Введение к работе
. Актуальность проблемы. Инфекционные заболевания, по-прежнему, остаются угрозой, являясь основной причиной смертности в развивающихся странах и серьезной проблемой для передовых стран [Jones et al., 2011]. Ухудшение экологической обстановки, эпидемия ВИЧ, широкое использование трансплантационной и противораковой терапии, рост числа хирургических вмешательств, широкое и необоснованное использование антибиотиков приводит к появлению заболеваний, с трудом поддающихся лечению существующими лекарственными препаратами [Livermore, 2011]. Наблюдается стремительный рост заболеваемости глубокими (инвазивными) микозами, протекающими крайне тяжело и характеризующимися высокой смертностью [Blyth et al., 2010]. Противогрибковых препаратов относительно немного и они, как правило, высокотоксичны. Необходимы новые более совершенные противогрибковые антибиотики [Ruiz-Camps, Cuenca- Estrella, 2009]. Актуальной и нерешенной до сих пор проблемой здравоохранения являются сердечно-сосудистые заболевания на почве атеросклероза [Thompson et al., 2010], борьба с которыми в последнее время стала более эффективной благодаря применению ингибиторов биосинтеза холестерина [Corsini, Ceska, 2011]. Создаваемые на основе микробных биологически активных продуктов эти препараты нередко обладают также способностью к противоопухолевому и противогрибковому действию [Soeda et al., 2011].
Несмотря на ведущийся в развитых странах широкий скрининг антибиотиков, число новых препаратов, прошедших всесторонние испытания и рекомендованных к клиническому использованию, с каждым десятилетием снижается [Berdy, 2005, Freire- Moran et al., 2011]. Существующие подходы трудоемки и не позволяют обеспечить должной эффективности поисковых исследований [Clardy et al., 2009]. Методология поисковых работ нуждается в серьезном усовершенствовании.
Новая методология поиска, подразумевающая разработку современных тестов и создание рациональной схемы их использования, а также изучение биологически активных соединений, получаемых путем направленной химической трансформации генно-инженерных производных антибиотиков, могут существенно повысить эффективность поисковых работ и обеспечить создание новых лекарственных препаратов.
Цель и задачи исследования.
Цель исследования состояла в разработке новой методологии поиска биологически активных метаболитов - ингибиторов биосинтеза стеролов (ИБС) и новых противогрибковых антибиотиков, в проведении поиска, изучении физико- химических и биологических свойств полученных препаратов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие
основные задачи:
разработать новые методы поиска ИБС, основанные на использовании микробных культур и линий клеток млекопитающих, разработать модели, пригодные к использованию на различных этапах поисковых работ;
изучить возможность использования в поисковых исследованиях различных способов "активизации" микробных продуцентов с целью усиления их способности к образованию антибиотиков и определить возможность применения дополнительных способов очистки микробных метаболитов для быстрого тестирования в биологических и биохимических тестах;
на основе использования новых моделей разработать схему поиска микробных метаболитов, обладающих гиполипидемическим и противогрибковым действием и провести широкий поиск таких метаболитов среди продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, изучить способность к образованию ИБС у актиномицетов;
провести выделение, очистку и химическую идентификацию выявленных биологически активных соединений, изучить их механизм действия;
провести поиск соединений, обладающих выраженной противогрибковой активностью, среди производных полиеновых антибиотиков, препаратов группы олигомицина, а также производных трисиндолилметана - аналогов антибиотика турбомицина. В экспериментах in vitro изучить их противогрибковое действие. Научная новизна работы.
Впервые предложен методологический подход для поиска ИБС, основанный на использовании оригинальных специально разработанных микробных моделей - бактериальной культуры Halobacterium salinarum и грибной культуры Acremonium fusidioides, а также культур клеток млекопитающих - человеческих злокачественных лимфобластов MOLT-4 и клеток гепатобластомы G2. Разработанные модели предложены в виде микрометодов и применимы на начальных этапах поисковых работ. Микробные модели использованы в модификации, позволяющей проводить поиск ингибиторов, как ранних, так и поздних этапов биосинтеза стеролов.
Предложена новая схема поиска ИБС, основанная на применении оригинальных моделей поиска, с обязательным отбором на начальном этапе микробных метаболитов, обладающих противогрибковой активностью.
Впервые установлено, что способностью к образованию ингибиторов ранних этапов биосинтеза стеролов (включая действие ГМГ-КоА редуктазы) обладают не только грибы, но и многие актиномицеты, что позволило расширить область поиска подобных метаболитов.
Впервые предложена "активизация" микробных продуцентов путем получения, регенерации и УФ-облучения протопластов на начальных этапах поиска. Метод
рекомендован, главным образом, для культур с затрудненным спорообразованием.
Впервые разработаны и применены в поисковых исследованиях новые оригинальные методы работы с культурами - продуцентами антибиотиков и образуемыми ими микробными метаболитами. Химические методы выделения дополнены микро- и ультрафильтрацией, очисткой с помощью скоростного центрифугирования, а также лиофилизацией культуральной жидкости.
Впервые изучены отдельные аспекты механизма действия ИБС, полученных в НИИНА им. Г.Ф.Гаузе, в том числе антибиотиков №№ 199 (аскофуранон), 86 (энниатин В) и 1132 (хлоротрицин). Показано комплексное воздействие аскофуранона на синтез и метаболизм липидов в клетке: одновременное подавление синтеза холестерина, эфиров холестерина, триглицеридов, и фосфолипидов. Наибольший гиполипидемический эффект энниатина В связан с подавлением синтеза эфиров холестерина.
Впервые в экспериментах in vitro изучена противогрибковая активность новых полусинтетических производных полиеновых антибиотиков, препаратов группы олигомицина и синтетических производных трисиндолилметана - аналогов антибиотика турбомицина. В каждой группе антибиотиков выявлены закономерности "структура-активность".
Впервые в экспериментах in vitro у солей трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия - аналогов антибиотика турбомицина А выявлено выраженное противогрибковое действие. Показано, что введение алкильных заместителей и длина углеродных цепей играют ключевую роль в достижении наивысшей активности этих соединений.
Научно-практическое значение.
Разработана система поиска ИБС среди продуктов микробного вторичного метаболизма у представителей различных таксонов (плесневые и мицелиальные грибы, актиномицеты), проведен поиск таких ингибиторов. Выявлена способность актиномицетов к продукции ИБС. Разработанные модели и схема поиска ИБС внедрены в поисковую работу НИИНА им.Г.Ф.Гаузе.
Выделены и изучены микробные метаболиты - ИБС, обладающие гиполипидемическим и противогрибковым действием, принадлежащие к различным классам химических соединений. Выявлены препараты, подавляющие ранние и поздние этапы биосинтеза стеролов.
Получены новые сведения о гиполипидемическом действии аскофуранона и энниатина В. В микробных моделях показана способность антибиотика 1709 (группа амфомицина) к подавлению ранних, а у антибиотика 1132 (хлоротрицин) поздних этапов биосинтеза стеролов.
Выявлена высокая противогрибковая активность антибиотика 4883 (группа ирумамицина), позволяющая рассматривать этот препарат в качестве перспективного
противогрибкового лекарственного средства.
В экспериментах in vitro изучена противогрибковая активность свыше 60 производных полиеновых антибиотиков. Выявленные закономерности "структура- активность", позволили осуществить направленную химическую трансформацию препаратов. Получены соединения, превосходящие по своей активности в опытах in vitro и in vivo известный противогрибковый препарат амфотерицин В. ДМАЭ-амид S44HP (2) и его водорастворимая глутаматная соль (2G) отобраны для углубленного доклинического изучения.
В экспериментах in vitro у солей трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия - аналогов антибиотика турбомицина А выявлено выраженное противогрибковое действие. Наиболее активные производные, длина алкильной цепи которых составляет С4-С5, превосходят по своей активности амфотерицин В.
Получен патент, подготовлены Методические указания по изучению противогрибковой активности фармакологических веществ (2011г., в печати).
Личный вклад соискателя. Соискателю принадлежит определяющая роль в постановке целей и задач проводимых исследований, выборе основных направлений в работе, анализе и обобщении полученных результатов. Соискатель лично усовершенствовал микробиологические методы работы с продуцентами биологически активных соединений и микробными тест-культурами, разработал новые оригинальные модели и схему поиска микробных метаболитов - ингибиторов биосинтеза стеролов, провел изучение механизма действия отобранных антибиотиков, принимал участие во всех экспериментальных исследованиях и подготовке научных публикаций, выступал с докладами на конференциях и международных симпозиумах.
Апробация диссертации.
Апробация проведена 25 ноября 2011 года на совместном заседании Ученого Совета НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН, Проблемной комиссии №42.01 по противоопухолевым и противовирусным антибиотикам Межведомственного Научного Совета по антибиотикам, Диссертационного Совета (Д 001.005.01) НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН.
Основные положения диссертации доложены на конференции "Мембранные процессы в биотехнологии, медицине и пищевой промышленности" (Москва, 1991), на 7-м Международном конгрессе "Быстрые методы и автоматизация в микробиологии и иммунологии" (Лондон, 1993), на 9-м международном симпозиуме "Биология актиномицетов" (Москва, 1994 г.), на Международной конференции "Микробный вторичный метаболизм" (Швейцария, Интерлакен, 1994), на симпозиуме "Липопротеиды и атеросклероз", С-Петербург, 1995), на 2-м съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), на 1-ой Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза, посвященной 100-летию со дня рождения А.Л.Мясникова (Москва, 1999), на 6-м Международном форуме "Биотехнология и современность", С- Петербург, 2005), на 5-м Московского международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), на междисциплинароном микологическом форуме (Москва, 2009, 2010), Российско-Индийском симпозиуме по гликопептидным антибиотикам (Москва, 2011).
Публикации. По итогам исследований в отечественных и международных журналах, материалах конференций опубликовано 36 печатных работ, в том числе 5 обзоров, 17 статей, 17 тезисов, 1 методические рекомендации и 1 патент на изобретение.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 350 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания используемых в работе методов, раздела, состоящего из 3-х глав материалов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 479 источников. Работа содержит 60 рисунков и 25 таблиц.
