Ацидофильные метанотрофные бактерии Дедыш Светлана Николаевна

Содержание к диссертации

Часть 1. ВВЕДЕНИЕ 7

Актуальность проблемы 7

Цель и задачи работы. 9

Научная новизна и значимость работы 10

Практическая ценность 10

Основные защищаемые положения диссертации 11

Публикации 12

Структура и объем 12

Часть 2. МЕТАНОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ КАК УНИКАЛЬНАЯ ГРУППА ПРОКАРИОТНЫХ ОРГАНИЗМОВ И ИСТОРИЯ ПОИСКА АЦИДОФИЛЬНЫХ МЕТАНОТРОФОВ 13

Глава 1. Общая характеристика метанотрофных бактерий как уникальной метаболической группы прокариотных организмов 13

Глава 2. Современное состояние таксономии метанотрофных бактерий 27

Глава 3. Известные экофизиологические типы метанотрофных бактерий...35

Глава 4. История поиска метанотрофных организмов, осуществляющих процессы окисления метана в кислых болотах Северного полушария 46

2.4.1. Основные характеристики сфагновых болот как среды обитания микроорганизмов. 46

2.4.2. Изучение процессов окисления метана в кислых торфах 47

2.4.3. Применение различных подходов для идентификации метанотрофных организмов кислых северных болот 48

2.4.3.1. Культуральные методы 48

2.4.3.2. Анализ жирных кислот, экстрагированных из природного образца 49

2.4.3.3. Молекулярные методы 51

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Часть 3. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОЦЕССОВ ОКИСЛЕНИЯ МЕТАНА В КИСЛЫХ СФАГНОВЫХ БОЛОТАХ 53

Глава 1. Объекты и методы исследования 53

3.1.1. Характеристика мест отбора образцов 53

3.1.2. Измерение активности окисления метана образцами торфа сфагновых болот 55

3.1.3. Модельные эксперименты по выявлению оптимума процесса окисления метана в торфе 56

Глава 2. Динамика потребления СН4 образцами сфагнового торфа и вклад абиотических процессов 57

Глава 3. Активность потребления СН4 в северных болотах различных типов и ее распределение по профилю болота 61

Глава 4. Кинетика окисления метана в сфагновом торфе в зависимости от различных экотопических факторов 69

3.4.1. Влияние концентрации CHj 70

3.4.2. Влияние кислотности среды (рН) 78

3.4.3. Влияние температуры 79

3.4.4. Влияние концентрации солей 79

Часть 4. АЦИДОФИЛЬНЫЕ МЕТАНОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ КАК ОСОБАЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ГРУППА ОРГАНИЗМОВ ...82

Глава 1. Материалы и методы исследования 82

4.1.1. Выделение и исследование ацидофильных метанотрофных сообществ 82

4.1.1.1. Образцы торфа, использованные для получения накопительных культур болотных метанотрофов 82

4.1.1.2. Методика получения накопительных культур... 82

4.1.1.3. Культивирование метанотрофных сообществ и изучение их ростовых характеристик 83

4.1.1.4. Аналитические методы 84

4.1.1.5. Молекулярный анализ компонентного состава сообществ 85

4.1.1.6. Сканирующая электронная микроскопия 86

4.1.2. Изучение чистых культур ацидофильных метанотрофов 87

4.1.2.1. Методика получения изолятов ацидофильных метанотрофов и их культивирование 87

4.1.2.2. Контроль чистоты изолятов 88

4.1.2.3. Методы исследования морфологических, физиологических и хемотаксономических характеристик культур 89

4.1.2.4. Электронная микроскопия 91

4.1.2.5. Энзимологические исследования 92

4.1.2.6. Определение нуклеотидного состава ДНК и ДНК-ДНК гомологии 93

4.1.2.7. Определение и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей филогенетических и функциональных генов 93

4.1.2.8. Бактерии, использованные в качестве тест- культур 95

Глава 2. Ацидофильные метанотрофные сообщества 96

4.2.1. Новый подход к получению накопительных культур метанотрофных бактерий сфагновых болот 96

4.2.2. Ростовые характеристики метанотрофных сообществ болот 99

4.2.3. Идентификация метанотрофного компонента сообществ 108

Глава 3. Ацидофильные метанотрофные бактерии и их свойства 111

4.3.1. Морфологические и физиологические характеристики ацидофильных метанотрофов 111

4.3.1.1. Род Methylocella Ill

4.3.1.2. Род Methylocapsa 120

4.3.2. Состав клеточных жирных кислот и фосфолипидов 126

4.3.3. Метаболическая характеристика 128

4.3.4. Филогенетическая принадлежность 130

4.3.5. Функциональные гены ацидофильных метанотрофных бактерий 133

4.3.4.1. Ген ртоА 133

4.3.4.2. Ген ттоХ. 135

4.3.4.3. Ген mxaF. 137

4.3.4.4. Гены nifH и ni/D 137

4.3.6. Характеристики, дифференцирующие Methylocapsa и Methylocella 142

Часть 5. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭКОЛОГИЯ АЦИДОФИЛЬНЫХ МЕТАНОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ ...144

Глава 1. Молекулярные методы исследования экологии метанотрофных бактерий и их применимость для детекции ацидофильных метанотрофов 144

5.1.1. Молекулярные подходы, используемые для идентификации и определения численности метанотрофных бактерий в природных местообитаниях 144

5.1.2. Применимость ранее разработанных молекулярных методов для детекции ацидофильных метанотрофов 149

5.1.2.1. Методы, основанные на использовании ПЦР 149

5.1.2.2. Метод FISH 151

5.1.3. Свидетельства широкого распространения ацидофильных метанотрофных бактерий, полученные в молекулярных исследованиях других авторов ...152

Глава 2. Материалы и методы 154

5.2.1. Разработка новых олигонуклеотидных зондов и проверка их специфичности 154

5.2.2. Использование ранее разработанных олигонуклеотидных зондов 154

5.2.3. Процедура фиксации образцов для последующего анализа методом FISH 155

5.2.3.1. Фиксация культур бактерий 155

5.2.3.2. Фиксация образцов торфа. 156

5.2.4. Процедура гибридизации фиксированных образцов с зондами 157

5.2.5. Микроскопический анализ 159

5.2.4. Детекция и учет клеток метанотрофов в нативных образцах 160

Глава 3. Разработка молекулярных подходов для специфической детекции представителей ацидофильных метанотрофов и их применение для исследования популяций этих бактерий in situ 161

5.3.1. Создание 16S рРНК-специфичных флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов для детекции ацидофильных метанотрофных бактерий 161

5.3.1.1. Дизайн зондов 161

5.3.1.2. Оптимизация условий гибридизации 164

5.3.1.3. Апробация зондов на смешанных культурах метанотрофов и нативных образцах торфа 170

5.3.2. Идентификация и определение популяционной численности метанотрофов, населяющих сфагновые болота бореальной зоны 171

5.3.2.1. Оценка эффективности процедуры экстракции клеток из торфа 171

5.3.2.2. Оптимизация процедуры учета клеток метанотрофов для получения статистически достоверных результатов 175

5.3.2.3. Влияние формамида на результаты определения численности ацидофильных метанотрофов in situ. 177

5.3.2.4. Анализ состава популяций метанотрофных бактерий в сфагновом торфе 179

5.3.2.5. Идентификация метанотрофных бактерий II типа, обнаруженных в кислых торфах, и выделение репрезентативной культуры этих организмов 181

5.3.2.6. Состав популяций метанотрофов в сфагновых болотах бореальной зоны 190

5.3.3. Распределение популяций метанотрофных бактерий по профилю болота бореальной зоны 191

5.3.4. Компонентный состав и профильная структура метанокисляющего фильтра сфагнового болота зоны тундры 193

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 200

ВЫВОДЫ 202

ЛИТЕРАТУРА 204 

Введение к работе

Актуальность проблемы. Метан является одним из наиболее активных парниковых газов, быстрые темпы накопления которого в атмосфере Земли (до 1 % в год) (Cicerone, Oremland, 1988; IPCC, 2001) вызывают обоснованную тревогу мирового сообщества (Рамочная конвенция ООН об изменении климата, 1992). В глобальном бюджете атмосферного СНЦ выделяют два крупнейших его источника - естественные болота и заболоченные земли, а также рисовники (Matthews, Fung, 1987; Aselmann, Crutzen, 1989; Hein et al., 1997). Значимость каждого из этих источников варьирует в различных географических регионах. Основные площади рисовников сосредоточены в юго-восточной Азии, низовые болота расположены по большей части в тропических регионах, тогда как северные широты (выше 60°N) заняты массивами верховых и мезотрофных болот. Вклад этих северных болот в бюджет атмосферного CHU особенно значителен для России, стран Скандинавии, Канады и севера США (Matthews, Fung, 1987; Hein et al., 1997; Panikov, 1999; Заварзин, Васильева, 1999). Наиболее обширные массивы болот — 161 млн. га - расположены в России, причем большая их часть сосредоточена в Западной Сибири, где они составляют до 80% территории (Вомперский и др., 1999; Land resources of Russia, 2002). Полевые измерения величин эмиссии метана из западносибирских болот показали, что они достаточно высоки и варьируют от 0.5 до 40 мг СН4-С ч"1 м" (Паников и др. 19936,1995,1997; Гальченко и др. 2001), причем эмиссия метана из нейтральных низовых болот незначительна, а максимальные ее значения регистрируются в верховых и мезотрофных кислых сфагновых болотах.

Метан, поступающий из северных болот в атмосферу, имеет биогенное происхождение, о чем свидетельствует его легкий изотопный состав (Quay et al., 1988). Продукция биогенного метана обусловлена деятельностью двух специфических групп прокариотных организмов - метаногенных и метанотрофных бактерий (Заварзин, 1979, 1984), а эмиссия 0 из болот в атмосферу есть результат дисбаланса в их функционировании. Однако природа как метаногенных, так и метанотрофных организмов, осуществляющих реакции цикла метана в сфагновых болотах, долгое время оставалась неизвестной. Причиной тому являлись специфические характеристики этих болот как среды обитания микроорганизмов, прежде всего, их высокая кислотность. Значения рН торфяной влаги в верховых сфагновых болотах лежат в диапазоне 3-4.5, а в мезотрофных болотах - в диапазоне 4-5.5. Помимо этого, для сфагновых болот характерны низкая буферность воды, низкое содержание минеральных солей ( 50 мг/л) и преобладание пониженных температур. Совокупность этих характеристик не позволяла соотнести процессы биогенного образования и потребления СН4 в этой экосистеме с каким-либо из ранее известных микроорганизмов цикла метана.

Определенный прогресс в исследовании закономерностей метаногенеза в сфагновых болотах и идентификации микроорганизмов - агентов этого процесса был достигнут лишь в последние годы (Nercessian et al., 1999; Horn et al., 2003; Galand et al., 2003; Sizova et al., 2003; Kotsyurbenko et al., 2004), однако чистые культуры ацидофильных метаногенов не описаны и поныне. Настоящая же работа была посвящена исследованию метанотрофных бактерий, слагающих «бактериальный газовый фильтр», который перехватывает образованный в анаэробных слоях сфагновых болот СЩ на его пути в атмосферу. Именно эффективность работы метанокисляющего микробного сообщества является тем естественным механизмом, который контролирует величину эмиссии метана из северных болот (Panikov et al., 2001). В противоположность достаточно хорошо изученным метанотрофным сообществам низовых болот (Намсараев, 1973) и рисовников (Henckel et al., 1999; Frenzel, 2000; Eller, Frenzel, 2001), представленных известными метанотрофами I и II типов, состав этих сообществ в сфагновых болотах долгое время оставался «белым пятном» в экологии метанотрофных бактерий. Актуальность обнаружения и исследования этих организмов была продиктована самой глобальностью распространения кислых торфяных болот, являющихся доминирующими наземными экосистемами бореальной зоны Северного полушария и одним из наиболее характерных для России ландшафтов.

Цель и задачи работы. Целью настоящего исследования явилось выявление и изучение метанотрофных бактерий, слагающих метанокисляющий фильтр северных кислых ультрапресных болот и снижающих эмиссию парникового газа СН4 в атмосферу. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать закономерности процессов окисления СЕЦ образцами кислых торфов для выявления физиологического оптимума населяющих их метанотрофных бактерий.

2. Разработать адекватные культуральные подходы для выделения ацидофильных метанотрофных микробных сообществ и изучить их состав.

3. Выделить чистые культуры ацидофильных метанотрофных бактерий из сфагновых болот различного географического расположения, исследовать особенности их биологии и установить их филогенетическую принадлежность и таксономический статус.

4. Осуществить сравнительный анализ аминокислотных последовательностей ключевых ферментов ацидофильных метанотрофов - растворимой и мембранной ММО, метанолдегидрогеназы и нитрогеназы - с таковыми у ранее известных метанотрофов.

5. Разработать молекулярные подходы, позволяющие идентифицировать и определять численность ацидофильных метанотрофных бактерий в природных средах.

6. Определить состав и численность популяций метанотрофных бактерий, слагающих метанотрофный фильтр сфагновых болот различного географического расположения, и оценить вертикальную структуру этого фильтра.

Научная новизна и значимость работы. Установлена природа микробного блока, осуществляющего естественный контроль над эмиссией метана из северных болот, и выявлены микроорганизмы - агенты процессов окисления метана в кислых, холодных и ультрапресных природных экосистемах.

Описана неизвестная ранее группа ацидофильных метанотрофных бактерий, составляющих филогенетически обособленную ветвь метанотрофных организмов в пределах класса Alphaproteobacteria. Установлен и узаконен таксономический статус представителей этой группы - двух новых родов, Methylocella и Methylocapsa, и четырех новых видов метанотрофных бактерий, Methylocella palustris, Methylocella silvestris, Methylocella tundrae и Methylocapsa acidiphila. Типовые штаммы этих новых бактерий депозитированы в международных коллекциях микроорганизмов - АТСС, DSMZ и NCIMB.

Исследования ацидофильных МБ позволили существенно расширить знания о биологии метанотрофных бактерий, в частности, их физиологии, ультраструктуре клеток, хемотаксономических и генотипических характеристиках.

Впервые для количественных исследований популяций метанотрофов в природном местообитании применен метод in situ гибридизации с 16S рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами (метод FISH). Идентифицированы основные микробные популяции, слагающие метанокисляющий фильтр сфагновых болот, а также определена их популяционная численность в болотах бореальной зоны и зоны тундры.

Практическая ценность. Разработаны концептуально-новые приемы выделения микроорганизмов из ультрапресных местообитаний, позволившие изолировать представителей функционально важной, но некультивируемой ранее группы ацидофильных метанотрофных бактерий.

Создана база данных нуклеотидных последовательностей 16S рДНК, а также ртоА, ттоХ, mxaF, пі/Ни nifD генов ацидофильных метанотрофных бактерий, которая может быть использована для разработки молекулярных методов детекции этих микроорганизмов, основанных на использовании ПЦР или микрочипов.

Разработан и апробирован наиболее полный из существующих на сегодняшний день набор 16S рРНК-специфичных флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов для дифференцированной детекции метанотрофных бактерий. Он включает зонды различного уровня специфичности: от видо-специфичных зондов для ацидофильных метанотрофов Methylocella palustris, Methylocella silvestris, Methylocella tundrae и Methylocapsa acidiphila, до родо- и группо-специфичных зондов для известных ранее МБ I и II типов. Разработана также модификация метода FISH для анализа образцов торфа, применимая для оценки популяционной плотности не только метанотрофных, но и любых других групп бактерий.

Получена коллекция изолятов ацидофильных МБ, обладающих растворимой формой ММО и, в силу этого, имеющих хороший потенциал для применения в биотехнологии очистки кислых природных сред от загрязнения.

Основные защищаемые положения диссертации.

1. Окисление метана в сфагновых болотах осуществляется неизвестной ранее, специализированной группой ацидофильных метанотрофных бактерий, хорошо адаптированных к росту в кислых, холодных и ультрапресных условиях.

2. Ацидофильные МБ представляют филогенетически обособленную группу бактерий в пределах класса Alphaproteobacteria, которая находится лишь в отдаленном родстве с представителями ранее известных метанотрофов II типа.

3. Культуральные подходы и молекулярные методы детекции, разработанные ранее для нейтрофильных метанотрофов, не могут быть использованы или имеют лишь ограниченное применение для исследования ацидофильных МБ. Единственным строго количественным из доступных на настоящий момент методов исследования популяционной экологии ацидофильных МБ является метод in situ гибридизации с 16S рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными зондами. 4. Ареал распространения ацидофильных МБ довольно широк и включает сфагновые болота бореальной и тундровой зон, а также кислые лесные почвы бореальной зоны.

Публикации. Материалы диссертации содержатся в 30 печатных работах: 17 экспериментальных статьях, 2 обзорах и 11 тезисах.

Структура и объем. Работа изложена на 235 страницах и содержит 49 рисунков и 20 таблиц. Список цитируемой литературы включает 294 наименования, из них 54 - на русском, 2 - на немецком и 238 — на английском языках.