношении 1:5. Тщательно перемешивали и-переносили в центрифужные пробирки; Для удаления обломков тканей суспензию центрифугировали при 1000 g в течение 3-5 мин: Надо-садочную жидкость вновь центрифугировали5 при 4000 g в течение 10-15 мин; Из полученного осадка выделяли ДНК также как описано ранее (осадки от жидких проб);
Из подготовленных таким образом\ проб по 3 мкл отбирали; для: амплификации в ПЦР: Образцы сливочного масла размельчали- в замороженном состоянии, и смешивали, в соотношении 1:2Г с физиологическим: раствором при температуре 4-5G и шуттелировали при 4G в течение 10 миш Затем центрифугировали при 1000 g в течение 3-5 мин, а надосадочную жидкость использовали для выделения ДНК. Для этого из жидкой фазы предполагаемые микроорганизмы осаждали ! центрифугированием f при 4000 g в течение 10-15 мин; Полученный t осадок использовали для выделения ДНК и последующего анализа в ПЦР. Параллельно с ПЦР эти пробы исследовали бактериологическими исследованиями. Для; этого из подготовленных образцово производили посевы на МПБ, МПА, содержащих 1 % глюкозы, синтетическую жидкую и плотную среды: В отдельных случаях пробы исследовали методом "холодного" обогащения; выдерживая посевы в холодильнике, при; 4G до 30 дней, а также постановкой биопробы;на?белых:мышах;с последующими бактериологическими- исследованиями.
Оптимизация ПЦР для анализа проб из объектов ветеринарного надзора
Полученные данные свидетельствуют о том, что минимальная, смертельная доза тест-культур листерий (штаммы "А-исходный", 9-128, 9-129, 9-72) для белых мышей при внутрибрюшинном заражении варьировала от 62500 до 250000 микробных клеток. Остаточная вирулентность вакцинного штамма листерий АУФ составляла 2,5 млрд. микробных клеток. После внутрибрюшинного заражения тест-культурами листерий мыши погибали на 3-12 сутки.
Как показали результаты титрации выделенных из разных объектов изо-ляты листерий обладали выраженной патогенностью. Они вызывали гибель белых мышей с клиникой парезов и паралича в дозах 250 тысяч - 1 млрд. микробных клеток, что близко к показателям тест-штаммов листерий.
При этом диссоциированные культуры имели относительно низкую вирулентность. В частности, у 7 изолятов (СТВЖО, ЗМК, СФр, МК, Сул, ИК и ОИ) минимальная смертельная доза составляла 1 млн. м.к. Из 32 выделенных изолятов у 14 минимальная смертельная доза оказалась 500 тысяч микробных клеток, у 10 - 250 тысяч м. к., а у одной культуры, выделенной из импортной баранины, вирулентность была самой высокой (125 тыс. м.к.)
Конъюнктивальную пробу на морских свинках ставили с изолятами СТВЖО, Почва, КС, Кап-1, Сул и штаммом І"А-исходный". В конъюнктиву глаза наносили по 2 капли суспензий агаровых культур в дозе 2 млн. м.к. На 2-4 сутки после нанесения всех культур, за исключением СТВЖО, у морских свинок развивался кератоконъюнктивит. При «нанесении в конъюнктивальный мешок суспензии изолята СТВЖО кератоконъюнктивит проявлялся на 5-е сутки.
Для определения агглютинабельности выделенных культур использовали следующие сыворотки: а) поливалентная листериозная агглютинирующая сыворотка Н-АВ и О n;v,vi,vn;ix; б) листериозная сыворотка I серогруппы для капельной реакции агглюти нации О-П; в) листериозная сыворотка.П серогруппы для; капельной; реакции агглю тинации 0-V, VI. Как показали результаты определения агглютинабельных свойств, все исследуемые ; культуры дали положительную капельную РА с поливалентной сывороткой: Это подтверждает результаты изучения культурально-морфологических, ферментативных и патогенных свойств и свидетельствует об их принадлежности к Listeria monocytogenes. При дальнейшей детализации се-ротиповой принадлежности выделенных культур по РА с серотиповыми сыворотками установили, что большинство из них, а именно 28 (87,5%) реагировали с сывороткой; I; серотипа. Следовательно у них присутствуют О-П антигены. Всего четыре (12,5%) изолятов.(Б-2,ИК, ОИ, окор; кур.) с сывороткой I; серогруппы не реагировали. Эти культуры давали положительную РАтолько с лис-териозной сывороткой II серогруппы, так.же как и штаммы 9-128?//9-130 и 9-72. Следует отметить, что все четыре изолята Б-2, ИК, ОИ, Окор. кур. были выделены при исследовании импортных продуктов: баранины, курятины, окорочка индейки и курицы соответственно.
Таким образом, изучением биологических свойств выделенных из различных объектов; 32 культуры в сравнении с 6 известными штаммами; подтверждена их принадлежность к Listeria monocytogenes и установлено, что они обладают достаточно выраженной патогенностью. Следовательно, алиментарный путь заражения листериозом;весьма вероятен; что указывает на необходимость более тщательного; контроля пищевых продуктов, сырья животного происхождения и других объектов ветеринарного надзора и соблюдения режимов их термической обработки и личной гигиены при переработке хранении и приготовлении пищи. Следует отметить более широкое распространение на территории Российской Федерации листерий Г серотипа, а II серотип выделялся только из импортных продуктов.
Для оценки эпизоотической;и-.эпидемиологической опасности контаминированных листериями. объектов важно не только определение патогенносте выделенных культур; но шпрямое:установление возможности заражения:животных от употребления этих объектов. В связи с этим нами были проведены опыты по- скармливанию лабораторным животным (белые мыши и морские свинки) отдельных контаминированных листериями объектов. В частности, в». одном опыте 10 белых мышей кормили І в течение 7 дней зерносмесью, из которой бактериологически была выделена культура листерий (культура обозначенная нами "ЗС"). За ними І вели клиническое наблюдение в течение 30 дней после последней дачи инфицированного корма. Однако ни у однойиз них не наблюдалось, изменений; состояния физиологического статуса. Поэтому опыт повторили на аналогичной группе белых мышей, но через 3 дня после начала-дачи инфицированного корма1 им І подкожно ввели, раствор декстран-сульфата 500000 из расчета 0,5 мг препарата на голову, так как из литературных данных известно, что в естественных условиях листериоз у людей чаще всего регистрируется на фоне: снижения резистентности организма; и? на- фоне применения иммунодепрессантов (Ji Rello et al, 1987).
В процессе наблюдения за этой группой мышей І 6 из них пали с признаками нервной клиники (парезов ш: паралича конечностей) на 17..24 дни» после начала опыта. Бактериологическими исследованиями от них выделили культуры листерии; биологические свойства і которых были - сходны с выделенным из зерносмеси изолятом;
Третий опыт проводили на 3 морских свинках; которым давали в течение 10 дней по 20 г рисовош крупы, из: которой была л выделена: культура листерии (РВ). На. 5-й день после начала опыта им? ввели внутримышечно раствор: декст-ран-сульфата» из расчета12j,5 мг препарата одной морской; свинке; В процессе опытатдве. морские свинки на 16 и 20 дни после:инъекции; декстран-сульфата пали с признаками? паралича и: пареза конечностей.1 У оставшейся морской свинки: существенных изменений і в клиническом статусе не наблюдалось в течение 45 суток от начала опыта: При бактериологических исследованиях павших обоих морских свинок были выделены,культуры листерии; У одной культуры листерии выделялись из продолговатого и костного мозга; а у второй - из селезенки, продолговатого и костного мозга.
При бактериологических исследованиях оставшейся живой в течение 45 дней морской: свинки из мезинтериального лимфатического узла была выделены культура листерии; Она в мазках из культур первой генерации имела форму длинных нитей и также окрашивалась по Граму положительно. После четырех пересевов г данная культура? приобрела морфологию; типичную для листерии; т.е: форму коротких палочек с закругленными: концамши: беспорядочным расположением;
Результаты изучения культурально-морфологических и биохимических свойств изолятов
У других штаммов (9-129 9-130. 9-72), длительно хранившихся в коллекции лаборатории, МЛД оказалась на уровне 250 000 м.к., а у штамма 9-128 -125 000 м.к. У вакцинного штамма листерий "АУФ" МИД для белых мышей составляла-2,5 млрд. м.к.
Большинство выделенных культур вызывали гибель белых мышей при внутрибрюшинном заражении в дозах 250 000 - 500 000 м.к., а у части культур, имеющих признаки диссоциации І (СТВЖО, ЗМК, СФр, ИК, Сул, ОИ), МИД? оказалась на уровне 1 млн. м:к. Следовательно, эти культуры обладают достаточно выраженной шатогенностью для лабораторных животных и могут представлять опасность для животных и человека. В частности, И:А. Бакулов (1967), А.М. Алимов (1974), Э.Р. Шафикова (1999) отмечали, что вирулентные штаммы листерий вызывают гибель белых мышей в дозах 250 000 - 1 млн. м.к. в зависимости от способа заражения, что согласуется с нашими данными.
При. постановке конъюнктивальной пробы с отдельными изолятами на морских свинках так же была установлена их патогенность, так как они вызывали гнойныйкератоконъюнктивит,характерный для возбудителя листериоза. Определением агглютинабельных свойств выделенных культур установили, что они все хорошо агглютинировались поливалентной листериозной сывороткой. Из 32 выделенных из разных объектов культур 28 взаимодействовали с листериозной сывороткой Г серогруппы (0-И) и лишь 4 (12,5%) изолята, выделенные из импортной баранины, курятины, окорочков куриного и индюшки, не реагировали с сывороткой I серогруппы и давали.выраженную агглютинацию с сывороткой II серогруппы (I-V, VI). Таким образом, все 32 выделенные культуры по биологическим свойствам отнесены к Listeria monocytogenes и являются патогенными для лабораторных животных. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что на территории Московской области, г. Москвы, Республики Татарстан циркулируют преимущественно листерий; относящиеся кТ серогруппе (87,5%).и лишь 12,5% культур, выделенных из импортных мясных продуктов, относятся ко ЕГ серогруппе. Для подтверждения эпидемиологического и эпизоотологического значения контаминированных листериями отдельных объектов нами проводились исследования по определению их опасности для лабораторных животных. Для этого естественно контаминированной листериями зерносмесью кормили белых мышей в течение 7 дней. Наблюдениями за этими;животными в течение Г месяца заболевания;листериозом не установили. Поэтому в повторном эксперименте через 3 дня после начала кормления белых мышей естественно инфицированной- зерносмесью, им ввели подкожно по 0,5 мл 0,1%-ного раствора декстран сульфата. На 17-24 дни после начала опыта из 10 белых мышей 6 пали с явлениями парезов и параличей конечностей и нервной: клиникой. При бактериологических, исследованиях от них выделялись культуры листерий, биологические свойства которых были сходны с исходной? культурой, выделенной из зернос-меси. В опытах на морских свинках с кормлением их естественно инфицированной рисовой крупой на фоне обработки декстран сульфатом так же была установлена возможность заражения. В частности, из трех морских свинок 2 пали от листериоза через 16 и 20 дней после начала опыта. Таким образом, нами установлена опасность контаминированных листериями кормов для животных. Обработка декстран сульфатом? животных способствовала проявлению листериоза, так как. данный препарат угнетает макрофагальную систему. Ибо известно, что листериозу наиболее чувствительны организмы со сниженной резистентностью и на фоне применения иммуно-депрессантов (J: Rello et al., 1987). Кроме того, при; постановке биопробы также рекомендуется обработка лабораторных животных гидрокортизоном (60). В наших экспериментах продемонстрирована эффективность использования для воспроизведения листериоза при заражении малыми дозами листерий декстрана сульфата 500 000; При количественном определении контаминации листериями зерносмеси; сыра, сосисок и замороженных пельменей установили, что содержание.в них листерий не большое и составляет от 38,7±3,4 до 162,3±7,2 КОЕ/100 г. По данному вопросу результаты наших исследований согласуются с данными Р.К. Шарма (1999), который при приблизительном подсчете в 16 пробах свиного фарша установил, что в 15 из них содержание листерий варьировало от 10 до 100 м.к./г и лишь в одной было свыше 1000 м.к./г. Относительно низкое количественное содержание листерий в исследуемых объектах, по-видимому, объясняется отсутствием благоприятных условий для их размножения и возможно и частичным отмиранием в процессе хранения, либо неравномерным распределением микробных клеток в этих кормах и продуктах.
Обобщая результаты проведенных исследований, можно констатировать о том; что они позволили выявить контаминированность различных объектов возбудителем листериоза и установить циркуляцию их в природе, сырье и продуктах растительного и животного происхождения. Выделенные культуры листерий соответствовали типичным представителям возбудителя листериоза и обладали патогенностью.
При сравнительных опытах по обнаружению листерий в различных объектах установлена пригодность и эффективность синтетической элективной среды, а также высокая результативность ПЦР для обнаружения ДНК листерий: Данный метод обеспечивает быстрое и надежное выявление наличия:ДНК листерий в различных объектах независимо от присутствия в них посторонней микрофлоры за 4-5 часов. В связи с этим ПНР может быть использована более широко в лабораторной практике особенно для обнаружения контаминирован-ности листериями пищевых продуктов и кормов:
