Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из центральных проблем медицинской микробиологии, имеющей теоретическое и практическое значение, является разработка новых методов диагностики и дифференциации возбудителей бактериальных инфекций, позволяющих устанавливать источник инфекции, изучить механизмы и пути передачи, ре-ячряуярч к арсяг!^ ргсгфострйноиин иоабудитопой. Использование OV-тинных методов диагностики и типирования возбудителей, основанных на выявлении фенотипических признаков, часто неэффективно, в связи с существованием огромного количества штаммов различных видов возбудителей, обладающих высокой степенью фенотипического и генотипического родства, но характеризующихся различной эпидемиологической значимостью. Создание современных методов призвано обеспечить эффективность лабораторной диагностики и типирования возбудителей бактериальных инфекций и, тем самым, создать возможности осуществлять оценку широты распространения инфекции и выявлять изменения в характере развития эпидемического процесса. Достижения молекулярной биологии и генной инженерии позволяют разработать подходы, с помощью которых представляется возможным оценить генетическое разнообразие, устанавливать степень родства и выявлять индивидуальные особенности организма при анализе структуры ДНК. Как известно, в последнее десятилетие исследования геномного полиморфизма позволили решить ряд фундаментальных и прик-падных проблем генетики человека, популяционной генетики, осу-дествлять анализ родословной, идентификации личности, определения чистоты линий и т.д. Указанные данные шились предпосылкой для использования молекулярно-генетических подходов в микробиологии л эпидемиологии бактериальных инфекций. Обусловлено это необходимостью выяснения генетической структуры популяций возбудителей бактериальных инфекций, выявления генетического родства между
2.
эпидемическими и неэпидемическими вариантами возбудителя, расшифровкой механизмов появления, формирования и распространена эпидемических штаммов, маркирования и определения ареалов распространения наиболее значимых в патологии человека штаммов. Результаты такого рода исследований важны для разработки научно-обоснованных противоэпидемических мероприятий в борьбе с бактериальным» инфекциями.
Цель работы - изучение методами геномной дактилоскопии взаимосвязей между эпидемически значимыми и неэпидемическими формам» возбудителей бактериальных инфекций и оценка их потенциала в решении ряда фундаментальных и прикладных проблем микробиологии и эпидемиологии.
Основные задачи:
-
Расшифровать механизмы появления и формирования эпидемически значимых штаммов в очаге инфекции в разные эпидемические периоды.
-
Исследовать генетические связи между штаммами различной эпидемиологической значимости.
3.Изучить возможные механизмы появления, формирования и распространения эпидемически значимых штаммов возбудителей внутри-больничных инфекций.
-
Разработать принципы и схемы генетического типирования возбудителей бактериальных инфекций для решения различных проблем инфектологии.
-
Разработать экспресс-методы индикации и типирования возбудителей на . основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) (на модели возбудителя туберкулеза), позволяющих идентифицировать и дифференцировать возбудителей непосредственно в клиническом материале.
Научная новизна.
3.
Впервые исследован геномный полиморфизм возбудителей бакто-иальных инфекций, характеризующихся различной эпидоииологичоскои начимостью, типами паразитизма, разными механизмами передачи и езервуарами инфекции.
Выявлены общие и специфические закономерности генотипической труктуры представителей эпидемически значимой части популяиии v
йяпиимыу ^ия~— "аТОГСіііНУЛ КИКВОООГаНИ.чиоп,
- Впервые установлено, что с помощью молекулярно-генетических
одходов эпидемически значимые представители популяции возбуди-
влей бактериальных инфекций разделяются на следующие группы:
-
эпидемически значимые штаммы, имеющие высокую степень гено-ипического родства независимо от места, времени и источника их ііделенил. Типичными представителями данной группы являются воэ-/дители сапронозов (холеры, легионеллеза, лептоспироза);
-
эпидемически значимые штаммы, имеющие высокую степень генетического родства в пределах определенного региона. Предстаеи-глями этой группы являются возбудители дизентерии - штаммы . f lexneri;
-
эпидемически значимые штаммы, имеющие высокую степень гено-іпического родства в пределах региона с повышенным уровнем яяЛл-!ваеиости, а в регионах с спорадической заболеваемостью - генетически разнообразные, то есть поликлональные. К этой группе носится возбудителе туберкулеза - бактерии вида М. tuberculo-із; .
-
эпидемически значимые штаммы, не имеющие клонального проис-їждения, и принадлежащие к различным стенотипическим вариантам юликлональность эпидемических штаммов). К этой группе относятся збудители внутрибольничных инфекций - штаммы К.pneumoniae и S. ireus.
- Впервые показано,.что методы генетического типирования поз->ляют решать следующие задачи:
4. 1) осуществлять региональное картирование штаммов, а следовательно, проводить мониторинг ареалов распространения зпидемическі значимых штаммов возбудителей (на модели возбудителя дизентерии S. flexneri),
-
дифференцировать эпидемические формы от неэпидемически (штаммы видов V. cholerae, L.pneumophila, родов Leptospira, Fran сі sella),
-
осуществлять контроль микробных коллекций с целью подт верждения или исключения новых под- или видовых статусов микроор ганизмов (на модели возбудителей лептослироза - штаммах L. inter rogans).
Впервые при мониторинге очага холерной инфекции установлено что генотипически полиморфная часть популяции холерных вибрионов не имеющих эпидемиологической значимости, не может быть источни ком формирования эпидемически значимых, патогенных, штаммов воз будителя за счет генетической передачи в природных очагах инфек ции генов факторов патогенности.
Впервые* с помощью микробиологического, эпидемиологическог и молекулярно-генетического мониторинга установлено, что условне патогенные микроорганизмы циркулирующие в стационарах (госпиталь ные штаммы) генотипически неоднородны; из генотипически различай щихся госпитальных вариантов условно-патогенных микроорганизме не все способны вызывать вспышку госпитальной инфекции.
Впервые получены прямые доказательства, что в основе возни» новения госпитальных вспышек лежат 2 механизма: 1) занос зпидемі чески значимого штамма .извне и 2) формирование эпидемического ві рианта в стационаре за счет генетической передачи плазмид вир: лентности и антибиотикоустойчивости в циркулирующие в стационар) штаммы определенных генотипических вариантов.
Впервые разработана методика генетического тилирования штаї мое М.tuberculosis на основе полимерааной цепной реакции, позе
5.
іяющая дифференцировать возбудитель непосредственно в диагности-іеском материале.
- Сравнительные результаты эффективности различных методов ис-
ледования геномного полиморфизма позволили установить для каждо-
о из изученных видов возбудителей наиболее эффективные методы
еметического типироваиия, разработать принципы и оптимальные
,;,иш ііікєїИчнопгп ти"ирс^-цил DйаЗуДИI оЛей ііаківпияпі.ио« ,.,.*-;-
;ип для решения цепого ряда задач микробиологии и эпидемиологии.
- Показано, что наиболее репрезентативными из методов исследо-
анип геномного полиморфизма возбудителей бактериальных инфекций
вляются использование в качестве зонда ДНК фага М13 и ПЦР-гене-
ическое типирование на основе амплификации гена или специфичес-
ой последовательности и анализа полиморфизма длины фрагментов
естрикции (ПДФР).
Практическая значимость работы.
Разработанные принципы и схемы генетического типироваиия воэ-
удителей бактериальных инфекций могут использоваться в эпидемио-
огии и микробиологии для решения разнообразных актуальных задач:
. дифференциации штаммов возбудителей, характеризующихся различ-
ой эпидемиологической значиность», 2. выявления источника инфек-
ии, 3. мониторинга эпидемиологического благополучия на твррито-
иях и в стационарах, 4. регионального картирования возбудителей
нфекций, 5. разработки и использования новых вариантов генети-
еского типирования. .
Впервые полученные "фингорпринты"(дактилограммы) могут служить тандартами при исследовании геномного полиморфизма возбудителей актериальных инфекций в практических и научных целях.
По материалам диссертации разработаны методические рвкоменда-ии, утвержденные МЗ СССР (1986 и 1990 г.):.а). Методические ре-
6.
комендации по определению токсигенности штаммов холерного вибрио на и энтеропатогенной кишечной палочки иммуноферментным методої (соавт. Степанова М.В., Осауленко О.В., Вейде А.А., Вертиев Ю.В. б) Определение генетических связей штаммов холерных вибрионої различного происхождения методом геномной дактилоскопии (соавт, Токарская О.Н., Грижебовский Г.М., Брюханов А.Ф., Рысков А.П., Гинцбург А.Л.).
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены: на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы микробиологии, лабораторной диагностики и профилактики холеры" (Саратов, 1988), Всесоюзной конференции "Бактериальные плазмиды" (Нальчик, 1990), Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов (Москва, 1990), на YII Европейской и IX Всесоюзной конференции по леп-тоспирозам (СССР,Москва, 1991), Международной конференции "Медицина чрезвычайных ситуаций" (Болгария, София, 1991), 7 Европейском совещании по болезням легионеров (Греция, Haniotis-Halkidiki, 1992), 7 Республиканском конгрессе "Инфекционные и паразитарные болезни (Болгария, Велинград, 1992), совместном заседании проблемных комиссий "Медицинская микробиология" и "Генетика и молекулярная биология бактерий" (Москва, 1993), международном семинаре по улучшению качества вакцины БЦЖ (Москва, 1994), Российской научной конференции "Персистенция микроорганизмов" (Оренбург, 1994), а также научных конференциях отдела генетики и молекулярной биологии бактерий (1990, 1993). Фрагменты работы отмечены 1-ми премиями на конкурсах научных работ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи (1990, 1991).
Диссертация апробирована на совместной конференции отделов генетики и молекулярной биологии бактерий, медицинской микробиологии и эпидемиологии НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН 21 марта 1995 г.
7.
протокол N 3).
Публикации, о теме диссертации опубликованы 33 работы (см.список), 2 мето-ических материала (инструкции), получены 2 авторских свиде-ельства.
Структура и объем диссертации.
