Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза (обзор литературы) 15
1.1. История формирования представлений о лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза 15
1.2. Классификация лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза 19
1.3. Молекулярно-генетические механизмы устойчивости микобактерий туберкулеза к лекарственным препаратам 21
1.4. Методы диагностики лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза 27
1.4.1. Культуральные методы определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза 27
1.4.2. Молекулярно-генетические методы определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза 33
Резюме 40
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Общая характеристика материалов исследования 41
2.2. Методы исследования 43
2.2.1. Бактериологические методы исследования 47
2.2.2. Молекулярно-генетические методы исследования 51
2.2.2.1. Выделение ДНК микобактерий туберкулеза из клинического материала и лизирование культур микобактерий туберкулеза 51
2.2.2.2. Обнаружение ДНК M. tuberculosis complex методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) 52
2.2.2.3. Определение ЛЧ МБТ к изониазиду, рифампицину и фторхинолонам методом биочипов 54
2.2.2.4. Типирование культур M. tuberculosis методом MIRU-VNTR 56
2.2.3. Методы статистической обработки результатов исследований 59
Резюме 60
Глава 3. Роль культуральных и молекулярно-генетических методов выявления микобактерий туберкулеза и определения их лекарственной чувствительности при исследовании резецированных участков легких и респираторного материала 61
3.1. Выявляемость микобактерий туберкулеза и определение их лекарственной чувствительности культуральными методами 61
3.2. Выявляемость микобактерий туберкулеза и определение их лекарственной чувствительности молекулярно-генетическими методами . 69
3.3. Сравнительная оценка бактериологических и молекулярно-генетических методов исследования 74
3.4. Алгоритм бактериологического исследования резецированных участков легких 79
Резюме 81
Глава 4. Сравнительный анализ биологических свойств возбудителя туберкулеза, выделенного из резецированных участков легких и респираторного материала 83
4.1. Сравнительный анализ скорости и массивности роста микобактерий туберкулеза, выделенных из операционного и респираторного материала, полученных на хирургическом этапе лечения больных 83
4.2. Сравнительный анализ лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза, выделенных из операционного и респираторного материала, полученных на хирургическом этапе лечения больных 84
4.3. Генотипирование микобактерий туберкулеза, выделенных из операционного и респираторного материала, полученных на хирургическом этапе лечения больных 88
4.4. Сравнительный анализ лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза, выделенных из операционного и респираторного материала, полученного на терапевтическом этапе лечения больных 89
Резюме 93
Глава 5. Анализ вариантов мутаций, ответственных за лекарственную устойчивость микобактерий туберкулеза, выделенных из резецированных участков легких 96
Резюме 108
Заключение 109
Выводы 116
Практические рекомендации 118
Список сокращений 119
Список использованной литературы 121
- Молекулярно-генетические механизмы устойчивости микобактерий туберкулеза к лекарственным препаратам
- Обнаружение ДНК M. tuberculosis complex методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ)
- Выявляемость микобактерий туберкулеза и определение их лекарственной чувствительности молекулярно-генетическими методами
- Сравнительный анализ лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза, выделенных из операционного и респираторного материала, полученных на хирургическом этапе лечения больных
Введение к работе
Актуальность темы исследования
В настоящее время эффективность химиотерапии, которая является главным средством лечения туберкулеза, остается невысокой. Одной из основных причин этого является лекарственная устойчивость (ЛУ) мико-бактерий туберкулеза (МБТ). Проблема ЛУ возбудителя туберкулёза приобрела в последнее время глобальное значение (Viljanen M.K., Vyshnevskiy B.L, Otten T.F., 1998; Пунга В.В., Капков Л.П., 1999; Friedman L.N., 2001; Туберкулез в РФ 2007 г., 2008; Бюллетень программы ВОЗ по борьбе с туберкулезом в РФ, 2012). Клиническое излечение у впервые выявленных больных с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) МБТ остается низким и составляет в Российской Федерации 16,2%, что в 3,1 раза ниже уровня клинического излечения туберкулеза у больных с лекарственно чувствительным (ЛЧ) возбудителем туберкулеза (Шилова М.В., 2007). В то же время, у значительного числа пациентов на этапах терапевтического лечения получить сведения о ЛЧ возбудителя к противотуберкулёзным препаратам (ПТП) невозможно в силу ограниченности и олиго-бактериальности процесса.
При туберкулёмах обнаружение МБТ в мокроте и промывных водах бронхов (ПВБ) составляет около 10,0% (Репин Ю.М., Авестян А.О., 2001). При посеве резецированного участка легкого выявление МБТ достигает 24,2% - 57,9% (Репин Ю.М., 1991; Григорян В.А., Головченко Р.Н., 2003; Карсканова С.С., 2007). При бактериологическом исследовании резецированных участков легких выявляется от 16,0% до 49,0% МБТ с ЛУ (Голов-ченко Р.Н., Григорян В.А., 2001; Григорян В.А., Головченко Р.Н., 2003). Свойства возбудителя непосредственно в очагах туберкулезного поражения остаются малоизученными. Важность исследования ЛЧ МБТ заключается в необходимости назначения больным адекватной химиотерапии.
В связи с тем, что классические бактериологические методы обнаружения, идентификации и определения ЛЧ МБТ требуют длительного вре-
мени (до 3-х месяцев), а также весьма ресурсоемки, в последние годы активно применяются молекулярно-генетические методы, лишенные перечисленных недостатков (Honore-Bouakline S., Vincensini J.P., 2003; Cheng V.C., Yew W.W., 2005; Галкина К.Ю., Носова Е.Ю., 2007; Барило В.Н., Кузьмин А.В., Черноусова Л.Н., 2009; Гаева Н.Д., Жилин О.В., 2010).
Изучение резецированного участка легкого дает наиболее полные сведения об особенностях процесса, возбудителе заболевания, его видовой принадлежности, чувствительности к ПТП и эффективности лечения. Значение бактериологических и молекулярно-генетических методов исследования резецированного участка легкого определяется необходимостью проведения послеоперационного курса химиотерапии с учетом данных о возбудителе и его чувствительности к ПТП.
Цель работы. Изучение клинически значимых биологических свойств возбудителя туберкулеза, выделенного из резецированных участков лёгких.
Основные задачи исследования:
-
Оценить роль культуральных и молекулярно-генетических методов выявления микобактерий туберкулеза и определения их лекарственной чувствительности при исследовании резецированных участков легких и респираторного материала (мокроты, промывных вод бронхов), полученных от больных, находящихся на хирургическом этапе лечения туберкулеза.
-
Провести сравнительный анализ клинически значимых биологических свойств (лекарственная чувствительность, массивность и скорость роста) возбудителя туберкулёза, выделенного из резецированных участков легких и респираторного материала, полученного на терапевтическом и хирургическом этапах лечения больных.
-
Провести анализ вариантов мутаций, ответственных за лекарственную устойчивость, у микобактерий туберкулеза, выделенных из резецированных участков легких.
4. Разработать алгоритм бактериологического исследования резецированных участков легких больных, перенесших хирургический этап лечения по поводу туберкулёза легких.
Научная новизна
Установлена высокая диагностическая значимость исследования операционного материала больных туберкулезом легких молекулярно-генетическими методами. Показана возможность исследования операционного материала методом биочипов, а также установлена высокая частота совпадений результатов определения лекарственной устойчивости МБТ к изониазиду и рифампицину методом биочипов и методом абсолютных концентраций при исследовании резецированных тканей легких. Впервые представлен анализ вариантов мутаций, обуславливающих лекарственную устойчивость МБТ, полученных из операционного материала, показана частота встречаемости выявленных мутаций. Выявлена идентичность генотипов изолятов МБТ, выделенных из различного биологического материала.
Научная новизна исследований подтверждается получением патента РФ на промышленный образец «Схема проведения исследования резецированных участков легких» № 82727 от 16 августа 2012 г.
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты исследований, выполненных в рамках данной диссертационной работы, позволили обосновать необходимость бактериологического исследования резецированных участков легких как обязательного этапа диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза и внедрить исследование операционного материала в клинико-лабораторную практику ФГБУ «Уральский НИИ фтизиопульмонологии» г. Екатеринбурга, ГБУЗ Свердловской области «Противотуберкулезный диспансер» г. Екатеринбурга и ГБУЗ «Челябинский областной клинический противотуберкулезный диспансер» г. Челябинска.
Полученные данные позволили оценить роль бактериологических и молекулярно-генетических методов выявления МБТ и определения их ЛЧ при исследовании резецированных участков легких и респираторного материала и включить материалы исследования в программы последипломной подготовки врачей-фтизиатров и бактериологов в ФГБУ «Уральский НИИ фтизиопульмонологии» г. Екатеринбурга и в учебные курсы кафедры фтизиатрии и пульмонологии ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России г. Екатеринбурга.
Кроме того, результаты исследования вошли в проект концепции по химиотерапии туберкулеза в Российской Федерации (приложение №4) (Медицинский альянс, 2013. №1. С. 5-21).
Положения диссертации, выносимые на защиту
-
Молекулярно-генетические методы исследования имеют большую разрешающую способность и сокращают сроки выявления микобактерий туберкулеза из резецированных участков легких и определения их лекарственной чувствительности по сравнению с культуральными методами.
-
Результаты определения лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза методом биочипов совпадают с результатами определения лекарственной чувствительности методом абсолютных концентраций.
-
Резецированные участки легких являются информативным материалом, позволяющим получить достоверные сведения о возбудителе туберкулеза непосредственно из очага туберкулезного поражения.
-
Алгоритм бактериологического исследования резецированных участков легких от больных, оперированных по поводу туберкулеза, позволяет повысить диагностическую значимость и сократить время данного исследования.
Апробация работы и публикации Основные результаты работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Модернизация фтизиатрии. Современные технологии оказания противотуберкулезной помощи населения» (г. Екате-
ринбург, 2011 г.); Юбилейной сессии, посвященной 90-летию ЦНИИТ РАМН «Актуальные вопросы борьбы с туберкулезом» (г. Москва, 2011 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом» (Санкт-Петербург, 2011 г.); конференции молодых ученых с международным участием «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» (г. Москва, 2012 г.); научно-практической конференции «Инновационные медицинские и образовательные технологии в обеспечении качества и доступности противотуберкулезной помощи населению» (г. Екатеринбург, 2012 г.); I Конгрессе Национальной ассоциации фтизиатров «Актуальные проблемы и перспективы развития противотуберкулезной службы в Российской Федерации» (г. Санкт-Петербург, 2012 г.); Региональной научно-практической конференции с международным участием «Пути повышения качества и эффективности деятельности противотуберкулезных учреждений» (г. Екатеринбург, 2013 г.); Научной сессии Уральского НИИ фтизиопульмонологии с международным участием «Фундаментальные исследования практический фтизиатрии» (г. Екатеринбург, 2013 г.).
По теме диссертации опубликовано 12 работ, 3 из них – в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации результатов диссертационных исследований.
Объем и структура диссертации
Молекулярно-генетические механизмы устойчивости микобактерий туберкулеза к лекарственным препаратам
ЛУ, то есть способность возбудителя заболевания сохранять жизнеспособность при воздействии на него лекарственных препаратов, является одним из основных биологических свойств. Механизмы, обуславливающие ЛУ, можно условно разделить на три группы: барьерный механизм (изменение проницаемости клеточной стенки и мембран), разложение или инактивация препарата ферментами и модификация мишени антибактериального средства, происходящая благодаря применению нуклеотидной последовательности соответствующих генов и, как следствие, изменение метаболизма [156]. МБТ обладают первоначальной, естественной лекарственной устойчивостью ко многим антибиотикам [199] – -лактамам, макролидам и тетрациклинам, что является результатом высокой липофильности их клеточной стенки, обеспечивающей эффективный барьер [113, 128]. В то же время, многие потенциальные детерминанты устойчивости кодированы в самом геноме микобактерий [128]. Проявление ЛУ МБТ является следствием накопления хромосомных мутаций, в отличие от других бактерий, у которых ЛУ чаще всего обусловлена плазмидами или мобильными генетическими элементами. Основными механизмами развития ЛУ МБТ к ПТП являются мутации в гене, ответственном за синтез белка-мишени действия препарата, или гиперпродукция метаболитов, инактивирующих препарат [138, 153, 170, 185, 199]. Скорость развития резистентности соответствует частоте возникновения мутаций в ДНК МБТ. Подобные мутации могут встречаться и у природных, «диких» штаммов МБТ еще до их контакта с ПТП [132, 134, 138, 199]. Природные штаммы МБТ, имеющие мутации в хромосомах, равномерно распределены по земному шару [138]. Примером природноустойчивых штаммов могут быть M. bovis, устойчивые к пиразинамиду, и М. аfricanum, устойчивые к тиоацетазону. Частота возникновения спонтанных мутаций, влекущих за собой развитие ЛУ, достаточно низкая и составляет 10-4 для этамбутола и пиразинамида, 10-6 для изониазида и стрептомицина, 10-7 для рифампицина и 10-12 для фторхинолонов [13, 92, 141, 216]. Вероятность одновременных спонтанных мутаций к изониазиду и рифампицину составляет 2,5610-10 [95], что находится за пределами числа бактерий, обнаруживаемых в каверне. Важно отметить, что МЛУ МБТ как результат спонтанных мутаций практически невозможна, поскольку нет единого гена, кодирующего МЛУ, а мутации, приводящие к развитию устойчивости к различным препаратам, генетически не связаны [152]. Устойчивость к тому или иному ПТП не представляет каких-либо селективных преимуществ МБТ до тех пор, пока данный микроорганизм не будет подвержен воздействию препарата [175]. При лечении туберкулеза одним ПТП происходит уничтожение МБТ, чувствительных к данному препарату. В то же время, МБТ, устойчивые к данному препарату, продолжают размножаться. При смене препарата произойдет селекция МБТ, устойчивых как к первому так и ко второму препарату. Накопление мутаций в микобактериальной популяции под воздействием неадекватной химиотерапии или монотерапии является основной причиной развития ЛУ МБТ к нескольким ПТП [123, 137, 172, 184, 185, 203]. Развитие молекулярной генетики открыло возможности для изучения генов МБТ, контролирующих ЛУ, и механизмов ее развития [65, 91, 116, 156, 156, 213]. Геном M. tuberculosis расшифрован на примере лабораторного штамма H37Rv [127] и составляет 4 411 529 пар нуклеотидов (п. н.). Геном представлен 4056 генами (91% общей емкости генома), на сегодняшний день определены функции 52% генов [125]. Одной из примечательных черт МБТ является наличие генов, дублирующих ключевые ферментные системы. Анализ клинических изолятов МБТ позволил обнаружить большое количество мутаций генов, часть из которых переводит обменные процессы микроорганизма на дублирующий путь. К концу XX века для каждого ПТП основного ряда и для многих препаратов резервного ряда был определен хотя бы один ген, специфические мутации в котором приводят к развитию ЛУ МБТ [42, 184, 219].
Рифампицин нарушает процесс транскрипции и тормозит жизнедеятельность МБТ, взаимодействуя с -субъединицей РНК-полимеразы [184]. Устойчивость к рифампицину у МБТ в 96% случаев обусловлена точечными мутациями или короткими инсерциями или делециями в последовательности фрагмента rpoB гена длиной 81 п. н., обозначаемого в англоязычной литературе как RRDR (Rifampicin Resistance Determining Region) [209]. На настоящий момент в данном регионе описано свыше сорока мутаций [111, 184, 199]. Мутации, обнаруженные в кодонах 531, 526 и 513, приводят к рифампицинрезистентности высокого уровня. В таких случаях больных, имеющих МБТ с подобными мутациями, рекомендуется лечить препаратами резервного ряда. Мутации в кодонах 522, 518, 516 и 511 сопровождаются низким уровнем устойчивости к рифампицину [111, 225]. Изолированная ЛУ к рифампицину встречается редко. Наиболее часто ЛУ к рифампицину ассоциирована с ЛУ к изониазиду, что делает рифампицин «маркером» МЛУ МБТ [185, 195, 228].
За устойчивость к изониазиду в геноме МБТ отвечают, по меньшей мере, четыре гена. Ген katG кодирует продукцию каталазы-пероксидазы, фермента, переводящего изониазид в его активный метаболит, подавляющий активность енол-кислой фосфатредуктазы, участвующей в синтезе миколовой кислоты [107, 148, 199, 229, 230]. Ген inhA МБТ отвечает за синтез енол-кислой фосфатредуктазы, и мутации в нем не позволяют изониазиду вмешиваться в синтез миколовой кислоты, что влечет за собой ЛУ [199]. Ген a hpC кодирует алкил-гидропероксид-редуктазу, и ген ox yR принимает участие в регуляции окислительного стресса в микобактериальной клетке [131, 161, 180]. Активность работы генов, участвующих в метаболизме изониазида, связана между собой. Каталаза-пероксидаза, кодируемая katG геном, окисляет изониазид до активного метаболита, который ингибирует ферменты, контролируемые геном inhA, участвующие в биосинтезе клеточной стенки МБТ. Потеря активности пероксидазы может контролироваться геном ahpС [186].
Мутации в генах katG и inhA найдены в 75-85% устойчивых изолятов. В гене katG к настоящему времени описано около 60 точечных мутаций, инсерций и делеций, приводящих к устойчивости M. tuberculosis. Наиболее часты замены в кадонах 315, 328, 335 гена katG [152]. Картирование мутаций в полирезистентных штаммах M. tuberculosis показало, что в 50-95% случаев имеет место замена Ser на Thr в кодоне 315 гена katG [29, 35, 145, 230]. Нуклеотидная замена С (-15) на Т относительно сайта инициации трансляции в промоторной области inhA приводит к устойчивости в 50-70% случаев [130]. Помимо генов katG и inhA, около 20 точечных нуклеотидных замен, приводящих к устойчивости к изониазиду, описаны в межгенной регуляторной области генов oxyR и ahpC (приблезительно 10-20%) [184].
Большинство штаммов МБТ, содержащих мутации в гене inhA и не содержащих мутации в гене katG, имеют сравнительно низкий уровень ЛУ к изониазиду. В то же время, у штаммов с полной делецией гена katG, уровень ЛУ к изониазиду значительно выше [229].
Недавно было показано, что мутации в гене mshA, кодирующем фермент, участвующий в биосинтезе микотиновой кислоты, также вызывают ЛУ к изониазиду у штаммов МБТ in vitro, однако его роль в клинической ЛУ еще предстоит выяснить [217].
ЛУ к стрептомицину возникает в результате мутаций в генах, кодирующих строение субъединиц рибосом, причем преобладают мутации в rpsL-гене, кодирующем рибосомальный белок S12 (кодон 43 или реже 88). Менее значимой мишенью является ген rrs, кодирующий 16S-компонент рибосомальной РНК (нуклеотиды 491, 513, 516 или 903) [133, 136, 199]. Мутации в названных структурах определены у 50 и 20% клинических стрептомицинустойчивых изолятов, соответственно. Замена лизина на аргинин в 43 кодоне – наиболее распространенная мутация в гене rpsL, вызывающая ЛУ к стрептомицину высокого уровня [136, 149, 177]. Недавно было установлено, что мутации в гене gidB, кодирующем метилтрансферазу, специфичную для 16S рРНК, являются причиной ЛУ к стрептомицину низкого уровня в 33% изолятов МБТ [178]. Этамбутол действует на ферменты, вовлеченные в биосинтез арабиногалактана и липоарабиноманнана – основных структурных компонентов клеточной стенки МБТ [168, 226]. У 60% штаммов МБТ с ЛУ к этамбутолу наблюдается изменение в аминокислотном составе в положении 306 гена embВ, который кодирует фермент арабинозилтрансферазу [184]. У МБТ был также идентифицирован ген embCAB, отвечающий за развитие ЛУ к этамбутолу [210]. Фторхинолоны угнетают синтез ДНК в результате связывания с бактериальной топоизомеразой II (ДНК-гиразой). У штаммов МБТ, устойчивых к фторхинолонам, выявлены мутации в генах gyrA (320 пар оснований) и gyrB (375 пар оснований), которые кодируют две А и две В субъединицы второго типа ДНК-топоизомеразы [110, 204, 207]. Мутации гена gyrA, в основном, группируются в 90, 91 и 94 кодонах [106, 164, 207], реже в кодонах 74, 83 и 87 [106, 205]. Мутации кодона 95 являются естественным полиморфизмом и не участвуют в образовании ЛУ к фторхинолонам [201]. В гене gyrB мутации возникают значительно реже [164, 220]. В последнее время у МБТ был обнаружен еще один механизм фторхинолоновой устойчивости, связанный с мутациями в гене M fpA [146].
Обнаружение ДНК M. tuberculosis complex методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ)
Обнаружение ДНК МБТ методом ПЦР-РВ включало в себя: одновременную амплификацию фрагмента ДНК МБТ и фрагмента ДНК внутреннего контрольного образца и гибридизационно-флуоресцентную детекцию, которая производится непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени». Для амплификации специфической нуклеотидной последовательности IS6110 геномного материала M. tuberculosis complex методом ПЦР-РВ применяли коммерческую тест-систему «АмплиСенсMTC FL» (ООО «ИнтерЛабСервис», Москва) и амплификатор iCycler iQ5 (Bio-Rad, США). На стадии амплификации использовали отрицательный и положительный контроли («АмплиСенс», ООО «ИнтерЛабСервис», Россия). Полученные данные – кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам – анализировали после окончания работы амплификатора с помощью программного обеспечения используемого прибора и рекомендаций производителя тест-систем. Гибридизационно-флуоресцентную детекцию специфической мишени проводили по каналу FAM, ВКО – по каналу HEX.
Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией (устанавливали в середине линейного участка прироста флуоресценции положительного контроля в логарифмической шкале), что соответствовало наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (Ct).
Результат амплификации по каналу считали положительным, если кривая флуоресценции имеет типичную для ПЦР-РВ S-образную форму и однократно пересекается с пороговой линией в области достоверного прироста флуоресценции, отрицательным – в случае отсутствия кривой типичной формы, не пересекающейся с пороговой линией, сомнительным – во всех остальных случаях. При получении невалидного результата проводили повторную амплификацию образца, в случае повторного получения аналогичного результата повторяли анализ образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
По данным производителя аналитическая чувствительность данной тест-системы составляет 1-5х102 микробных тел на 1 мл, специфичность – 100%. Хранение архивных образцов ДНК МБТ осуществляли при температуре минус 70 С. Высокая чувствительность, специфичность и быстрота проведения анализа чрезвычайно ценны для клинической практики, однако метод не позволяет определять степень жизнеспособности выявляемых микроорганизмов. 2.2.2.3. Определение ЛЧ МБТ к изониазиду, рифампицину и фторхинолонам методом биочипов Все образцы с положительными результатами на IS6110 подвергали исследованию на наличие мутаций. Для исследования мутаций ЛУ МБТ к изониазиду, рифампицину и фторхинолонам использовали метод гибридизации с флуоресцентным изображением на биологическом микрочипе «ТБ-Биочип» и «ТБ-Биочип-2» (ООО «Биочип-ИМБ», Россия). На рисунках 2.6 и 2.7 представлены схемы биочипов для выявления мутаций, приводящих к устойчивости к указанным противотуберкулезным препаратам. Дискриминирующие олигонуклеотиды, размещенные на биочипах, способны обнаруживать мутации в генах rpoB, katG, inhA, ahpC и gyrA.
Подготовку образцов ДНК МБТ для гибридизации осуществляли при помощи двухэтапной мультиплексной амплификации участков генов, мутации в которых приводят к возникновению ЛУ, на амплификаторе «Терцик» (ООО «ДНК-технология», Россия). Амплификационную смесь готовили согласно инструкции к пользованию наборами «ТБ-Биочип» и «ТБ-Биочип-2» (ООО «Биочип-ИМБ», Россия). Реакционную смесь (2 мкл) после первой стадии ПЦР использовали в качестве матрицы при проведении второй ее стадии. Вторую стадию ПЦР проводили с праймерами, меченными флюоресцентной меткой СY-5, и получали преимущественно одноцепочечный меченный продукт.
Полученные меченые ампликоны гибридизировали с иммобилизованными на микрочипе олигонуклеотидными зондами в течение 12 часов при температуре 37 оС. По окончании гибридизации биочип трижды промывали дистиллированной водой при 37 С, высушивали в струе воздуха до полного исчезновения капель на поверхности подложки.
Анализ результатов гибридизации детектировали с помощью аппаратно-программного комплекса для анализа изображений биочипов «Чипдетектор-01» с использованием специализированного программного обеспечения «Imageware» (ООО «Биочип-ИМБ», Россия). Инсталляцию и эксплуатацию комплекса осуществляли в соответствии с инструкцией по пользованию комплексом.
Гелевые ячейки, содержащие олигонуклеотиды, объединены в группы таким образом, что сравнение интенсивностей флуоресцентных сигналов ячеек каждой группы позволяло делать заключение о наличии или отсутствии мутаций (минорного полиморфизма), приводящей к замене одного аминокислотного остатка. Максимальный флуоресцентный сигнал свидетельствовал об образовании совершенного гибридизационного дуплекса в ячейке, где данный сигнал был зарегистрирован. Если такой сигнал регистрировался в ячейке с иммобилизованным олигонуклеотидом, комплементарным ДНК МБТ чувствительного типа, то это говорило о том, что в исследуемом участке образец ДНК мутаций не имеет и является чувствительным к ПТП. В случае регистрации максимального сигнала в иной ячейке внутри рассматриваемой группы, считали, что изучаемый образец содержит мутацию, соответствующую комплементарному основанию, входящему в состав иммобилизованного олигонуклеотида, и является устойчивым к ПТП.
Выявляемость микобактерий туберкулеза и определение их лекарственной чувствительности молекулярно-генетическими методами
При исследовании респираторного материала молекулярно генетическими методами, а именно ПЦР в режиме «реального времени» (RealTime PCR), ДНК M. tuberculosis complex была найдена в 32 (19,9% (95% ДИ 14,0%-26,9%)) образцах из 161 (Рис. 3.1). Из 291 образца резецированных участков легких ДНК M. tuberculosis complex была выделена в 285 (97,9% (95% ДИ 95,5%-99,2%)) случаях (Рис. 3.1).
Таким образом, при определении ДНК M. tuberculosis complex в операционном материале молекулярно-генетическими методами достоверно выявляется в 5 раз больше ДНК, чем при исследовании респираторного материала, полученного непосредственно перед оперативным лечением (2=301,5; р 0,01).
С помощью метода биочипов удалось определить наличие или отсутствие мутаций ответственных за ЛУ в геноме M. tuberculosis complex, выделенных из респираторного материала, в 12 (7,5% (95% ДИ 3,9%-12,7%)) образцах из 161 (Рис. 3.2). 20 (12,4% (95% ДИ 7,7%-18,5%)) образцов ДНК МБТ из 161 были низко копийными.
Анализ результатов исследования ДНК МБТ, выделенных из респираторного материала, на биочипах показал, что в 1 из 12 (8,3% (95% ДИ 0,2%-38,4%)) образцов ДНК мутации в генах rpoB, katG, inhA, промоторной области ahp-oxyR и gyrA не были обнаружены, в 11 (91,7% (95% ДИ 61,6%-99,8%)) случаях выявлялись мутации в указанных генах МБТ (Табл. 3.6). В 8,3% (95% ДИ 0,2%-38,4%) (1 из 12) случаев были обнаружены мутации, которые отвечают за лекарственную устойчивость только к изониазиду, то есть обуславливают моноустойчивость МБТ. Сочетание мутаций в генах, ответственных за МЛУ МБТ, было в 83,4% (95% ДИ 51,5%-97,9%) (10 из 12) случаев, причем мутации, ответственные за ЛУ ко всем трем препаратам (рифампицину, изониазиду и фторхинолонам), были найдены в 66,7% (95% ДИ 34,9%-90,1%) (8 из 12) случаев, мутации, обуславливающие ЛУ к рифампицину и изониазиду, были выявлены в 16,7% (95% ДИ 2,1%-48,5%) (2 из 12) случаев.
Мутации устойчивости к изониазиду были обнаружены в 100,0% (95% ДИ 71,5%-100,0%) (11 из 11) случаев от всех мутантных штаммов, к рифампицину – в 90,9% (95% ДИ 58,7%-99,8%) (10 из 11), к фторхинолонам – в 72,7% (95% ДИ 39,0%-94,0%) (8 из 11) (Табл. 3.7).
Метод биочипов позволил определить наличие или отсутствие мутаций ответственных за ЛУ в геноме M. tuberculosis complex, полученных из резецированных участков легких, в 279 (95,9% (95% ДИ 92,3%-97,9%)) образцах из 291 (Рис. 3.2).
Анализ устойчивости к изониазиду, рифампицину и фторхинолонам на биочипах показал, что 69,9% (95% ДИ 64,1%-75,2%) (195 из 279) штаммов имели мутации в генах rpoB, katG, inhA, промоторной области ahp-oxyR и gyrА, 30,1% (95% ДИ 24,8%-35,9%) (84 из 279) - мутаций не имели (Табл. 3.8). Спектр ЛЧ МБТ, определенный наличием или отсутствием мутаций, представлен в таблице 3.8. Из таблицы видно, что в 30,1% (95% ДИ 24,8%-35,9%) (84 из 279) образцов были обнаружены ЛЧ МБТ. 16,5% (95% ДИ 12,3%-21,4%) (46 из 279) образцов содержали моноустойчивые МБТ, из которых 12,9% (95% ДИ 9,2%-17,4%) (36 из 279) образцов имели мутации устойчивости к изониазиду, 2,5% (95% ДИ 1,0%-5,1%) (7 из 279) – к рифампицину и 1,1% (95% ДИ 0,2%-3,1%) (3 из 279) – к фторхинолонам. 53,4% (95% ДИ 47,4%-59,4%) (149 из 279) образцов содержали МБТ с множественной лекарственной устойчивостью, причем 43,0% (95% ДИ 37,1% 72
49,0%) (120 из 279) из них были устойчивы к рифампицину и изониазиду, а 10,4% (95% ДИ 7,1%-14,6%) (29 из 279) – к рифампицину, изониазиду и фторхинолонам.
Мутации устойчивости к изониазиду были обнаружены в 94,9% (95% ДИ 90,8%-97,5%) (185 из 195) случаев от всех мутантных штаммов, к рифампицину – в 80,0% (95% ДИ 73,7%-85,4%) (156 из 195), к фторхинолонам – в 16,4% (95% ДИ 11,5%-22,4%) (32 из 195) (Табл. 3.9). Исследование операционного материала методом биочипов имеет статистически достоверно большую диагностическую значимость по сравнению с исследованием респираторного материала, полученного непосредственно перед оперативным лечением (2=353,4; р 0,01).
А также, молекулярно-генетические методы позволяют за достаточно короткие сроки (3 дня) выявить ДНК МБТ и определить наличие или отсутствие мутаций, обуславливающих ЛУ, что помогает своевременно назначить пациенту адекватный режим химиотерапии с учетом характера выявленной ЛУ.
По результатам исследования показана возможность использования коммерческих тест-систем «ТБ-Биочип» и «ТБ-Биочип-2» (ООО «Биочип-ИМБ», Россия) для определения ЛЧ МБТ, выделенных из резецированных участков легких.
Сравнительный анализ лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза, выделенных из операционного и респираторного материала, полученных на хирургическом этапе лечения больных
Сравнительный анализ лекарственной чувствительности МБТ, выделенных из операционного и респираторного материала, полученных на хирургическом этапе лечения методом абсолютных концентраций удалось провести у 19 больных.
При сопоставлении результатов определения ЛЧ МБТ из резецированных участков легких (n=19), с результатами ЛЧ МБТ из респираторного материала (n=23), полученных от одних и тех же пациентов (n=19) на хирургическом этапе лечения, методом абсолютных концентраций совпадение составило 100,0%.
У всех 19 больных были выявлены культуры МБТ с лекарственной устойчивостью (табл. 4.2). У 8 (42,1% (95% ДИ 20,2%-66,5%)) пациентов были найдены МБТ с ЛУ к пяти ПТП (изониазиду, рифампицину, этамбутолу, стрептомицину и канамицину). У 6 (31,5% (95% ДИ 12,5%-56,5%)) больных были выявлены МБТ с ЛУ к изониазиду, рифампицину, этамбутолу и стрептомицину. 2 (10,5% (95% ДИ 1,3%-33,1%)) пациента имели МБТ с ЛУ к изониазиду, рифампицину, этамбутолу и канамицину. Культуры МБТ с ЛУ к изониазиду, рифампицину, этамбутолу и канамицину, а также культуры МБТ с ЛУ к изониазиду, рифампицину и стрептомицину были получены от 1 (5,3% (95% ДИ 0,13%-26,1%)) больного каждая. Таким образом, у 18 (94,7% (95% ДИ 73,9%-99,9%)) больных были обнаружены ЛУ МБТ к 2 основным ПТП I ряда (изониазиду и рифампицину), то есть имели МЛУ МБТ. Еще от 1 (5,3% (95% ДИ 0,13%-26,1%)) больного была получена культура МБТ с ЛУ к изониазиду, этамбутолу, стрептомицину и канамицину.
Сравнительный анализ результатов определения наличия или отсутствия мутаций в геноме МБТ, выделенных из операционного и респираторного материала, полученных на хирургическом этапе лечения методом биочипов удалось провести только у 11 больных.
При сравнении результатов определения наличия или отсутствия мутаций в геноме МБТ, выделенных из респираторного материала (n=12), с результатами определения наличия или отсутствия мутаций в геноме МБТ, полученных из резецированных участков легких (n=11) одних и тех же пациентов (n=11), методом биочипов совпадение составило 100,0%.
Спектр лекарственной чувствительности МБТ, выделенных из операционного и респираторного материала, полученного на хирургическом этапе лечения больных методом биочипов, показан в Таблице 4.3. У 1 (9,1% (95% ДИ 0,2%-41,3%)) из 12 больных и в респираторном и в операционном материале было обнаружено ДНК МБТ не содержащее мутации в генах rpoB, katG, inhA, промоторной области ahp-oxyR и gyrA, в материале 10 (90,9% (95% ДИ 58,7%-99,8%)) больных выявлялись мутации в указанных генах МБТ. В 9,1% (95% ДИ 0,2%-41,3%) (1 из 11) случаев были обнаружены моноустойчивые МБТ, которые имели мутации в гене inhA, отвечающие за ЛУ к изониазиду. Сочетание мутаций в генах, ответственных за МЛУ МБТ, было обнаружено в 81,8% (95% ДИ 48,2%-97,7%) (10 из 11) случаев, причем мутации, ответственные за ЛУ ко всем трем препаратам (рифампицину, изониазиду и фторхинолонам), были найдены в 63,6% (95% ДИ 30,8%-89,1%) (7 из 11) случаев, мутации, обуславливающие ЛУ к рифампицину и изониазиду, были выявлены в 18,2% (95% ДИ 2,3%-51,8%) (2 из 11) случаев.
Таким образом, МБТ, содержащиеся в респираторном материале, полученном на хирургическом этапе лечения, и операционном материале, по спектру ЛЧ идентичны.
У 7 больных удалось сравнить результаты определения ЛЧ МБТ, выделенных из резецированного материала и респираторного материала, полученного перед операцией, двумя методами (методом абсолютных концентраций и методом биочипов). Данные о ЛЧ МБТ, выделенных из различного материала на хирургическом этапе лечения, совпали. Однако проведенное исследование показало, что на этапе хирургического лечения больных выявляемость МБТ из респираторного материала и соответственно определение их ЛЧ низки. Считаем, что не целесообразно использование всего спектра современных методов лабораторной диагностики в предоперационном этапе лечения.
