Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Теоретические основы направленного регулирования расти тельно-микробных взаимодействий 12
1.1 Современные представления о коэволюции растений и микроорганизмов фитосферы 12
1.2 Типы взаимодействия растений и микроорганизмов 35
1.3 Использование микробно-растительных симбиозов в растениеводстве, защите растений, охране окружающей среды 47
1.4 Методические подходы к изучению микроорганизмов прикорневой зоны растений 57 экспериментальная часть
Глава 2. Объекты и методы исследования 76
2.1 Характеристика растительных объектов исследования и условия их выращивания 76
2.2 Отбор и подготовка образцов для исследования 81
2.3 Основные методы и условия проведения исследований 82
2.4 Модельные эксперименты 87
Глава 3. Растения как центры формирования микробных сообществ на выработанных торфяниках 90
3.1 Общая характеристика микрофлоры выработанных торфяников 91
3.2 Топография микроорганизмов в биогеоценозах на выработанных торфяниках 93
3.3 Особенности бактериальных комплексов, ассоциированных с растениями на выработанных торфяниках 97
Глава 4. Закономерности организации и функционирования микробных комплексов в ризосфере генотипически различных растений на дерново подзолистой почве 103
4.1 Изменение численности и биомассы микроорганизмов
прикорневой зоны ячменя на в онтогенезе растений 103
4.2 Сортовые особенности формирования микробных комплексов в ризосфере ячменя ПО
4.3 Сортовая специфичность заселения корней микроорганизмами при искусственной инокуляции 114
Глава 5. Межорганизменные взаимодействия в ризосфере клевера лугового 126
5.1 Кислото- и алюмоустойчивые ризобии в ризосфере клевера лугового 126
5.2 Комплексы актиномицетов в ризосфере клевера лугового 144
5.3 Влияние мицелиальных прокариот на симбиотические отношения клевера лугового с клубеньковыми бактериями 152
Глава 6. Эпифитные и эндофитные бактериальные комплексы 162
6.1 Особенности организации эпифитных комплексов семян зерновых злаков 162
6.2 Выделение и изучение свойств эндофитных бактерий 167
6.3 Распространение метилотрофных бактерий на поверхности и в тканях растений 175
6.4 Изучение антагонистических свойств метилотрофных бактерий... 178
6.5 Влияние на микроорганизмы фитосферы растительных терпеноидов 181
Глава 7. Потенциал использования микробно-растительных взаимодействий в фитобиотехнологии и растениеводстве 188
7.1 Поиск и выявление высокоэффективных форм микроорганизмов с полифункциональными свойствами в природных субстратах 188
7.1.1 Результаты скрининга бактерий, активно колонизирующих корни озимой ржи, вторфяных почвах 188
7.1.2 Микосимбионтные бактерии как стимуляторы роста растений 190
7.2 Эффекты воздействия метилотрофных бактерий на рост растений in vitro 193
7.3 Изучение адаптивного потенциала ризобактерий ячменя на дерново-подзолистой почве 204
7.4 Антагонистическая активность актиномицетов из ризосферы различных видов и сортов сельскохозяйственных культур 213
Заключение 216
Выводы 224
Литература
- Методические подходы к изучению микроорганизмов прикорневой зоны растений 57 экспериментальная часть
- Топография микроорганизмов в биогеоценозах на выработанных торфяниках
- Сортовая специфичность заселения корней микроорганизмами при искусственной инокуляции
- Комплексы актиномицетов в ризосфере клевера лугового
Введение к работе
Актуальность проблемы. Повышение жизнестойкости и выносливости растений за счет использования естественных помощников - почвенных и ризосферных микроорганизмов -одно из перспективных направлений управления продуктивностью сельскохозяйственных культур (Тихонович и др, 2005, Кравченко и др , 2002) Ассоциированные с растениями микроорганизмы играют важную роль в их развитии, участвуя в снабжении растений элементами питания, фитогормона-ми, витаминами и другими факторами роста Многие из ассоциативных микроорганизмов продуцируют соединения, инги-бирующие патогенную микрофлору (токсины, антибиотики, сидерофоры), а также способствуют появлению у растений-партнеров так называемой индуцированной устойчивости, помогающей в защите от фитопатогенов (Cattelan et al, 1999)
Стратегия использования микроорганизмов в повышении продуктивности и устойчивости растений к заболеваниям осуществляется в настоящее время по двум главным направлениям - экстенсивному и интенсивному Экстенсивные методы основаны на стимулировании или ингибировании деятельности аборигенных микроорганизмов, оказывающих на растения соответственно положительное или негативное воздействие в местах их природного существования
Интенсивные методы основаны на интродукции высокоэффективных форм микроорганизмов с полифункциональными свойствами во внешнюю среду в виде суспензии свободных или иммобилизованных на специальных носителях клеток Концептуальным направлением развития интенсивных микробных технологий в сельском хозяйстве является поиск новых микроорганизмов и создание оригинальных технологических процессов для получения новых биопрепаратов, биоудобрений различного сельскохозяйственного назначения и конструирования высокоэффективных микробно-раститель-ных систем
Изучение комплексов микроорганизмов в фитосфере сельскохозяйственных растений необходимо как для выявления факторов их направленной регуляции, так и для разработки стратегии поиска и выделения комплементарных с растениями ассоциативных микроорганизмов с фиторегуля-торными и биоконтролирующими свойствами Особую ценность представляет перспектива создания микробных биопрепаратов, разнообразие и спектр действия которых должны активно пополняться и расширяться при резком снижении токсичности и отрицательного влияния на человека, растения и окружающую среду (Чеботарь, 2007)
Эффективность микробно-растительного взаимодействия в значительной степени зависит от уровня интеграции участвующих в нем партнеров, в том числе на генном уровне (Lugtenberg, Dekkers, 1999, Проворов, 2005)
Наряду с исследованием генетических основ продуктивности симбиоза важное практическое значение имеет изучение соответствия экологических условий потребностям конкретных растительно-микробных систем Основное внимание в исследовании растительно-бактериального взаимодействия в настоящее время уделяется выяснению закономерностей выживания интродуцируемых в ризосферу микроорганизмов Между тем, специфика аборигенных микробных сообществ, складывающихся в прикорневой зоне различных видов и сортов растений, и ее изменение под воздействием экологических факторов, таких, как, кислотность почвы и связанная с нею токсичность ионов алюминия, остаются до сих пор малоизученными Разработка этих вопросов поможет развить теоретические основы к направленному регулированию растительно-бактериального взаимодействия в реальных условиях дерново-подзолистых почв
Цель работы - разработка принципов использования микробного потенциала агрофитоценозов европейского Северо-Востока в повышении продуктивности и устойчивости
сельскохозяйственных растений к заболеваниям и абиотическим стрессам
Задачи исследования
Изучение закономерностей формирования микробно-растительных ассоциаций на примере восстановительной сукцессии нарушенного торфодобычей биогеоценоза (БГЦ)
Выяснение закономерностей организации и функционирования микробных комплексов, ассоциированных с хозяйственно значимыми для региона сельскохозяйственными растениями для выявления факторов их направленной регуляции
Определение численности и концентрации биомассы микроорганизмов, соотношения ее основных компонентов в ризосфере и в свободной от корней почве
Выявление характера связи между экологическими свойствами сорта и комплекса бактерий в его ризосфе-ое
Изучение возможности получения искусственных ассоциаций метилотрофных бактерий с растениями in vitro
Поиск, выявление и выделение микроорганизмов с био-технологически ценными свойствами для использования в растениеводстве
Место проведения работы Работа выполнена в Зональном НИИ сельского хозяйства Северо-Востока им Н В Рудницкого и является частью плановых тематик лаборатории генетики (1999-2007 гг), № госрегистрации 01200203899,
Выражаю глубокую признательность директору института, академику РАСХН В А Сысуеву за предоставленную возможность и оказанное содействие при проведении исследований
Сердечно благодарю за совместную работу чл-корр РАСХН НА Родину, докторов с-х наук Л И Кедрову, ТКШешегову, кандидатов с-х наук МИТумасову,
И А Устюжанина, кандидатов биол наук О Н Шуплецову, О В Мерзаеву Их вклад отражен в соответствующих публикациях
Защищаемые положения.
1. Специфический состав корневого депозита отдельных видов и сортов сельскохозяйственных растений является одним из ведущих экологических факторов, определяющих процессы колонизации корней бактериями и формирование ассоциированных с корнями растений микробных комплексов
Значительная часть бактериального комплекса ризосферы растений на почвах дерново-подзолистого типа представлена популяциями, способными смещать низкие значения рН в нейтральную сторону, в том числе, в присутствии ионов алюминия Адаптивный потенциал ризобактерий связан с сортовыми особенностями корневой экскреции растений и вносит существенную роль в формирование продуктивности сорта
Биопленка почвенных водорослей, формирующаяся в период «цветения» на поверхности остаточного после промышленной выработки слоя торфа, представляет собой уникальную эконишу, объединяющую черты ризосферы и филло-планы высших растений, благодаря чему служит источником для выделения перспективных в биотехнологическом отношении штаммов микроорганизмов с полифункциональными свойствами и широким экологическим диапазоном
Сопоставление видового разнообразия стрептомицетов в ризосфере различных сортов и аналогичное сравнение спектров антифунгального действия их представителей указывает на существование прямой зависимости между разнообразием видов и частотой встречаемости видов антагонистов в комплексе
5 Эффективное использование растением
ростстимулирующего и биоконтролирующего потенциала прокариот возможно лишь в ризосфере видов и сортов расте-
ний с благоприятным соотношением индивидуальных компонентов корневых выделений, что необходимо учитывать при разработке принципов и методологии создания биопрепаратов для улучшения роста и защиты растений на основе живых культур бактерий
6 Комбинированное использование традиционных методов культуры ткани и метода бактериальной колонизации растений m vitro позволяет разработать принципиально новые технологии их культивирования, в особенности для растений с низкой регенерационной способностью
Научная новизна. Впервые теоретически обоснована и экспериментально подтверждена целесообразность использования в растениеводстве и биотехнологии растений природных изолятов микроорганизмов, адаптированных к региональным эдафическим условиям и биологическим особенностям созданных в местных условиях сортов
Показана практическая возможность эффективного симбиоза клевера лугового с природными алюмотолерантными изолятами ризобий из кислого местообитания Установлена высокая конкурентоспособность природного изолята с производственным штаммом в условиях стресса
Установлена более высокая частота выявления и выделение бактерий с фиторегуляторными и биоконтрольными свойствами из природных субстратов при отклонении значений кислотности и обеспеченности элементами питания от оптимума
Впервые выявлены специфические особенности комплексов эпнфитных и эндофитных бактерий различных видов и сортов зерновых злаков, заключающиеся в различной структуре доминирования и частоте встречаемости в их составе представителей, способных оказывать угнетающее и (или) стимулирующее действие на другие микроорганизмы и на растения С позиций системного подхода исследованы биоразнообразие и физиолого-биохимические особенности акти-
номицетного комплекса ризосферы, получены новые данные, расширяющие и углубляющие представления о явлении анти-биозиса
Разработаны и подобраны методические приемы селективного выделения эндотрофных микроорганизмов для скрининга метаболически активных штаммов
Экспериментально показана возможность создания искусственных растительно-микробных ассоциаций с участием аэробных розовоокрашенных факультативных метилотроф-ных бактерий на основе каллусной культуры ячменя, мери-стемных растений картофеля и земляники садовой Выявлена способность ряда выделенных культур рода Methylobacterium стимулировать рост и морфогенез растений m vitro Показана способность ряда изолятов метилотрофных бактерий оказывать гормон- и витаминозаместительное действие в культуре изолированной ткани растений
Практическая значимость работы. Систематизированные в базе данных результаты изучения свойств природных изолятов из различных локусов фитосферы (корни, листья, почки, семена, внутренние ткани) являются основанием к направленному поиску и выделению культур с фиторегуля-торными и биоконтрольными свойствами и могут способствовать решению широкого круга задач микробной экологии и биотехнологии
Полученные результаты могут быть также использованы при разработке способов биологической защиты растений от фитопатогенов, направленных на активизацию агрономически ценной микрофлоры в микролокусах ее естественного распространения
Создана коллекция культур, способных к синтезу физиологически активных метаболитов и имеющих хороший потенциал в разработке новых биотехнологий, направленных на повышение продуктивности растений и устойчивости их к стрессам
Изученные закономерности взаимодействия между бактериями и растениями в алюмокислых условиях дерново-подзолистых почв представляют интерес для разработки стратегии и тактики биологической ремедиации почв, подверженных техногенному закисленню или загрязненных алюминием
На основе полученных результатов даны методические рекомендации по выделению, изучению свойств и поддержанию в коллекции природных изолятов бактерий для использования в фитобиотехнологии
Апробация работы Материалы диссертации были доложены и представлены на И1 и IV Всесоюзных конференциях "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Москва, 1986, Пу-щино, 1992), Всесоюзной конференции "Торф в народном хозяйстве" (Томск, 1991), 9-м и 10-м Международных конгрессах по торфу (Уписала, 1992, Бремен, 1996), Всероссийской конференции "Сельскохозяйственная микробиология в 19-21 веках" (С-Петербург, 2001), Международной конференции "Озимая рожь селекция, семеноводство, технологии и переработка" (Киров, 2003), Всерос конф "Вопросы экологии и природопользования в аграрном секгоре" (Ижевск, 2003), Третьей международной конференции по биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии (Москва, 2004), Науч-практ конференции "Современные аспекты селекции, семеноводства, технологий, переработки ячменя и овса" (Киров, 2004), Всероссийских научных школах "Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга научный и образовательный аспекты" (Киров, 2004, 2005, 2006), Втором Всероссийском Съезде по защите растений "Фитоса-нитарное оздоровление агроэкосистем" (Санкт-Петербург, 2005), Международ конф "Грибы и водоросли в биоценозах -2006" (Москва, 2006), IV Всероссийской научной конференции "Химия и технология растительных веществ" (Сыктывкар, 2006), Междунар конф "Устойчивое развитие природа-обще-
ство-человек" (Москва, 2006), на годичных отчетных сессиях НИИСХ С-В РАСХН, 1999-2006 гг.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 68 работ, в том числе монография и учебное пособие в соавторстве, 21 статья в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, шести глав экспериментальной части, заключения и выводов Она включает 268 страниц машинописного текста, 19 рисунков, 50 таблиц, 2 приложения. Список литературы включает 424 работы, из которых 210 на иностранных языках.
Методические подходы к изучению микроорганизмов прикорневой зоны растений 57 экспериментальная часть
Появление на Земле первых прокариотных организмов, как закономерный результат эволюции органических молекул, обусловило развитие различных взаимодействий их друг с другом и абиогенной средой обитания. Эти взаимодействия явились толчком к возникновению биотического круговорота химических элементов лежащего в основе функционирования биосферы. Крупный вклад в теорию эволюции биосферы внес академик A.M. Уголев (1985, 1988). Согласно автору, биосферу следует рассматривать как трофосферу, состоящую из разнообразных трофоценозов, сосуществующих в виде цепей или сетей (блоков), обеспечивающих круговорот вещества и энергии. Организмы, входящие в трофоценозы, сочетаются по определённым закономерностям - парагене-тическим связям, в которых значение имеет не их родство, а функциональное место в круговороте веществ. В связи с этим эволюция видов лимитирована «экологическими лицензиями» в пределах экосистем (трофоценозов) и ограничена рамками последних. Иными словами, авто- и гетеротрофы в пределах трофоценозов обречены на взаимную параллельную коэволюцию. При трофоцено-тическом подходе микроорганизмы гетеротрофы следует рассматривать как необходимый и равноправный с фотосинтезирующими растениями компонент биосферы.
Первые живые клетки были анаэробными гетеротрофами, использовавшими в качестве строительного материала и топливного сырья растворённые в море органические соединения. По мере роста и размножения этих первых клеток запасы органических соединений в древних морях постепенно истощались. В таких условиях выжить могли лишь те клетки, которые приобрели способность использовать в качестве строительного материала простейшие соединения, в частности двуокись углерода, а в качестве источника энергии - солнечный свет.
Первыми автотрофными фотосинтезирующими клетками, выделявшими кислород, были цианобактерии. До их появления кислорода в атмосфере не было вообще. Ультрафиолетовые лучи легко проходили через атмосферу и достигали поверхности Земли. Жизнь была ограничена мелководьем. Цианобактерии были основным ядром древних сообществ микроорганизмов, в основе которых лежали трофические отношения. В палеонтологической летописи Земли сохранилось не много фоссилизированных остатков древних цианобактерии. Ископаемые остатки цианобактериальных сообществ - строматолитов обнаружива 14 ются в сланцах серии Фиг-Три (Южная Африка), в геологических отложения Варравуна (Австралия). Возраст этих ископаемых остатков составляет 3,1-3,5 млрд лет. Эти древние прокариотные сообщества, процветавшие в докембрии во внутриконтинентальных водоёмах, сформировали первую биосферу с устойчивым круговоротом биогенных элементов (Заварзин, 1997). Современные циано-бактериальные сообщества или, по современной терминологии циано-бактериальные маты, мало изменились в течение истории Земли и поэтому их можно рассматривать как реликтовые. Реликтовые прокариотные сообщества полноценны и устойчивы, что подтверждается временем их существования в геологической истории.
Циано-бактериальные маты представляют собой строго морфологически оформленные сообщества разнородных организмов. Тесные взаимодействия и контакт трофических групп микроорганизмов в цианобактериальных матах позволяет рассматривать их как место возникновения первых симбиотических взаимоотношений между организмами. В этих сообществах, как и в современных симбиотических системах, высока вероятность горизонтального генетического обмена между партнёрами. Экология циано-бактериальных сообществ подробно освещена в работах Г.А. Заварзина с сотрудниками (Заварзин, 1990а, 1993; Заварзин и др. 1999). Авторы рассматривают эти сообщества как центры происхождения наземной грамотрицательной микрофлоры. В этих работах показано, что грамотрицательные бактерии, большинство которых в современной классификации объединены в класс Proteobacteria, составляют окружение центрального ядра из цианобактерий и разлагающих их некромассу организмов.
Возникновение симбиотических связей в древних циано-бактериальных сообществах привело к новому направлению эволюции - «организм — консор-ция — симбиоз — организм», обусловило возникновение ряда новых форм жизни и новых типов экологических взаимоотношений. Например, большую популярность приобрела в настоящее время теория симбиогенного происхождения эукариотической клетки. Сторонники «теории серийных симбиозов» (Margulis, 1970, 1996; Sogin, 1991; Zerges, 2002) полагают, что эукариотическая клетка возникла в результате интеграции организмов, близких к археям, с различными бактериями, которые дали начало митохондриям (а-протеобактерии) и пластидам (цианобактерии). Предпосылкой для возникновения внутриклеточных симбиозов, может являться сохранившийся у некоторых современных одноклеточных организмов голозойный тип питания. Древние жгутиконосцы с голозойным типом питания захватывали цианобактерии как добычу. Однако, в силу стечения благоприятных обстоятельств, цианобактериям удавалось не только сохраниться внутри клеток хозяина в неповреждённом виде, но, вступив в симбиотические отношения, превратиться в органеллы - цианеллы (цианопла-сты). Примером подобного эндосимбиоза являются хлоропласты жгутиконосцев (Cyanophora paradoxa). Клетки эндосимбионта, цианобактерии из рода Chroococcus, под влиянием симбиотического образа жизни несколько изменяются. Это выражается главным образом в редукции клеточной стенки: вместо четырёхслойной она становится двухслойной. Цианобактерии принимают на себя функции хлоропластов, но ими не становятся. В пользу последнего свидетельствует существенная разница в организации цианелл и пластид. Цианеллы характеризуются концентрическими тилакоидами, муреиновой клеточной стенкой, отсутствием хлорофилла b (Kurgens, 2002). Деление цианелл, как и сво-бодноживущих цианобактерии, осуществляется путём перетяжки пополам. Оно автономно и не приурочено к периоду размножения клетки-хозяина. В лабораторных условиях в специально подобранной питательной среде цианеллы ведут себя как самостоятельные организмы - они успешно растут и размножаются. В цианеллах обнаружено около 70 генов, отсутствующих в пластидах высших растений (Loffelhardt, Bohnert, 2002), а для общих генов выявлена архаичная структура, позволившая поместить цианеллы в основания филогенетического древа пластид (Martin et al., 1998, 2002).
Топография микроорганизмов в биогеоценозах на выработанных торфяниках
Некоторые авторы рекомендуют проводить стерилизацию с последовательным использованием ряда стерилизующих растворов. Оптимальные для конкретного растительного объекта реагент, его концентрация и время экспозиции подбираются экспериментально. В любом случае после стерилизации материал многократно промывают стерильной водой. Для выделения микроорганизмов эндоризосферы используют один из трёх основных способов: - высев механически разрушенных корней на питательные среды - инкубация фрагментов корня на питательных средах - инкубация растительного материала во влажных камерах.
Выбор состава питательной среды производится в каждом случае в зависимости от конкретных задач. Выделять таким образом внутрикорневые формы азотфиксирующих бактерий, Д. Доберайнер предложила, помещая отмытые водой корни на питательную среду с малатом в качестве источника углерода (Do-bereiner, Day, 1976). Аналогичный способ использовался для выделения из корней и листьев кукурузы эндофитных актиномицетов на крахмало-казеиновой среде (De Araujo et al., 2000).
Экспериментальные модели для выделения бактерий из ризосферы. В исследованиях микроорганизмов прикорневой зоны первоначальный интерес исследователей был направлен на диазотрофные бактерии, в связи с перспективой их практического использования. В результате попытки разработать стандартную методику выделения ассоциированных с корневой зоной диазотрофных бактерий, была предложена методика, получившая название "модель спермато-сферы" (Thomas-Bauzon et al., 1982). Авторы исходили из того, что растение осуществляет своеобразную селекцию бактерий на своих корнях. Следовательно, проблема сводится к тому, чтобы правильно выделить отселектированные растением популяции, которые находятся вблизи корней или на/в корнях растений. С этой целью авторы предлагают применять ряд предварительных процедур обработки корней, включая поверхностную стерилизацию корней с последующим высевом смывов или гомогенатов на ряд селективных питательных сред. Чистые культуры бактерий выделяют из 4-5-го разведений, а их нитроге-назная активность регистрируется ацетиленовым методом в тех же пробирках, где производится количественный учёт бактерий.
Физиологическую активность изолятов многие авторы связывают с зоной корня, из которой они выделены. Для последовательного выделения диазотроф-ных ассоциативных бактерий из различных зон корня (ризосферы, ризопланы и гистосферы) на базе описанного подхода была разработана оригинальная методика, основанная на выделении бактерий по определённой схеме на различных селективных средах из смывов с поверхности и внутренних тканей органов (Чумаков, 2005). При разработке схемы автор исходил из того, что в системе "растение - ассоциированные бактерии" в почве различные микроорганизмы будут занимать вполне определённые экологические ниши по отношению к корню, в зависимости от способности использовать растительные выделения, энергии роста, отношения к кислороду, способности продуцировать вещества, подавляющие рост других микроорганизмов и т.д. В соответствии с набором этих качеств микроорганизмы локализуются на различном расстоянии от корня. Схема предполагает последовательное выделение микроорганизмов - от удалённых от корня на 1-2 мм и потому трофически и физически относительно слабо связанных с ним популяций до форм, развивающихся непосредственно на/в корнях, и функции которых тесно связаны с физиологией растения.
Большое значение при использовании данной схемы придаётся стандартизации условий выделения, в частности, выращиванию растений и времени проведения анализа при выделении бактерий. Например, поскольку зерновка пшеницы переключается на фототрофное питание и изменяет спектр корневых выделений на 10-12-й день после начала прорастания, приступать к выделению ассоциативных бактерий автор рекомендует не ранее, чем через две недели после прорастания зерновки. При всей простоте и привлекательности данный подход не лишён недостатков. В частности, выращивать растения целесообразнее, видимо, в природной обстановке (или приближенной к ней) и выделять бактерии, занявшие сайты связывания корня в результате естественной конкуренции. А в описанных моделях конкуренция ослаблена или исключена полностью благодаря тому, что семена перед проращиванием стерилизовались.
В селекции штаммов по признакам, связанным со стимуляцией развития растений, большое значение имеет наличие у бактерий способности активно колонизировать корни. Разработке и применению эффективных методик выделения ризобактерий, сочетающих высокую активность колонизации корней с ин-гибированием роста фитопатогенных грибов, посвящены работы, выполненные во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН. Авторами предложен метод активной селекции, обеспечивающий высокую комплементарность к корням растения-хозяина (Кравченко и др., 2002). Его суть заключается в следующем. Стерильные проростки пшеницы, редиса, томата с длиной корня около 1 см помещают в чашки Петри на поверхность 0,6% водного раствора агара "Dif-со" и инкубируют в темноте 16 часов при 24 С. За это время корневые экссудаты успевают диффундировать в слой агара. Затем узкие полоски почвы наносят с двух сторон параллельно корню на расстоянии 1-2 см. Почвенные микроорганизмы мигрируют по поверхности агара по направлению к источнику питания -корневым выделениям. Всю систему инкубируют в течение 24 час при 28С, после чего почву с частью агара удаляют из чашки, а корень продолжает расти в течение 3-4-х суток. Для изоляции бактерий с корней авторы рекомендуют использовать жидкую картофельную среду и картофельный агар. Отмечено, что методика «активной селекции» существенно повышает выход популяции штаммов с высокой колонизирующей способностью. Её использование позволило авторам выделить из почв и минерального тепличного субстрата ризобактерий, обладающие активным хемотаксисом по отношению к корневым выделениями огурцов и томатов, способные при развитии в ризосфере снижать уровень поражения растений фитопатогенными грибами (Кравченко и др., 2003).
Описанные и аналогичные методы обычно используются для решения задач, связанных с изучением таксономической структуры ризосферных комплексов микроорганизмов, т.к. позволяют выделять микрофлору прикорневой зоны в чистую культуру для последующего изучения. Они приемлемы также для количественного учёта, но не позволяют изучать микроорганизмы непосредственно на корнях растений.
Прямые методы исследования ризосферы. Решение некоторых специфических задач, например, изучение динамики численности бактерий в непосредственной близости от корня, локализация микроорганизмов на поверхности корней in situ, возможно при помощи прямых методов, которые хронологически первыми были предложены для исследования микроорганизмов прикорневой зоны растений. Первое сообщение о присутствии микроорганизмов на поверхности корневых волосков появилось в 1932 году (Thom, 1932). В дальнейшем были предложены различные способы изучения микроорганизмов ризосферы с помощью окрашивания препаратов корней, либо стёкол обрастания Холодного - Росси (Choldny, 1930). В случае использования стёкол обрастания при высеве семян в почву помещают стеклянные пластинки, так, чтобы корешки росли вдоль их поверхности. Спустя определённое время пластинки извлекают, окрашивают и микроскопируют.
Сортовая специфичность заселения корней микроорганизмами при искусственной инокуляции
Существенное снижение плотности актиномицетов в зоне корневых выделений под воздействием стресса находится в соответствии с представлениями о реализации многими их представителями К-тактики в условиях жесткой конкуренции (Калакуцкий, Шарая, 1990). В борьбе за экскретируемые корнями низкомолекулярные соединения, способные к выделению экзогидролаз и усвоению труднодоступных растительных полимеров актиномицеты значительно уступают другим ризосферным микроорганизмам.
Сорта клевера в порядке снижения численности актиномицетных комплексов ризопланы располагались в следующей последовательности: Кудес-ник Ратибор Трио. Обилие мицелиальных прокариот в прикорневой зоне тет-раплоидного сорта Кудесник достоверно выше, чем в зоне корней диплоидного сорта Трио. Принимая во внимание, что условия роста растений всех сортов в вегетационном опыте были достаточно выровненными, причиной выявленных различий могли являться особенности качественного и количественного состава корневых выделений генотипически различных растений.
В заселении актиномицетами прикорневой зоны клевера под воздействием кислотного стресса наблюдалось резкое изменение соотношения между численностью мицелиальных прокариот в ризоплане и в ризосфере растений. В условиях известкованной почвы более высокая плотность актиномицетов была локализована в ризоплане, и этот показатель изменялся по сортам от 1,9 (Трио) до 5,3 (Ратибор). У выращенных на кислой почве кислотоустойчивых сортов Трио и Кудесник соотношение снизилось почти до 1,0, а у более чувствительного к стрессу клевера Ратибор - до 0,94 по сравнению с известкованным фоном. Сортовые различия в перераспределении плотности актиномицетов в системе ризосфера-ризоплана под воздействием стресса могут объясняться различиями в стимуляции алюминием корневой экскреции у чувствительных и устойчивых к нему генотипов (Yang et al., 2000).
Наряду с варьированием показателя численности актиномицетов, наблюдали изменения по сортам и фонам почвы и в разнообразии комплексов ассоциированных с корнями клевера мицелиальных прокариот. Комплекс актиномицетов ризосферной почвы был представлен видами родов Streptomyces, Micromonospora и родов, традиционно называемых редкими. В комплексе актиномицетов ризопланы клевера лугового обнаружены представители только рода Streptomyces.
Общее актиномицетное разнообразие оказалось выше в ризосферных комплексах растений с известкованной почвы (Н=1,30), чем растений с почвы кислой (Н=0,63), что согласуется с представлением об актиномицетах,как организмах, в большинстве своем являющихся нейтрофилами (The Prokaryotes, 1991).
На известкованном фоне между показателями обилия и разнообразия комплексов мицелиальных прокариот как в ризосфере, так и в ризоплане растений имела место прямая зависимость. Максимальные значения индекса Шеннона, как и показателя численности актиномцетов, зарегистрированы в прикорневой зоне сорта Кудесник (табл. 22).
Под воздействием кислотного стресса характер связи между показателями обилия и разнообразия в комплексе ризосферной почвы поменялся на противоположный. Более высокое разнообразие в этих условиях имел комплекс актиномицетов, ассоциированных с корнями клевера Трио, который характеризовался среди исследованных сортов минимальной плотностью заселения корней мицелиальными прокариотами. В среднем по сортам актиномицетное разнообразие комплекса ризопланы клевера на кислой почве (Н=1,44) превышало аналогичный показатель для почвы известкованной (Н=0,81) . Результаты дисперсионного анализа значений индекса Шеннона подтверждают, что актиномицетное разнообразие в ризоплане клевера достоверно зависит от фактора кислотности почвы (F=12,22; р 0,0044).
Для определения функциональной структуры актиномицетных комплексов ризосферы образцы отбирали в посевах клевера лугового второго года жизни в полевом опыте Фаленской селекционной станции. Объектами исследования служили раннеспелые сорта Трио, Кудесник и позднеспелый сорт Витязь. Почва - дерново-подзолистая среднесуглинистая, сформированная на покровных суглинках, характеризовалась следующими показателями: рН 3,92; обменная кислотность 1,82 мг-экв/100 г; алюминий 12,56 мг/100 г, подвижные формы фосфора и калия по 100 мг/кг.
Данные определения показателей обилия и разнообразия актиномицетов в ризосфере растений второго года жизни на сильно кислой дерново-подзолистой почве полевого опыта согласуются с закономерностями изменения этих показателей в зависимости от сорта и почвенного фона, обнаруженными в условиях вегетационного опыта. Порядок величин, характеризующих численность актиномицетов ризосферы клевера в условиях стресса, обусловленного повышенным содержанием ионов водорода и алюминия, был ниже (0,87-1,40x105 КОЕ/г), а оцененное с помощью индекса Шеннона разнообразие (Н= 1,54-2,19), напротив, выше, чем при менее кислой реакции почвы (табл. 29) По значениям численности актиномицетных комплексов сорта располагались в следующем порядке: Кудесник Трио Витязь. В интервале значений индекса Шеннона порядок сортов был иным: Трио Кудесник Витязь. Последовательность сортов Трио и Кудесник, таким образом, в рядах повышения численности и снижения разнообразия соответствовала установленной для них в вегетационном опыте.
В составе комплекса ризосферы клевера лугового на сильно кислой дерново-подзолистой почве присутствовали стрептомицеты, микромоноспоры и виды редких родов актиномицетов. В долевом отношении в ризосфере клевера преобладали стрептомицеты, доля микромоноспор изменялась от 6% в комплексе клевера Витязь до 17% в комплексе сорта Трио. Процентное содержание представителей других родов составило 1-9% в зависимости от сорта.
Из выделенных 30 культур стрептомицетов 20 штаммов идентифицированы до вида: 4 штамма относятся к виду S. wedmorensis, по 3 штамма к видам S. hygros copious, S. gelaticus, S. karnatakensis, no 2 штамма к видам S. omiyaensis и S. clavuligerus, оставшиеся два - S. platensis и S. violaceoruber.
Сортовая специфичность комплексов актиномицетов, связанных с корнями клевера лугового, проявилась также в особенностях их функциональной структуры. В почве, благодаря выраженной экзогидролазной активности, акти-номицеты расщепляют различные полимерные соединения, которые становятся доступными микроорганизмам других трофических блоков. Тем самым акти-номицеты участвуют в регуляции численности свободноживущих в почве клубеньковых бактерий, которые могут играть важную роль в симбиотрофном питании бобовых культур. С использованием методов фазового контраста и эпи 149 флуоресценции было показано, что между мицелием актиномицетов и микроколониями клубеньковых бактерий in situ существует тесная положительная связь, близкая к функциональной (Кожевин, 1989). Другие авторы отмечали положительный эффект (увеличение нодуляции и сухого веса проростков) от совместной инокуляции сои культурами Streptomyces griseus и Bradirhizobium japonicum при покрытии семян хитином (Li, Alexander, 1988). В результате определения характера влияния культур актиномицетов на рост клубеньковых бактерий in vitro нами были выявлены
Комплексы актиномицетов в ризосфере клевера лугового
Приживаемость оздоровленных в меристемной культуре растений в условиях in vivo, как правило, затруднена, вследствие их низкого адаптивного потенциала. Корни полученных асептически меристемных растений земляники инокулировали погружением на 24 часа в жидкую культуру метилобактерий 9 mAlg, а затем растения высаживали в стаканчики с промытым и прокалённым речным песком для адаптации к нестерильным условиям почвы. Учитывали массу и линейные размеры растений земляники спустя месяц после их перенесения в песчаную культуру (Приложение А, рис. 9А). Контролем в каждом случае служили неинокулирован-ные растения. Инокуляция штаммом 9 mAlg корней стерильно полученных растений земляники Фестивальная увеличила их биомассу и усилила развитие надземной части растений и по сравнению с контрольными растениями без инокуляции (рис. 18), что указывает на возможность использования метилобактерий для адаптации оздоровленных in vitro растений к условиям открытого грунта.
Тестирование растительных тканей на присутствие метилобактерий выявило их наличие в растениях картофеля (5,0 104кл./растение) и земляники (1,1 х104 кл./растение) во втором пассаже на питательные среды. Это свидетельствует о стабильной ассоциации бактерий с культивируемыми in vitro растениями и о возможности снабжения растений регуляторами роста и витаминами, которые продуцируют метилотрофные бактерии.
Практический успех современных клеточных и генно-инженерных технологий связан с решением проблемы регенерации растений из длительно культивируемых in vitro клеток и тканей. Многократное пассирование культуры значительно снижает её морфогенетическую способность и затрудняет получение растений-регенерантов. Снижение или полную утрату морфогеной потенции in vitro связывают, в первую очередь, с нарушением гормонального баланса (Бутенко, 1975), а также с изменением содержания в клетке других физиологически активных веществ - витаминов, ферментов, структурных белков и др.
Каллусная ткань ячменя, как и других зерновых злаков, относится к числу наиболее сложных объектов в отношении регенерации растений. Известно, что одним из главных факторов, влияющих на процессы первичного каллусогенеза, индукцию морфогенеза и последующую регенерацию побегов и корней является количественное соотношение эндогенных ауксинов и цитокининов (Skoog, Miller, 1957). В связи с этим предполагалось, что инокуляция каллуса метилотрофами, которые способны продуцировать ауксины, а возможно и другие физиологически активные вещества, окажет непосредственное влияние на рост каллуса и формирование морфогенетических структур, изменяя баланс эндогенных фитогормонов в каллусной ткани. Действительно, в результате инокуляции метилотрофными бактериями неморфогенной каллусной ткани ячменя сорта Новичок темпы её роста на среде без ауксина возрастали . Так, прирост массы за 30 дней инокулированного штаммом 9 mAlg каллуса составил 331 ±25,2 мг, инокулированного штаммом 201 66 мт - 255 ±25,2 мг, тогда как в контрольном варианте -207±25,2 мг, т.е. был ниже на 23-30%.
В каллусной культуре ячменя Новичок инокуляция штаммами 9MAlg и 15 MAlg способствовала морфогенезу, главным образом, на средах с неполным гормональным составом (приложение А, рис. 10, 1 и 2). Так, исключение из состава среды цитокинина в сочетании с ауксином или только цитокинина полностью подавляло регенерационный потенциал каллусной ткани в контроле (рис. 19).
Эффективность морфогенеза в каллусной культуре ячменя Новичок в зависимости от инокуляции метилобактериями на различных средах : А - полная среда, В - среда без витаминов, D1 -среда без кинетина, D2 - среда без кинетина и ИУК
После инокуляции метилотрофными бактериями на 10-й день наблюдали инициацию побегообразования на среде без кинетина и ИУК у 10-20% каллусных линий, а на среде без кинетина - у 15-30% каллусов ячменя в зависимости от штамма инокулянта. На безвитаминной среде количество регенерантов при ино 202 куляции увеличивалось постепенно, изменяясь от 5% на 10-й день до 15% на 60-й день наблюдений.
Влияние метилобактерий на морфогенез наблюдали также в каллусных культурах ячменя сортов Челябинский-99 и Крона (приложение А. Рис.А10, 3 и 4). В экспериментах использовали как среды с полным составом - среда А (минеральные соли, сахароза, фитогормоны, витамины), так и среды с поочерёдным исключением одного из компонентов - ауксина (среда В), всех фитогормонов (среда С) или витаминов (среда D). Исключение из состава среды ИУК (среда В) подавляло активность морфогенеза в каллусной ткани обоих сортов: количество образуемых корней снизилось в 3,0-3,8 раза, побегов - в 1,7 раза (табл. 46). Отсутствие в среде ауксина полностью компенсировалось в результате инокуляции каллусной ткани сорта Челябинский 99 штаммами 66 мт, РСт, 51мсп и сорта Крона штаммами Тр 2 и Тр 3: количество корней и побегов на один каллус достоверно (Р 099) увеличилось по сравнению с неинокулированным контролем, а количество корней в большинстве случаев (исключая штамм Тр 3) даже превысило в 1,7-4,5 раза количество корней, зарегистрированных на среде полного состава.
В тех же условиях инокуляция штаммами 60 мр и 50 мр не оказала заместительного действия на каллусную культуру ячменя Челябинский 99. Количество корней по сравнению с контролем в обоих случаях существенно не изменилось, а количество побегов под воздействием одного из штаммов (50 мр) хотя и возросло, но не достигло значения, отмеченного на полной среде (3,2±0,80 побег/каллус).
Согласно теории гормональной регуляции Скуга и Миллера (Skoog, Miller, 1957), морфогенетические потенции каллусных тканей могут реализовываться в соответствии с гормональным статусом в сторону корневого, стеблевого или, при определённом соотношении ауксинов и цитокининов, того и другого морфогенеза одновременно. Для индукции стеблевого морфогенеза уровень ауксина необходим меньший, чем для развития процессов корнеобразования.
Похожие диссертации на Изучение микробного потенциала фитосферы растений для использования в сельскохозяйственной биотехнологии
