Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Характеристика аноксигенных фототрофов 9
1.1. Зеленые серобактерии 9
1.2. Зеленые нитчатые бактерии 10
1.3. Гелиобактерии 11
1.4. Пурпурные серобактерии 12
1.5. Пурпурные несерные бактерии 13
1.6. Аэробные бактериохлорофилл я-содержащие бактерии 24
Глава 2. STRONG Способность нсп и абс использовать переменно-валентные металлы (металлоиды) 36
Экспериментальная часть STRONG
Глава 3. Материалы и методы исследования 39
3.1. Объекты исследований 39
3.2. Методы полевых исследований 39
3.3. Методы лабораторных исследований 39
3.3.1. Методы выделения и культивирования 39
3.3.2. Методы изучения морфологии и ультратонкого строения клеток 40
3.3.3. Методы изучения пигментного состава клеток 40
3.3.4. Методы изучения ростовых параметров и физиологических свойств 41
3.3.5. Методы изучения состава жирных кислот 42
3.3.6. Методы определения способности к фотосинтезу 42
3.3.7. Методы изучения отношения ктеллуриту и селениту 44
3.3.8. Методы генетических исследований 44
Результаты и обсуждение
Глава 4. Характеристика исследованных щелочных водоемов 47
4.1. Содовые озера 47
4.1.1. Озеро Моно Лейк (Калифорния, США) 47
4.1.2. Озера Баргузинской долины (Бурятия) и Забайкалья 49
4.2. Термальные источники 51
4.3. Распространение АБС и факультативно аэробных НПБ в содовых озерах и щелочных термальных источниках 56
Глава 5. Характеристика новых микроорганизмов 59
5.1. АБС слабоминерализованных щелочных водных экосистем 59
5.1.1. Новые штаммы Porphyrobacter donghaensis 59
5.1.2. Новые виды рода Roseococcus 65
5.1.2. і. Новый вид АБС "Roseococcus suduntuyensis " sp. nov 65
5.1.2.2. Новый вид АБС "Roseococcus vulkanoes " sp. nov 72
5.2. АБС среднеминерализованных содовых озер. Новые виды рода Roseinatronobacter 74
5.2.1. Характеристика нового вида АБС "Roseinatronobacter monicus" sp.nov 74
5.2.2. Характеристика нового вида АБС "Roseinatronobacter doroninskoensis " sp.nov 84
5.3. Фотосинтетическая активность и компоненты электронного транспорта у аэробной бактериохлорофилл а-содержащей бактерии Roseinatronobacter thiooxidans 85
Глава 6. Новые алкалофильные факультативно аэробные НПБ 95
6.1. Характеристика новой несерной пурпурной бактерии "Rhodobaca barguzinensis " sp. nov 95
6.2. Новая алкалофильная несерная пурпурная бактерия "Rubribacter polymorphus " gen. nov., sp. nov 107
Глава 7. Способность нсп и абс использовать переменно-валентные металлы (металлоиды) 117
Заключение 123
Выводы 127
Литература 128
- Аэробные бактериохлорофилл я-содержащие бактерии
- Методы изучения ростовых параметров и физиологических свойств
- Распространение АБС и факультативно аэробных НПБ в содовых озерах и щелочных термальных источниках
- Фотосинтетическая активность и компоненты электронного транспорта у аэробной бактериохлорофилл а-содержащей бактерии Roseinatronobacter thiooxidans
Введение к работе
Актуальность работы: Аноксигенные фототрофные бактерии (АФБ) представляют собой филогенетически разнородную группу микроорганизмов, содержащих несколько типов хлорофиллов, которые принято называть бактериохлорофиллами. К настоящему времени известны бактериохлорофиллы а, Ъ, с d, е, g, отличающиеся от хлорофилла а незначительными заменами в боковых радикалах магний-порфиринового кольца. Фотосинтез АФБ отличается от фотосинтеза цианобактерий, водорослей и высших растений тем, что вода не может служить донором электронов и кислород не образуется в процессе фотосинтеза. Фотоассимиляция СОг происходит при участии только одной фотосистемы и зависит от использования внешних доноров электронов, таких как восстановленные соединения серы, молекулярный водород или органические соединения. АФБ подразделяют на следующие филогенетические группы: зеленые серобактерии; зеленые нитчатые (несерные) бактерии; гелиобактерии; серные пурпурные бактерии; несерные пурпурные бактерии; аэробные бактериохлорофилл а-содержащие бактерии (АБС). Представители этих групп различны по морфологии, цитологии, пигментному составу и физиологии.
Для первых пяти групп АФБ, которые являются анаэробами, фотосинтез - основной тип метаболизма. Аэробные бактериохлорофилл а-содержащие бактерии (АБС) принципиально отличаются от типичных АФБ тем, что для них респираторный метаболизм является главным энергетическим процессом, а фотосинтез вторичен и дает не более 10-50 % дополнительной энергии (Beatty, 2002). Важно отметить, что доказательства протекания аноксигенного фотосинтеза представлены лишь для немногих из описанных видов АБС (Harashima et al, 1982; Wakao et al., 1996). В настоящее время известно свыше 30 родов АБС, большинство из которых принадлежат альфа-подгруппе Протеобактерий. Лишь один вид принадлежит к бета-Протеобактериям и один к гамма-Протеобактериям.
Существует мнение, что АБС являются промежуточным звеном между пурпурными бактериями и аэробными хемотрофными бактериями. Таким образом, способность к альтернативному аэробному хемотрофному метаболизму у несерных пурпурных бактерий (НПБ) можно рассматривать как эволюционный этап на пути образования облигатно аэробных бактерий.
За последнее время было установлено, что АБС широко распространены в воде аэробной зоны морей и мирового океана, составляя от 11 до 16 % от общего числа бактерий. Таким
образом, можно предположить, что АБС играют заметную роль в круговороте углерода в планетарном масштабе.
Ранее было показано, что содовые озера содержат различные группы АФБ, представленные новыми видами и родами пурпурных серобактерий и гелиобактерий. Все они приспособлены к жизни при высоких значениях рН, а многие являются натронофилами или галоалкалофилами (Брянцева, 2000). Экология и разнообразие АБС в эпиконтинентальных содовых озерах была практически не изучена. К моменту начала наших работ был описан лишь один род и вид алкалофильных АБС Roseinatronobacter thiooxidans (Сорокин и др., 2000). Этот вид оказался филогенетически близок к тогда единственной известной алкалофильной несерной пурпурной бактерии Rhodobaca bogoriensis (Milford et al., 2000). Очевидно, что изучение разнообразия АБС в щелочных местообитаниях, а также исследование свойств новых алкалофильных представителей АБС и факультативно аэробных НПБ даст возможность прояснить пути эволюции прокариотных микроорганизмов и таких важнейших энергетических процессов, как фотосинтез и дыхание.
Целью настоящей работы являлось сравнительное изучение распространения, филогенетического положения, способности к фотосинтезу и других особенностей физиологии у аноксигенных фототрофов АБС и факультативно аэробных НПБ, обитающих в содовых озерах и щелочных термальных источниках.
В связи с этим перед нами были поставлены следующие задачи:
Изучить распространение аноксигенных АБС и НПБ, способных к аэробному росту, и их приспособленность к жизни в различных щелочных местообитаниях: содовых озерах и гидротермах.
Выделить чистые культуры новых штаммов АБС и факультативно аэробных НПБ, исследовать их физиолого-биохимические признаки, таксономическое и филогенетическое положение.
Определить способность к фотосинтетическому переносу электронов у алкалофильных АБС. Изучить основные компоненты электронно-транспортной цепи, участвующие в фотосинтезе и дыхании у типового вида алкалофильной АБС Roseinatronobacter thiooxidans.
Провести сравнительное исследование морфо-физиологических свойств у филогенетически близких алкалофильных видов АБС и факультативно аэробных НПБ с целью подтверждения их эволюционного родства.
5. Выявить способность к восстановлению солей теллура и селена аэробными бактериохлорофилл «-содержащими бактериями и несерными пурпурными бактериями.
Последняя задача была поставлена в связи с недавним открытием способности некоторых нейтрофильных АБС к восстановлению солей токсичных металлоидов до их элементного состояния (Yurkov & Csotonyi, 2003).
Научная новизна. Результаты проведенных исследований расширяют представления о видовом и функциональном разнообразии АБС и НПБ бактерий в щелочных местообитаниях. Выделены и идентифицированы новые алкалофильные виды АБС - "Roseinatronobacter monicus" sp. nov., "Roseinatronobacter doroninskoensis" sp. nov, "Roseococcus suduntuyensis" sp. nov., "Roseococcus vulkanoes" sp. nov. и НПБ - "Rhodobaca barguzinensis" sp. nov., "Rubribacter polymorphus" gen. nov., sp. nov. Обнаружены новые экотипы АБС Porphyrobacter donghaensis из слабоминерализованного содового озера и термального щелочного источника. Этот вид ранее считался морским. Получены новые доказательства филогенетического родства АБС и факультативно аэробных НПБ. Впервые установлена фотосинтетическая активность и изучены компоненты фотосинтетической и дыхательной электронно-транспортной цепи у алкалофильных аэробных бактериохлорофилл я-содержащих бактерий.
Практическая значимость. Показано широкое распространение АФБ в содовых озерах, что позволяет говорить об их существенной роли в круговороте углерода в этих экстремальных экосистемах. Установлена способность к восстановлению солей теллура и селена исследованными аэробными бактериохлорофилл а-содержащими бактериями и несерными пурпурными бактериями, что делает их привлекательным объектом для использования в биоремедиации щелочных минерализованных промышленных сточных вод и в биометаллургии.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих научных конференциях: Международная конференция «Водные экосистемы, организмы, инновации» (Москва, 2005); Международная конференция «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005); Ш-я Межрегиональная конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006); II Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006); The young scientists and students
international scientific conference "Modern problems of microbiology and biotechnology" (Odessa, Ukraine. 2007); 2-й Байкальский микробиологический симпозиум с международным участием (Иркутск, 2007); III Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 экспериментальные статьи и 7 тезисов, 2 статьи приняты к печати.
Место проведения работы. Работа выполнялась в Лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов (заведующий лабораторией — д.б.н., профессор В.М. Горленко) Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Анализ состава каротиноидов и пигментбелковых комплексов, фотоингибирования дыхания и состав компонентов электронно-транспортной цепи проводили совместно с д.б.н. А.А. Москаленко, д.б.н. В.А.Бойченко, М.Ф. Янюшиным и д.б.н. И.Н Стадничуком и д.б.н. Е.П. Лукашевым (Институт фундаментальных проблем биологии РАН и Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва). Молекулярно-биологическая часть работы проводилась в сотрудничестве с Туровой Т.П., Лысенко A.M., Детковой Е. (ИНМИ РАН), Колганова Т.В., Булыгиной Е.С. (Центр «Биоинженерия»).
Принятые сокращения: АФБ, аноксигенные фототрофные бактерии; АБС, аэробные бактериохлорофилл а-содержащие бактерии; НПБ, несерные пурпурные бактерии; ПСБ, пурпурные серобактерии; ЗСБ, Зеленые серобактерии; ЗНБ, Зеленые нитчатые бактерии; Бхл, бактериохлорофилл; РЦ, реакционный центр; LH, свето-улавливающие (антенны) пигмент-белковые комплексы; ЭТЦ, электронтранспортная цепь; ФИД, фотоингибирование дыхания; ВЦМ, внутрицитоплазматические мембраны.
Аэробные бактериохлорофилл я-содержащие бактерии
Аэробные бактериохлорофилл «-содержащие бактерии - обширная экофизиологическая группа бактерий, оккупирующая в аэробных олиготрофных местообитаниях нишу фототрофов с аноксигенным типом фотосинтеза, во многих отношениях сходного с аноксигенным фотосинтезом НПБ (Beatty, 2002.) Для этих микроорганизмов фотосинтез является вторичным энергетическим процессом, который зависит от обязательного темнового синтеза компонентов фотосинтезирующего аппарата в аэробных темновых условиях. Периодичность освещения (день-ночь) обеспечивает эти условия в открытых частях океана, где эти микроорганизмы широко распространены и, вероятно, возникли в результате конкурентного отбора с облигатными гетеротрофами. В этом плане они имеют определенное сходство с бактериородопсин содержащими микроорганизмами, у которых бактериородопсин синтезируется аэробно в темноте, в функционирует на свету. Для аэробных бактериохлорофилл а-содержащих бактерий было предложено несколько названий, таких как «аэробные фотосинтезирующие бактерии» (Shiba, Harashima, 1986, Beatty, 2002), «аэробные аноксигеные фототрофы» (Shimada, 1995) или «аэробные аноксигенные фототрофные бактерии», «эритробактерии» (Юрков и Горленко, 199 , Yurkov and Beatty, 1998). По мнению некоторых исследователей (Imhoff and Hiraishi, 2005) эти термины вводят в заблуждение, потому что эти бактерии не фототрофы в строгом смысле, так как они не растут, расходуя только энергию света, хотя способны получать энергию за счет фотосинтеза (не более 10-50 %). Мы склоняемся к термину «аэробные бактериохлорофилл «-содержащие бактерии» или сокращенно «АБС» (Imhoff, Hiraishi, 2005).
Таксономическое разнообразие. АБС рассредоточены в классе а-Протеобактерии с одним известным представителем Р-Протеобактерии, Roseateles depolymerans (Suyama Т. et al., 1999) и единственным представителем у-Протеобактерии, Congregibacter litoralis (Fachs В.М. et al, 2007). Виды а-Протеобактерии относятся к четырем подклассам. Из горячих источников, куда входят ацидофильные и умеренно термофильные изоляты характеризуют а-1 кластер, содержащий Acidiphillium, Acisisphaera, Craurococcus, Paracraurococcus, Roseococcus, Geminicoccus и Rubritepida. Исключительно морские a-2 виды содержит Roseibium, Stappia marina и Hoeflea phototrophica. Океанический или галофильный a-3 Roseobacter кластер, включает роды Dinoroseobacter, Roseibacterium, Roseicyclus, Roseinatronobacter, Roseisalinus, Roseiviax, Roseobacter, Roseovarhis, Rubrimonas, Staleya и Thalassobacter. В a-4 кластер входят Blastomonas, Citromicrobiam, Erythrobacter, Erytromcrobium, Erytromonas, Sandaracinobacter, Sandarckinorhabdus, Porphyrobacter. Эти АБС близкородственны с несерными пурпурными родов Rodobacter и Rodovulum. Представиели АБС a-4 кластера распространены в пресноводных и морских местообитаниях.
Аэробные фототрофы не образуют гомогенные кластеры и распространены среди фотосинтезирующих и нефотосинтезирующих видов. Можно предположить, что нефотосинтезирующие протеобактерии имели фотосинтетические гены, которые были потеряны у некоторых филогенетических линий в процессе эволюции. Существует две независимые теории эволюционного происхождения аэробных фототрофных бактерий. Согласно одной из них, аэробные фототрофные бактерии являются промежуточным звеном эволюции от анаэробных пурпурных бактерий к нефотосинтезирующим аэробам. Согласно второй теории, латеральный перенос фотосинтетических генов приводит к завоеванию нефотосинтезирующих аэробов кластера фотосинтетиков. Большинство фактов свидетельствует в пользу первой гипотезы.
Местообитание. Недавно, с использованием высокочувствительной флуоресцентной спектроскопии и молекулярно генетических исследований, было показано повсеместное распространение АБС в различных частях мирового океана, в Балтийском и Черном морях. Летом содержание Roseobacter-подрбных бактерий составляет более 40 % от общего числа бактерий в Monterey Bay, 56 % тотального ДНК, выделенного из поверхностных вод Северной Атлантики и около 25 % в - Celtic Sea (Moran et al., 2003). Максимальное количество АБС в Балтийском море в мае - 12 % бактериального сообщества (0.38х 10б клеток/мл _1) (Masin et al., 2006). АБС обнаружены в водах Черного моря на глубине до 50 м (Koblizek et al., 2006).
Аэробные бактериохлорофилл а-содержащие бактерии способны колонизировать фитопланктон. От 51 до 70 % морских водорослей колонизированы АБС бактериями (Mayali et al., 2008). Это дало возможность говорить о глобальной роли АБС на Земле. По мнению Битти (Beatty, 2002) АБС возникли в океане вместе с появлением кислорода и эволюционировали под прессом его нарастающей концентрации. Бактериохлорофиллы, реагируя с кислородом, выделяют супероксидные родикалы, в частности, синглетный кислород, повреждающие клетку. АБС "научились" решать проблему детоксикации агрессивных окислителей, балансируя на лезвии ножа. Этому способствовала жесткая регуляция экспрессии гена фотосинтеза. Запускающим механизмом явился кислород, а останавливающим свет, даже малой интенсивности. Видимо АБС использовали и уже существующий у факультативно аэробных НПБ регуляторный механизм, у которых свет и кислород также оказывают регуляторную роль, направляя поток электронов в фотосинтетическую или дыхательную ЭТЦ. Однако у АБС реагируют на гораздо более низкую освещенность.
В дополнение, рядом авторов было показано, что при низких концентрациях органических субстратов АБС синтезируют наибольшее количество бактериохлорофилла на клетку. Согласно представлениям Битти (Beatty, 2002) ниша АБС может быть описано следующими терминами: хемоорганотрофы - олиготрофы, вторичные аноксигенные фотогетеротрофы.
Можно думать, что распределение по различным наземным экосистемам привело к образованию значительного физиологического разнообразия АБС, как вторичных фотосинтетиков. Кроме морей и океанов АБС выделены из почв, термальных источников, пресных и соленых озер (таблицы 7 - 11). Однако подробных исследований особенностей метаболизма большинства из выделенных из этих ниш АБС не проводилось, что крайне важно для определения границ изменчивости этой физиологической группы бактерий.
Таким образом, АБС широко распространены в различных местообитаниях и играют важную роль в цикле углерода (Koblizek et al., 2005; Koblizek et al., 2007) (Gonzalez et al., 1999). Открытие способности некоторых видов ABC окислять тиосульфат, заставляет предположить также их заметную роль в круготе серы. (Юрков и Горленко 1994; Сорокин и др., 2000; Saitoh et al., 1998). Распространение АБС в содовых озерах не изучено. Описана только одна алкалофильная бактерия Roseinatronobacter thiooxidans (Сорокин и др., 2000).
Морфология. Среди представителей АБС бактерий встречаются кокки, палочковидные клетки, клетки со стебельком, полиморфные клетки (Таблици 7 - 11). Имеются неподвижные и подвижные представители. Движение осуществляется при помощи полярных жгутиков. Размножение происходит равномерным делением. Почкование не обнаружено. Клеточная стенка грамотрицательного типа. Внутрицитоплазматические (ВЦМ) мемраны на тонких срезах клеток АБС обычно отсутствует. Однако, "хроматофороподобные" везикулярные структуры обнаружены у Rsb. denitrificans (Shiba, 1991), San. sibiricus (Yurkov,et al., 1997), Eiytrobacter sp. (Shiba, Simidu, 1982; Iba, 1988). Есть данные зависимости синтеза внутрицитоплазматических структур и бактериохлорофилла a (Iba, 1988), что указывает на вероятную роль этих структур в фотосинтезе.
Методы изучения ростовых параметров и физиологических свойств
Об отношении исследуемых штаммов к кислороду судили по расстоянию зоны роста от поверхности столбика с агаризованной средой.
Влияние рН и солености на АБС и НПБ изучали в жидкой среде. Оптимальное значение рН устанавливали, используя разные соотношения карбоната и бикарбоната натрия, сохраняя одинаковую суммарную молярную концентрацию карбонатов. Температурный оптимум и пределы развития микроорганизмов определяли с использованием градиентного термостата. Температурный оптимум и пределы развития определяли с использованием градиентного термостата.
Для определения спектра потребляемых субстратов в аэробных условиях для АБС, а так же в аэробных и анаэробных условиях для НПБ использовали минеральную среду, не содержащую органических веществ, с дрожжевым экстрактом в качестве витаминной добавки (0.01 г/л). Испытуемые вещества вносили в концентрации 1 г/л.
Относительный прирост биомассы определяли измерением оптической плотности культуры при 650 нм на фотометре КФК-3.
Изменения концентрации сульфида регистрировали колориметрически (Triiper & Schlegel, 1964). Содержание сульфата определяли нефелометрически, тиосульфат йодометрическим титрованием (Резников и др., 1970). Способность окислять тиосульфат и другие восстановленные соединения серы штаммами Roseinatronobacter проводили, измеряя дыхание отмытых клеток, при добавлении субстрата. С этой целью использовался полярограф («Yellow Spring Со», Ohio) с использованием электрода Кларка (Сорокин и др., 2000). Чувствительность к антибиотикам выявляли при аэробном росте бактерий на чашках Петри по размеру зоны отсутствия роста возле дисков, содержащих исследуемый антибиотик (Нетрусов и др., 2005).
Способность исследуемых штаммов к анаэробному росту за счет восстановления нитратов определяли по увеличению биомассы и образованию N2 и NO2- как продуктов восстановления. N2 регистрировали по объему газообразования во флаконах и NO2 -количественно колориметрически (Carret & Nason, 1969), а так же качественно по окрашиванию среды в красный цвет после добавления реактива Грисса (Carret & Nason, 1969).
О каталазной активности судили по образованию пузырьков кислорода при воздействии на клетки 3% раствором перекиси водорода (Нетрусов и др., 2005). \
Пробу сухой биомассы клеток (5 мг) обрабатывали в 0.4 мл 1 N хлористого водорода в метаноле при 80С в течение 1 часа (кислый метанолиз). Образовавшиеся при метанолизе метиловые эфиры жирных кислот и диметилацетали экстрагировали гексаном и вводили в газовый хроматограф системы Шерлок (Microbial identificaition system, MIDI Inc., USA) (Цаплина и др., 1994).
3.3.6. Методы определения способности к фотосинтезу
Фотосинтетическую активность клеток Rna. thiooxidans регистрировали двумя методами. Дифференциальные спектры поглощения «фотоокисленный минус восстановленный», характеризующие первичное разделение заряда в РЦ фотосинтеза и перенос электрона от связанных с РЦ цитохромов, регистрировали в суспензии клеток на однолучевом спектрофотометре, как описано ранее (Лукашев, Кононенко, Рубин, 1984). Оптическая плотность образцов в 2 мм кювете составляла 0.2 при 870 нм. Для получения каждой точки в дифференциальных спектрах кювету освещали светом интенсивностью 16 мвт/см2 и длиной волны 620 нм в течение 20 сек. Во втором методе обратимое фотоингибирование дыхания (ФИД), вызываемое активацией ЭТЦ фотосинтеза, конкурентной дыхательной цепи, измеряли, освещая клеточную суспензию в полярографической ячейке импульсным светом разного спектрального состава по описанной ранее методике (Бойченко, 2004). Уменьшение скорости газообмена Ог в образцах под вспышками монохроматического света (0.2 мкм квантов/м2с, спектральная полуширина щели 3 нм, длительность 1 с и темновые интервалы 20-60 с) регистрировали в спектральном диапазоне 400-930 нм. Оптическое сечение поглощения светособирающей антенны для определения ее размеров, т.е. числа молекул Бхл а, приходящихся на один реакционный центр, получали, измеряя кривые светового насыщения фотореакции ингибирования дыхания на импульсном монохроматическом свету, как изложено ранее (Бойченко, 2004).
Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Hitachi 557. Для выявления цитохромов дифференциальные спектры поглощения получали, вычитая спектр образца, окисленного феррицианидом (1 мМ), из спектра образца, восстановленного аскорбатом (5 мМ) или дитионитом (100 мМ) в области поглощения а-/3 цитохромных полос (500-610 нм) и у полосы - в области 400 нм. Содержание гемов в образцах оценивали по спектрам поглощения пиридиновых гемохромов с коэффициентами экстинкции, равными 23.9, 24.0 и 25.0 мМ"1см"1 для гемов С, В и А в «-полосах 550, 556 и 588 нм соответственно (Berry, Trumpower, 1987).
Спектры флуоресценции измеряли при 77К на люминесцентной установке, позволяющей регистрировать излучение в ближней инфракрасной области (Stadnichuk, Kovalev, Krasnovsky, 1993). Оптическая плотность образцов равнялась 0.1 в инфракрасном максимуме поглощения Бхл а.
Цитохромоксидазную активность определяли по уменьшению поглощения при 615 нм добавляемого к образцам искусственного донора электронов, N,N,N N QTpaMeTnn-p-фенилендиамина (Daldal et al., 2001). Для выявления цитохромоксидаз, содержащих цитохром аз, суспензию клеток подвергали мягкому барбатированию моноокисью углерода (6 мин). Затем образец в полярографической ячейке освещали импульсным светом разного спектрального состава с фотообратимым высвобождением СО и параллельной регистрацией возрастающего потребления кислорода (Straub, 1965) на установке, использованной для регистрации ФИД (Бойченко, 2004).
Электрофорез белков в ПААГ. SDS-электрофорез (15 % акриламида) проводили в системе Лэммли (Laemmli, 1970) или с добавлением 6 М мочевины в системе Шэгера-фон Ягова (Schagger, von Jagow, 1987). Белковые зоны прокрашивали в коллоидном растворе кумасси G-250. Цитохромы с в ПААГ выявляли, используя окрашивание 3,3 5,5 -тетраметилбензидином (ТМБЗ) ковалентно связанного с белком гема С (Thomas, Ryan, Levin, 1976).
Разделение клеточных мембран и водорастворимой фракции клеток. Клетки осаждали при 1000 g, промывая дважды буферным раствором (50 мМ Трис-HCl, рН 8.0 - буфер А). Осажденные клетки обрабатывали 0.1% раствором лизоцима в течение 30 мин при комнатной температуре (буфер А, содержащий 2 мМ ЭДТА) и добавляли ДНКазу до 0.01% и MgS04 до 5 мМ. Смесь инкубировали 10 мин на льду и центрифугировали 30 мин при 140000 g. Осадок вновь суспендировали в буфере А, и клетки разрушали ультразвуком дважды по 15 сек. Грубые фрагменты мембран и остатки неразрушенных клеток удаляли центрифугированием при 15000 g в течение 20 мин. Мембраны из полученного супернатанта осаждали 90 мин при 140000 g. Оба супернатанта 140000 g соединяли и использовали для изучения водорастворимых цитохромов.
Анализ водорастворимых цитохромов. К объединенным супернатантам последовательно добавляли сульфат аммония (СА) до 20% и 35% (вес/объем) и после 15 мин перемешивания преципитаты осаждали центрифугированием (15000 g, 10 мин). Осадки растворяли в буфере А и содержание цитохромов определяли в растворе спектрофотометрически, а также прокрашиванием разделяемых электрофорезом белковых зон в ПААГ. Фракцию 35% дополнительно разделяли с помощью гидрофобной хроматографии на колонке бутилSK фрактогеля (Мерк, ФРГ). Белки элюировали с колонки обратным градиентом концентрации СА (1.5-0.0 М) в буфере А.
Анализ мембранных цитохромов. Клеточные мембраны в буфере А (10 мг/мл) солюбилизировали, добавляя додецилмальтозид из 10%-ного раствора до весового соотношения с белком 1/1. Смесь инкубировали на льду в течение 1 часа при периодическом перемешивании, наслаивали на градиент концентрации сахарозы (10% - 30%, в буфере А, содержащем 0.1% додецилмальтозид) и центрифугировали на бакет-роторе Ti-бО при 40000 об/мин 12 часов. Полученные сахарозные фракции, а также исходную смесь анализировали, как и водорастворимые цитохромы, спектрофотометрически и с помощью электрофореза в ПААГ.
Распространение АБС и факультативно аэробных НПБ в содовых озерах и щелочных термальных источниках
В процессе выполнения работы были отобраны пробы воды, илов и микробных матов из содовых озер с различной минерализацией и рН свыше 9.0.
Нам не удалось получить роста колоний ни НПБ ни АБС из проб воды озер с минерализацией более 120 г/л. Можно предположить, что нишу аэробных фотогетеротрофов в них занимают галофильные археи с бактериородопсином, которые, как и АБС способны к светозависимому фотосинтезу в аэробных условиях (Gomez-Consarnau et al., 2007; Beja et al., 2000).
Наиболее высокий процент АБС, до 60 % колониеобразующих организмов, был в пробах воды гиперсоленого меромиктического содового озера "Моно Лейк (Калифорния). В воде другого меромиктического содового озера Доронинского (Восточная Сибирь), АБС также присутствовали, но их было значительно меньше, по сравнению с другими типами микроорганизмов, выраставших на чашках Петри. В перечисленных озерах обнаружены различные виды алкалофильных АБС рода Roseinatronobacter (табл. 12). Можно заключить, что присутствие представителей этого рода характерно для содовых озер с умеренной минерализацией (18-90 г/л).
Из озер Баргузинской долины выделены две новые факультативно аэробные алкалофильные НПБ: Rhodobaca barguzinensis sp. nov. (озеро № 1 с минерализацией 60 г/л) и Rubribacterpolymorphus gen. nov., sp. nov. (содовое озеро № 2 с минерализацией 22 г/л).
В значительном количестве АБС обнаружены в прибрежном иле оз. Шулуутай-Эхе Тором и песчанистом мате в зоне проявления грязевого вулканчика оз. Доронинского. При высокой щелочности (рН 9.5 - 9.8), минерализация илового раствора в этих местообитаниях была относительно невысокой около 3-10 г/л. Из этих экозон содовых водоемов были выделены два штамма отнесенные к двум новым видам рода Roseococcus.
Из низкоминерализованного (1.5 г/л) содового озера Ножий был изолирован штамм АБС по филогении близкий к морскому виду Porphyrobacter donghaensis. Другой штамм Porphyrobacter donghaensis был выделен из термального источника Сея. Оба штамма предпочитали расти в слабо щелочной среде и не являются алкалофилами. Из источника Кучигер были получены хорошо растущие аэробно НПБ, имеющие 98 % сходства по данным сиквенса168 рРНК с типовым штаммом Rhodobacter blasticus. Этот штамм оказался нейтрофилом. Можно заключить, что среда низкоминерализованных содовых озер и щелочных источников, обладает слабой буферностью и не благоприятна для существования алкалофильных микроорганизмов.
Таким образом, наши исследования значительно расширили знания о распространении и видовом разнообразии АБС и факультативно аэробных НПБ в содовых озерах разного типа с рН выше 9.0 и минерализацией от нескольких грамм до полного насыщения. Большинство выделенных штаммов АБС и алкалофильных НПС оказались новыми видами. Можно предположить, что АБС играют значительную роль в балансе углерода не только в пресных и морских водоемах, но и в содовых эпиконтинентальных озерах.
. АБС слабоминерализованных щелочных водных экосистем 5.1.1. Новые штаммы Porphyrobacter donghaensis
С поверхности цианобактериального мата термального источника Сея выделен штамм Se-4, геном которого, по данным 16s рРНК имеет 99.6 % уровень сходства с геномом морского Porphyrobacter donghaensis (штамм SW-1321). Новый изолят является облигатным аэробом. На агаризованной среде образует округлые колонии с четкими краями оранжевого цвета. Клетки представлены подвижными палочками, способными к ветвлению (рис. 12). Размеры клеток 0.5-0.7x1.0-2.Змкм. Эндоцитоплазматическая мембрана не развита. Резервные вещества представлены поли-Р-оксимасляной кислоты.
Фотосинтетическая активность и компоненты электронного транспорта у аэробной бактериохлорофилл а-содержащей бактерии Roseinatronobacter thiooxidans
Биоэнергетика аэробной бактериохлорофилл ar-содержащей (Бхл а) бактерии Roseinatronobacter thioxidans характеризуется сочетанием фотосинтеза, кислородного дыхания и окисления соединений, серы в условиях алкалофилии (Сорокин и др., 2000). В настоящей работе установлена фотосинтетическая активность клеток Rna. thiooxidans с помощью фотоингибирования дыхания и обратимого фотовыцветания Бхл а реакционных центров (РЦ), связанных цепью переноса электронов с окислением цитохрома С551.
Пигментный аппарат фотосинтеза. Содержание Бхл а у Rna. thiooxidans в использованных темновых условиях роста равнялось 3 нМ/мг белка (Сорокин и др., 2000), что соответствует уровню Бхл а у других АБС бактерий - 1-4 нМ/мг (Yurkov & Beatty, 1998). Меньшее на порядок количество Бхл а в сравнении с анаэробными пурпурными бактериями и подавление биосинтеза пигмента низкоинтенсивным действующим светом являются характерными особенностями АБС бактерий (Shimada, 1995).
Спектр поглощения in vivo Rna. thiooxidans содержал высокоинтенсивную полосу при 871 и низкоинтенсивную - при 806 нм (Рис. 28) (Сорокин Д.Ю. и др., 2000), что характерно для Бхлаг. Максимум 871 нм отвечает присутствию в клетках LHI, или В870 светособирающего Бхл а-содержащего пигмент-белкового комплекса фотосинтеза. Отсутствие в спектре поглощения интенсивных максимумов 805 и 835-850 нм означает, что мембраны Rna. thiooxidans не имеют LHII светособирающего комплекса фотосинтеза, дополняющего комплекс LHI у ряда пурпурных бактерий (Zuber & Cogdell, 1995). В подтверждение, низкотемпературный спектр флуоресценции клеток имеет один четко выраженный максимум 893 нм, соответствующий полосе поглощения 871 нм и являющийся характерным для LH1 комплекса (Рис. 28 б). Таким образом, подобно большинству исследованных АБС (Yurkov&Beatty, 1998), мембраны Rna. thiooxidans несут лишь LHI светособирающий комплекс.
Фотосинтетическая активность. Первым доказательством протекания фотосинтеза у АБС стала регистрация обратимого фото выцветания реакционных центров и связанного с ним окисления цитохромов у Rsb. denitrificans (Harashima et al., 1982).
Характерные для РЦ фотосинтеза фотоиндуцированные изменения поглощения клеток Rna. thiooxidans зарегистрированы нами в диапазоне длин волн 400-910 нм (Рис. 29). Наблюдаемые в дифференциальном спектре «свет минус темнота» максимумы 860 и 810 нм и полоса при 605 нм свидетельствуют, что исследуемый вид содержит РЦ, по своим спектральным характеристикам не отличающийся от РЦ пурпурных бактерий и других известных АБС. Кроме перечисленных, дифференциальный спектр имеет цитохромные полосу Соре при 425 нм и а-полосу при 551 нм, характерные для цитохромов с-типа (Рис. 29), что соответствует прежним данным (Candela et al., 2001) о цитохроме с55і У АБС как аналоге цитохрома с2 пурпурных бактерий, который служит донором электрона для РЦ фотосинтеза.
Вторым свидетельством фотосинтетической активности РЦ является регистрация спектра ФИД Rna. thiooxidans. При освещении интактных клеток светом, поглощаемым Бхл а, отмечено уменьшение скорости клеточного дыхания. Эффект объясняется наличием общих конкурентных участков ЭТЦ дыхания и фотосинтеза (Бойченко, 2004). Совпадение спектра ФИД и спектра поглощения Бхл a in vivo (Рис. 30) указывает на осуществление фотосинтетического процесса клетками Rna. thiooxidans. Фотоингибирование дыхания на белом свету зарегистрировано ранее у бактерий Rsb. denitrijicans, Erythrobacter longus (Harashima et al., 1982) и Acidiphilium rubrum (Wakao et al., 1996), что в отсутствие спектров действия служило предварительным указанием на наличие фотосинтеза у АБС.
![Колонизация условно-патогенными бактериями различных биотопов полости рта пациентов, пользующихся съемными пластиночными протезами из акриловых пластмасс [Электронный ресурс]](/i/i/4261/192346.png "Колонизация условно-патогенными бактериями различных биотопов полости рта пациентов, пользующихся съемными пластиночными протезами из акриловых пластмасс [Электронный ресурс] Климова Татьяна Николаевна")
