Синтез модифицированных дезоксинуклеотидов - ингибиторов биосинтеза ДНК Дяткина Наталья Борисовна

Содержание к диссертации

Введение

II. Синтез шриновых дезоксинуклеозидов 8

1 Синтез дезоксинуклеозидов путем конденсации углевода о гетероциклическим основанием 10

2. Синтез дезоксинуклеозидов путем модификации рибофуранозной части молекулы 16

III. Синтез модифицированных нуклеотйдов -ингибиторов биосинтеза ДНК 41

1. Синтез 3 -азидо-2 ,3 -дидезоксинузслеозидов 42

2. Синтез производных (Е)-5-(2-бромвинил) 2 -дезоксиуридина 67

3. Синтез нуклеозид-5 -трифосфатов 76

IV. Экспериментальная часть 82

Приборы и материалы 83

Методики к разделу I 85

Методики к разделу 2 . 97

Методики к разделу 3 102

Приложение 105

Выводы 110

Литература 111

• Синтез дезоксинуклеозидов путем конденсации углевода о гетероциклическим основанием
• Синтез дезоксинуклеозидов путем модификации рибофуранозной части молекулы
• Синтез производных (Е)-5-(2-бромвинил) 2 -дезоксиуридина
• Синтез нуклеозид-5 -трифосфатов

Введение к работе

Биосинтез ДНК (репликация, сепаративный синтез, обратная транскрипция) наряду с транскрипцией и трансляцией входит в три основные этапа воспроизведения и реализации генетической информации в живой клетке. Проблемы, связанные с биосинтезом ДНК, очень разнообразны. Например, одна только репликация проходит через ряд последовательных этапов, природа которых выяснена в очень малой степени, особенно у высших. В то же время управление процессами биосинтеза ДНК имеет большое значение в теоретическом и практическом плане анализ репликации, наряду с выделением и сборкой репликативного комплекса, применяется чрезвычайно широко для изучения молекулярных аспектов этого процесса. Среди субстрат подобных аналогов для изучения биосинтеза ДНК в настоящее время широко применяются только два типа соединений, а именно арабинонук-леозиды и их 5 -трифосфаты и 2 ,3 -дидезоксинуклеозиды и их 5 Т 2 трифосфаты . Арабинонуклеозид-5 -трифосфаты проявили себя эффективными ингибиторами синтеза ДНК основными реплицирующими ДНК-полимеразами (тип оС ) и мало ингибировали синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразами, заполняющими малые бреши в дуплексных ДНК (тип fi ), 2 ,3 -Дидезоксинуклеозид-5 -трифосфаты, напротив, подавляют действие полимераз j$ , но мало эффективны в случае полимераз ос .

Следует добавить, что молекулярный механизм действия четко установлен лишь для 2 ,3 -дидезоксинуклеозид-5 -трифосфатов. Эти соединения являются субстратами единичного акта полимеризации, связываясь с комплексом [праймер+матрица+фермент] . После включения мононуклеотидного остатка в 3 -конец цепи ДНК, дальнейший синтез прерывается, так как в отсутствие 3 -гидроксила не происходит образования фосфодиэфирной связи со следующей нуклеотидной молекулой. Таким образом указанные соединения проявляют ингибиторные свойства на второй стадии полимеризации. Игленно это легло в основу их массового использования для определения первичной структуры ДНК полимеризационным методом .

Праймер, содержащий на конце арабинонуклеотидный остаток, способен к продолжению цепи, но скорость этой реакции очень низка. Более того, видимо, способность праймера к элонгации зависит от данного конкретного расположения нуклеотидных остатков в прай-мере и матрице. Поэтому использование арабинонуклеозид-5 -трифос-фатов часто не возмолшо из-за трудностей интерпретации полученных данных.

Ситуация еще более усложняется при работе с культурами клеток или целыми организмами. Это связано, в первую очередь, с неоднозначностью путей метаболизма субстратоподобных ингибиторов от нуклеозидов до их 5 -трифосфатов. Использование фосфатов нук-леозидов в системе in vivo практически невозможно из-за непроницаемости клеточных стенок для этих соединений. В то же время специфичность фосфорилирующих ферментов может явиться препятствием для превращения аналогов нуклеозидов в соответствующие трифосфа-ты.

Поэтому, планируя синтез новых высокоспецифичных субстратоподобных ингибиторов, следует брать в основу два следующих условия: субстратоподобные ингибиторы должны, во-первых, минимально отличаться по структуре и конформации от природных нуклеозидов, во-вторых, иметь в своей структуре звено, определяющее их поведение в конкретных реакциях их метаболизма вплоть до включения в ДНК.

Мы предположили, что такими качествами могут обладать анало-ги нуклеозидов, содержащие аминогруппу в 3 -положении. Этот подход был ранее использован в нашей лаборатории для изучения биосинтеза РНК с участием 3 -амино-3 -дезоксинуклеозид-5 -трифосфатов, которые оказались превосходными терминаторными субстратами РНК-поли-меразы изЕ. coii .

Целью нашей работы явилась разработка общего метода синтеза -амино-2 ,3 -дидезоксинуклеозидов и их 5 -трифосфатов, позволяющего получить соединения со всеми природными основаниями и широкий набор аналогов нуклеозидов с неприродными основаниями. Основное внимание было уделено синтезу углеводной компоненты требуемых нуклеозидов - 3-азидо-2,3 дидезоксирибофуранозы - и разработке методов ее конденсации с различными нуклеиновыми основаниями. Для использования полученных соединений в системах с ферментами in vitro их необходимо было превратить в соответствую-щие 5 -трифосфаты.

Все перечисленные этапы и явились темой данной диссертационной работы.

Основная часть работы выполнена в Лаборатории химии белкового синтеза ИМБ АН СССР. Часть работы по синтезу аналогов 5-бром-винилуридина проведена под руководством доктора М. фон Янта-Липинского в Центральном институте молекулярной биологии АН ГДР (г.Берлин) во время научной командировки.

Автор выражает глубокую признательность сотруднику ВОНЦ АМН СССР кандидату химических наук И.В.Ярцевой за регистрацию и помощь при интерпретации спектров DMP.

В ходе работы автор постоянно ощущал поддержку со стороны всех сотрудников лаборатории, которым, а в особенности, А.А.Хор-лину, 0.В.Туриной, Л.А.Александровой и Н.В.Скапцовой, автор приносит свою искреннюю благодарность.

Автор искренне признателен кандидату биологических наук М.К.Кухановой, кандидату химических наук С.В.Кочетковой и А.М.Атражеву, а также сотрудникам ВКНЦ АМН СССР кандидату биологических наук Р.Ш.Бибилашвили и З.Г.Чиджавадзе за исследования полученных соединений в системах с ферментами. 

Синтез дезоксинуклеозидов путем конденсации углевода о гетероциклическим основанием

Биосинтез ДНК (репликация, репаративный синтез, обратная транскрипция) наряду с транскрипцией и трансляцией входит в три основные этапа воспроизведения и реализации генетической информации в живой клетке. Проблемы, связанные с биосинтезом ДНК, очень разнообразны. Например, одна только репликация проходит через ряд последовательных этапов, природа которых выяснена в очень малой степени, особенно у высших. В то же время управление процессами биосинтеза ДНК имеет большое значение в теоретическом и практическом плане. йнгибиторный анализ репликации, наряду с выделением и сборкой репликативного комплекса, применяется чрезвычайно широко для изучения молекулярных аспектов этого процесса. Среди субстратопо-добных аналогов для изучения биосинтеза ДНК в настоящее время широко применяются только два типа соединений, а именно арабинонук-леозиды и их 5 -трифосфаты и 2 ,3 -дидезоксинуклеозиды и их 5 Т 2 трифосфаты . Арабинонуклеозид-5 -трифосфаты проявили себя эффективными ингибиторами синтеза ДНК основными реплицирующими ДНК-полимеразами (тип оС ) и мало ингибировали синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразами, заполняющими малые бреши в дуплексных ДНК (тип fi ), 2 ,3 -Дидезоксинуклеозид-5 -трифосфаты, напротив, подавляют действие полимераз j$ , но мало эффективны в случае полимераз ос . Следует добавить, что молекулярный механизм действия четко установлен лишь для 2 ,3 -дидезоксинуклеозид-5 -трифосфатов. Эти соединения являются субстратами единичного акта полимеризации, связываясь с комплексом [праймер+матрица+фермент] .

После вклю » чения мононуклеотидного остатка в 3 -конец цепи ДНК, дальнейший синтез прерывается, так как в отсутствие 3 -гидроксила не происходит образования фосфодиэфирной связи со следующей нуклеотидной молекулой. Таким образом указанные соединения проявляют ингибиторные свойства на второй стадии полимеризации. Игленно это легло в основу их массового использования для определения первичной структуры ос ДНК полимеризационным методом . Праймер, содержащий на 3 -конце арабинонуклеотидный остаток, способен к продолжению цепи, но скорость этой реакции очень низка. Более того, видимо, способность праймера к элонгации зависит от данного конкретного расположения нуклеотидных остатков в прай-мере и матрице. Поэтому использование арабинонуклеозид-5 -трифос-фатов часто не возмолшо из-за трудностей интерпретации полученных данных. Ситуация еще более усложняется при работе с культурами клеток или целыми организмами. Это связано, в первую очередь, с неоднозначностью путей метаболизма субстратоподобных ингибиторов от нуклеозидов до их 5 -трифосфатов. Использование фосфатов нук-леозидов в системе in vivo практически невозможно из-за непроницаемости клеточных стенок для этих соединений. В то же время специфичность фосфорилирующих ферментов может явиться препятствием для превращения аналогов нуклеозидов в соответствующие трифосфа-ты. Поэтому, планируя синтез новых высокоспецифичных субстратоподобных ингибиторов, следует брать в основу два следующих условия: субстратоподобные ингибиторы должны, во-первых, минимально отличаться по структуре и конформации от природных нуклеозидов, во-вторых, иметь в своей структуре звено, определяющее их поведение в конкретных реакциях их метаболизма вплоть до включения в ДНК.

Мы предположили, что такими качествами могут обладать анало-ги нуклеозидов, содержащие аминогруппу в 3 -положении. Этот подход был ранее использован в нашей лаборатории для изучения биосинтеза РНК с участием 3 -амино-3 -дезоксинуклеозид-5 -трифосфатов, которые оказались превосходными терминаторными субстратами РНК-поли-меразы изЕ. coii . Целью нашей работы явилась разработка общего метода синтеза » » » » 3 -амино-2 ,3 -дидезоксинуклеозидов и их 5 -трифосфатов, позволяющего получить соединения со всеми природными основаниями и широкий набор аналогов нуклеозидов с неприродными основаниями. Основное внимание было уделено синтезу углеводной компоненты требуемых нуклеозидов - 3-азидо-2,3 дидезоксирибофуранозы - и разработке методов ее конденсации с различными нуклеиновыми основаниями. Для использования полученных соединений в системах с ферментами in vitro их необходимо было превратить в соответствую-щие 5 -трифосфаты. Все перечисленные этапы и явились темой данной диссертационной работы. Основная часть работы выполнена в Лаборатории химии белкового синтеза ИМБ АН СССР. Часть работы по синтезу аналогов 5-бром-винилуридина проведена под руководством доктора М. фон Янта-Липинского в Центральном институте молекулярной биологии АН ГДР (г.Берлин) во время научной командировки. Автор выражает глубокую признательность сотруднику ВОНЦ АМН СССР кандидату химических наук И.В.Ярцевой за регистрацию и помощь при интерпретации спектров DMP. В ходе работы автор постоянно ощущал поддержку со стороны всех сотрудников лаборатории, которым, а в особенности, А.А.Хор-лину, 0.В.Туриной, Л.А.Александровой и Н.В.Скапцовой, автор приносит свою искреннюю благодарность. Автор искренне признателен кандидату биологических наук М.К.Кухановой, кандидату химических наук С.В.Кочетковой и А.М.Атражеву, а также сотрудникам ВКНЦ АМН СССР кандидату биологических наук Р.Ш.Бибилашвили и З.Г.Чиджавадзе за исследования полученных соединений в системах с ферментами. Дезоксинуклеозиды и нуклеотиды являются молекулами большого биологического значения. Задачи молекулярной биологии, генной инженерии, биохимии постоянно требуют использования для решения поставленных задач разнообразных аналогов дезоксинуклеозидов и нуклеотидов. Большое значение имеют также дезоксинуклеозиды как терапевтические агенты, обладающие противоопухолевым или противовирусным действием.

Структура и механизм действия аналогов предшественников нуклеиновых кислот, используемых в молекулярно-био 7 логических исследованиях, подробно рассмотрены в обзоре . Некоторые из природных антибиотиков также являются аналогами нуклео зидов или нуклеотидов; сведения об этом классе соединений изло я жены в монографии . Дезоксинуклеозиды природного ряда получают, используя ферментативный гидролиз дезоксирибонуклеиновых кислот. Однако задачи молекулярной биологии и медицины требуют получения нуклеози-дов, содержащих самые разные модификации как в углеводной, так и в гетероциклической частях молекулы, то есть возникает необходимость химического синтеза соединений этого типа. К настоящему времени разработаны многочисленные химические методы синтеза нуклеозидов и их аналогов. Исследования 50-60-ых годов представлены в монографиях 9 10, последние достижения детально обсужда-ются в ряде обзоров LJ-»±c m Возможны два подхода к конструированию молекулы дезоксинук-леозида: конденсация гетероциклического основания с соответствующим производным дезоксирибозы и последовательная модифшшция производных риборяда. Каждый из этих подходов имеет как свои достоинства, так и недостатки. Метод последовательной модификации рибонуклеозидов нашел очень широкое применение для синтеза дезоксинуклеозидов пиримидинового ряда. Это связано с тем, что одной из существенных особенностей поведения пиримидиновых нук » леозидов в реакциях, затрагивающих 2 - или 3 -гидроксилы, является соучастие карбонильной группы при С-2 атоме гетероциклическо » » го основания. Сравнительная легкость раскрытия 2,2 - или 2,3 -ан гидрокольца под действием нуклеофильных агентов, обнаруженная впер : ai ТО вые Деккером , успешно используется многими авторами для полу чения дезоксинуклеозидов пиримидинового ряда Синтез пуриновых нуклеозидов сопряжен с более значительными трудностями, требует применения разнообразных методов и подходов, что делает его особенно привлекательным для многих химиков-органиков. Исследованиям в области синтеза пуриновых дезоксинуклеозидов и посвящен настоящий обзор.

Синтез дезоксинуклеозидов путем модификации рибофуранозной части молекулы

В большинстве случаев создание дезоксирибофуранозного цикла в нуклеозидах достигается путем восстановления групп, содержащих галоген или серу в 2 - или 3 -положении рибозного кольца, а также путем восстановления двойной связи в сахарной части молекулы. Наиболее широкое применение метод восстановления двойной связи получил в синтезе 2 ,3 -дидезоксинуклеозидов (схема 3). Восстановлением 2 ,3 -дидезокси-2 ,3 -дегидроаденозина 15 на палладиевом катализаторе был с 67% выходом получен 2 ,3 -диде 45 46 зоксиаденозин 16 . Аналогичные результаты были получены при АС использовании никеля Ренея . Синтез олефина 15 был осуществлен из 3 -О-тозил-2 -дезоксиаденозина под действием этилата натрия в этаноле с 52% выходом или метилата натрия в ДМФА с выходом 60% . Было высказано предположение, что реакция отщепления п.-толуолсульфоновой кислоты протекает по механизму Е2 .

В некоторых случаях наряду с образованием олефина 15 наблюдалось об разование ряда побочных соединений, которые не были выделены, но, предположительно, одному из них была приписана структура 17 . Метод синтеза 3 -дезокеиаденозина восстановлением соединения 20, полученного действием основания на производное 18 по схеме 47 4,был предложен Нагпалом и соавт. , 3 -Дезоксиаденозин был синтезирован в смеси с 9-(3-дезокси- -ь-трео-пентафуранозил)аденином 19 в соотношении 1,5:1. Изомеры были успешно разделены на ионообменной смоле. Наиболее простым методом введения заместителей в рибофураноз-ное кольцо с целью их последующего восстановления на первый взгляд является простое замещение гидроксилов в 2 - или 3 -положении. Однако, подобные реакции замещения, протекающие по механизму Sjj2 идут с чрезвычайным трудом. Для успешного замещения необходима прежде всего активная уходящая группа. В качестве таких уходящих групп могут быть использованы мзо , Tso или Nso -группы. В самой ранней работе этой серии описан синтез 3 -дезокеиаденозина восстановлением 9-(3-иод-3-дезокси--Б-ксилофуранозил) аденина 21, полученного при обработке йодистым натрием 9-(3-0-нозил-з-г -рибофуранозил)аденина 22 . Метансульфонильная активация 2 -положения арабинофуранозиладенина 23 была применена для » » » » синтеза 2 -хлоро-2 -дезокси-3 ,5 -ди-0-тетрагидропираниладенозшіа 24, полученного с выходом 31% . Попытки заменить TsO -группу АО. на иод не увенчались успехом , что говорит о более высокой активности NsO -группы в реакциях нуклеофильного замещения. Замещение Tso -группы на этилтиогруппу было успешно использовано » » » » для синтеза 2 ,3 -дидезоксиаденозина, 2 ,5 -дидезоксиаденозина » » » и 2 ,3 ,5 -тридезоксиаденозина из природного 2 -дезоксиаденози-на ои»0і. Установлено, что замещение вторичного 3 -гидроксила протекает на 25$, а первичного 5 -гидроксила на 60%,

Данные о более легком нуклеофильном замещении первичных гидроксилов по сравнению со вторичными подтверждается на примере замещения з\5 -ди-0-тозил-2 -дезоксиаденозина 25 . При 5 С с 50% выходом образуется 3 -О-тозил-5 -этилтио-2 ,5 -дидезоксиаденозин 26; дальнейшая реакция при температуре кипения приводит к дизамещен-ному производному 27. Перспективным является применение трифторметансульфониль-ной активации ( Tf l), существенно облегчающей реакции нуклеофиль-ного замещения подобного типа . Ранганатаном изучена сравнительная активность метансульфонатов, трифторметансульфона-тов и п-нитробензолсульфонатов, причем активирующие группы находились в 2 -положении арабинофуранозиладенина. Установлено, что метансульфонаты и п-нитробензолсульфонаты не вступают в реакцию с азидом лития в ДМФА или ДМСО, а в гексаметилтриамиде фосфорной кислоты дают рибо-цроизводное с очень низким выходом. С фторидом лития и тетрабутиламмоний фторидом эти соединения не реагируют ни при каких условиях. 9-(2-0-Трифторметансульфонил-3,5-ди-0-тетрагидропиранил-іЗ-і -арабинофуранозил)аденин 28 легко реагирует с нуклеофилами, вступая в превращения, отображенные на схеме 5. При синтезе соединений 29-33 время реакций составило несколько минут, для получения 34 нужны часы. При действии на 28 тетрабутиламмоний фторида наряду с фтор-производным 35 (50%) образуется олефин 36 (30%). После восстановления 36 и удаления защитных групп полученная смесь аномеров 2 -дезоксиадено-зина была разделена хроматографией на смоле Дауэкс 50. Выход составил 4,5% для - и 2,1% для fo -аномера, считая на 28 . Трифторметансульфонаты рибо-ряда образуют соответствующие производные арабиноаденозина, реагируя с азидом лития (выход 61%), тиоацетатом калия (выход 88%)» ацетатом натрия (выход ЪЪ%) . з -Дезоксизденозш получен восстановлением 9-(2-ацетило-2-де-зокси- -о-арабинофуранозил)аденина 37. Трифлат 28 был использо-ван Икехарой и соавт. для получения 2 -галоген-2 -дезокси-jj-D-рибофуранозидов аденина 30- . Для получения разнообразных пуринових нуклеозидов и нукле-отидов, в том числе дезоксиряда, могут быть использованы пури-новые 8,2 -ангидро-8 леркапто- -о-арабинофуранозиды (8,2 -цикло-нуклеозиды). Методы синтеза этих соединений-, разработанные до 1969 г., суммированы в обзоре М.Икехары . 2 -Дезоксиаденозин и 2 -дезоксиаденозин-5 -фосфат были получены, исходя из 8,2 -ан-гидро-8-меркапто-9-(нз-Б-арабинофуранозил)аденин-5 -монофосфата 38 в соответствии со схемой 6. Десульфуризация 38 над нике-лем Ренея давала 2 -дезоксиаденозин-5 -фосфат, обработка которого фосфатазой приводила к 2 -дезоксиаденозину.

К такому же результату приводит первоначальная обработка 38 фосфатазой с последующим восстановлением над никелем Ренея. Превращения проте » кают через стадию образования 8,2 -циклоаденозина 39. Этой же группой исследователей был предложен синтез 2 -дезоксиаденозина последовательным восстановлением 8,2 -ангидро-8-меркапто-2-хлор-аденозина 40 сначала над никелем Ренея, а потом над палладием на угле . Удобным методом введения в углеводную часть молекулы ну-клеозида различных зшлестителеи, содержащих серу, являются внутримолекулярные реакции нуклеофильного замещения, т.н. реакции с участием соседних групп. Поскольку, как указывалось выше, прямое замещение гидроксилов рибозного кольца затруднено, реакции с участием соседних групп могут служить удобным синтетическим методом.

Синтез производных (Е)-5-(2-бромвинил) 2 -дезоксиуридина

Де Клерк и соавт. показали, что препарат ингибирует репликацию HSV 1 в 2 раза (1Д5(Р П-Ри концентрациях 0,004-0,02 мг/мл, а метаболизм нормальных клеток не подвергается изменению до тех пор, пока концентрация препарата не превысит ІД в 10000 раз (вирусологический индекс 10000) . Позже группа исследователей из ГДТ также показала активность BVDU против HSV 1 (ІДдф 0,06 TOR -0,22) и против вируса псевдобешенства (ІД50 0»02) х , По данным этой группы вирусологически! индекс препарата 1000. Хотя молекулярный механизм действия BVDU окончательно не установлен показано, что на первой стадии BVDU гоосфорилируется в инфециро-ванных вирусом клетках вирус-иншецированной тимидинкиназой - О »109. Далее происходит ингибирование вирус-индуцированной ДНК-полиме-разы 5 -трифосфатом BVDU . Изучение свойств этого 5 -трифос-фата как субстрата ДНК-полимеразы I из Е. coil показало, что 5 -трифосфат конкурирует за включение в растущую цепь ДНК с dTTP . Замещение тимидина на BVDU приводит к изменениям свойств вирус-ной ДНК и изменениям в репликации вируса х . Данные о включении 5 -трифосфата BVDU В растущую цепь ДНК позволили предположить, что 3 -модифицированные аналоги этого нуклеотида будут являться ценными инструментами для изучения ДНК-полимераз in vitro. В первую очередь представлял интерес терми-шторный аналог - 5 -трифосфат 3 -амино-2 ,3 -дидезокси-(Е)-5-(2-бромвинил)-уридина.

Использование этого вещества в реакции копирования ДНК по односпиральной матрице с использованием амино ттп аналогов в качестве терминаторов позволило бы определить, во всех ли звеньях новосинтезируемой ДНК происходит замена тимидина на BVDU. Для получения такого нуклеозид-5 -трифосфата прежде всего необходимо было синтезировать соответствующий нуклеозид, а лучше его 3 -азидоаналог, т.к. азидогруппа является удобным латен-том аминогруппы. Синтез 3 -азидо-2 ,3 -дидезокси-(Е)-5-(2-бром-винил)-уридина XXIX, наряду с другими производными BVDU , содержащими модификации в сахарной части молекулы, был описан в лите III тл ратуре "цхх. В описанном методе в качестве исходного соединения для синтеза был использован BVDU - вещество для нас трудно ТТО TTQ доступное и дорогостоящее ХІЛ»-1-1-С)Ф нами в качестве исходного соединения для синтеза был выбран 5-этил-2 -дезоксиуридин XXX, как более доступное и устойодвое соединение J14»115, Синтез осуществляли по схеме 5. Последовательное тритилирование, кезшшрование и обработка I эквивалентом щелочи нуклеозида XXIX позволяет без выделения промежуточных продуктов получить 3 , 2-0-ангидропроизводное XXXI аналогично методу, предложенному TTfi Фоксом и Миллером для тимидина х . При действии на ангидронук-леозид XXXI азида лития в ДША происходит размыкание цикла с образованием 3 -азидопроизводного ХХХУЇЇ, действие же избытка щелочи ведет к образованию ксилопроизводного ХХХП. Детритилиро-вание 75% уксусной кислотой при кипячении и последующая очистка колоночной хроматографией позволили получить азидонуклеозид ХШШ с выходом 64$ и ксилонуклеозид ХХХШ с выходом 88$. Действие уксусного ангидрида в пиридине на нуклеозиды ХХХШ и ХХХУШ приводит к соответственно 3 ,5 -ди-О-ацетильному производному ХХХІУ и 5 -0-ацетилъному производному XXXIX.

Превращение 5-этильного заместителя в 5-(2-бромвинильный) проводили методом радикального бромирования в условиях мягтай ТТ7 инициации инфракрасным облучением х . Выход на стадии бромирования составляет 65$. Очистку 5-(2-бромвинильных)-производных ХХХУ и XL проводили колоночной хроматографией на силикагеле и кристаллизацией. После удаления ацетильной защиты действием аммиака в метаноле ксило-производное ХХХУІ было получено в кристаллическом виде, а азидопроизводное ХХШ в виде масла, что III соответствует литературным данным . Анализ спектров ПМР бромвинильных производных ХХХУ, ХХХУІ, Хь и.ХХШ подтвердил, что нами были синтезированы соединения с Е-конфигурацией бромвинильного заместителя. Сигналы протонов винильнои группы представляют собой два дублета с КССВ J =13 Іц, что совпадает со значениями КССВ для Е-изомеров, полученными III 112 ранее J-LJ-fLX t Некоторые физико-химические характеристики 5-замещенных уридинов представлены в таблице 5, а данные спектров ПМР в таблицах 6 и 7. Попытки синтезировать XXIX прямой конденсацией сахара ХХЖ с (Е)-5-(2-брошшшО-урацилом окончились неудачей, поскольку при силилировании этого основания смесью гексаметилдисилазана с триметилхлорсиланом (9:1) наблюдалась деструкция основания. избытка тршетилсилилтрифторметансульфоната мы также наблюдали деструкцию основания. Таким образом,ввиду неустойчивости 5-(2-бромвинил)-урадила в условиях реакции гликозилирования по существующей методике азидонуклеозид XXIX может быть получен лишь путем последовательной модификации 5-замещенного уридина, содержащего остаток природной 2-дезоксирибозы. Использование же в качестве исходного соединения г -дезокси-б-зтилуридинаХХІХ вместо предложенного ранее BVDU позволяет существенно уменьшить материальные затраты и время работы и получить значительные количества необходимых 3 -модифицированных производных BVDU . » Для получения 2 -дезоксинуклеозид-5 -трифоофатов было использовано два различных подхода. 5 -Трифосфорилирование BVDU проводили в соответствии со схемой 6, через стадию получения 5 -монофосфата BVDU ХЫ. Так как углеводным фрагментом BVDU является остаток 2-дезоксирибозы, имеющий две свободные ОН-грул-пы, для получения хы был применен метод избирательного фос-форилирования под действием хлорокиси фосфора в триалкилфосфате, тто описанный в работе . Реакционную массу нейтрализовали раствором бикарбоната натрия, нуклеотид хы выделяли ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-сфероне. Трифосфат XLII был получен TTQ аналогично методу х .

Фосфатный остаток активировали яд»-карбонилдиимидазолом, а имидазолиднуклеотида вводили в реакцию с бис(три-н-бутил)аммониевой солью пирофосфорной кислоты в абс. ДМФА. Продукты реакции разделяли ионообменной хроматографией. Трифосфорилирование 3 -замещенных нуклеозидов I - ІУ, ХХІУ, ХЖ и XXIX проводили по схеме 7. Наличие только одного свобод ного гидроксила в 5 -положений молекул этих соединений позволяет применить для получения трифосфатов более жесткий метод повышающий выход конечного трифосфата и значительно снижающий затраты времени. Нами был использован один из многочисленных подходов -1-25, описанный Виноградовым и др. и использованный ими для синтеза нуклеозидов, модифицированных по гетероциклическому ядру. Хлорокись фосфора была превращена в фосфотрис(1,2,4-три-азолид), а затем (с 1 экв.морфолина) в морфолидо-бис(триазолид) ХШ. Этим реагентом ХШ фосфорилировали нуклеозид со свободным б -гидроксилом. Продукт фосфорилирования ХЫУ без выделения обрабатывали водой и бис(три-н-бутил)аммониевой солью пирофосфорной кислоты. Полученные 5 -трифосфаты хь У а-е выделяли ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-сфероне, используя для элюции линейный градиент аммонийбикарбонатного буфера (рН 7,5). Молярностъ буфера, при которой происходит элюция трифосфата, сильно зависит от типа соединения. В целом можно отметить, что нуклеотиды XLV д-е и XLVII с гидрофобными основаниями, такими, как бензимидазол и (Е)-5-(2-бромвинил)-урацил, элюировались более концентрированным буфером ( 0,7 М), чем нуклеотиды природного ряда ХІУ а-г (-0.3М). Ранее отмечалось, что при синтезе 5 -трифосфатов цитиди-новых аналогов возможно образование побочных продуктов, существенно уменьшающих выход конечных трифосфатов 120. Чтобы избежать этих нежелательных превращений авторы работы последовательно превращали азидонуклеозид П в монофосфат, ацетилировали полученный нуклеотид уксусным ангидридом и без выделения IT -ацетильного производного получали соответствующий 5 -трифосфат, как это тот было предложено для подобного аналога риборяда . Поскольку

Синтез нуклеозид-5 -трифосфатов

Как видно из схемы 7 при синтезе 5 -трифосфатов аминонук-леозидов латентом аминогруппы служила азидогруппа. Восстановление азида до амина проводили трифенилфосфином в смеси пиридин-аммиак. 5-Бромвинильная группировка соединения ПУе остается в данных условиях без изменений, о чем свидетельствует полная идентичность УФ-спектров ХІУе и ХІУІе. Выход и физико-химические характеристики полученных нук-леотидов приведены в таблице 8.

Полученные модифицированные нуклеозид-5 -трифосфаты исследуются в бесклеточной системе синтеза ДНК, катализируемого различными ДНК-полимеразами (см.приложение). Все органические растворители были высушены и перегнаны по стандартным методикам. Растворы веществ в органических растворителях высушивали над безводным сернокислым натрием. Растворители упаривали в вакууме при 20 - 25С и 12 или I мм рт.ст. (в зависимости от температуры кипения растворителя). 1,2; 3,5-Ди-0-изопропилиден-с(-с-ксилофуранозу получили по мето 702 ду , 1,2-ди-0-ацетил-3-азидо-3-дезокси-5-0-толуил-/і-В-ксило-фуранозу и з -азидо-З -дезоксиаденозин - по методу . 1-(3,5-ди-0-ацетил-2-дезокси--о-рибофуранозил)-5-зтилураіщл и 1-(2-дезокси-Р-в-рибофуранозил)-5-бромвинилурацил любезно предоставлены д-ром Германом (ЦИМБ АН ГДР), 3 -фтор-3 -дезоксити-мидин - д-ром фон Янта-Липинским (ЦИМБ АН ГДР). В работе использованы нуклеиновые основания фирмы "sigma" (США), к,ц» -карбовжвдиимидазол фирмы " Ferak" (ФРГ), азид натрия и мезилхлорид фирмы "Merck " (ФРГ), гидрид натрия в масле фирмы "serva " (ФРГ), трифенилфосфин и гексаметилдисилазан фирмы " Lachema " (ЧССР), ангидрид трифторметансульфокислоты, триметилсилилтрифторуїетансульфонат, три-н-бутилстанна и три-азол фирмы "piuka " (Швейцария). Были использованы дауэкс 50 х 8 (100-200 меш) и дауэкс 1x4 (100-200 меш) фирмы "Sigma" (США), силикагель 40/100 фирмы "Chemapol " (ЧССР), сферой ДЭАЭ фирмы "Lachema " (ЧССР) И ТОЙОПерл ДЭАЭ фирмы "Toyoaoda" (Япония). ВЭЖХ ПРОВОДИЛИ На ЖИДКОСТНОМ Хроматографе "Du Pont 8800 "» (США). Для нуклеозидов использовали колонку "Hypersil ODS ", 5 мкм ("Sohandon ", Англия) размером 0,46 х 25 см при скорости потока I мл/мин. Элщию проводили линейным градиентом метанола " Beckman " (США) И Ш СПЄКТрОфОТОМЄТрЄ " Specord W " (ІДР). Масс-спектры Сахаров были получены на спектрометре "СН-5 varian МАТ" (США) при температуре испускания 80-90С и температуре ионизирующей камеры 220С; масс-спектры нуклеозидов - на приборе "MS 902S, AEI, Manchester " (США). Спектры IMP регистрировали на спектрометре "varian XL-юо-15" (США) с рабочей частотой 100 МГц и "Brucker-Spectrospin " (США) с рабочей частотой 360 МГц, используя тетраметилсилан в качестве внутреннего стандарта. Величину удельного вращения определяли на поляриметре "perkin -Elmer 241" (США) в метаноле. Элементные анализы были выполнены на СДіт - анализаторе "Hewlett-Packard" (США).

Кристалли-ческие вещества высушивали в вакууме над Р2О5 при 12 мм рт.ст. и 50-Ю0С (в зависимости от т.пл.вещества).-Маслообразные вещества растворяли в метаноле, центрифугировали, супернатант упаривали и сушили в вакууме при 60С и I мм рт.ст.. Шифры соединений соответствуют главе П (обсуждение результатов). аденин (ХП). Нуклеозид IX (880 мг, 3 ммоль) растворяли в 70 мл пиридина и охлаждали до 0С. К раствору добавляли мезилхлорид (3 мл, 30 ммоль) и оставляли на 18 ч при 4С. Реакционную массу выливали в 300 мл воды со льдом, экстрагировали хлороформом (5 х 70 мл), экстракты объединяли, сушили и упаривали. Полученный димезилат X (выход 1,28 г (95%), Rf 0,63 (В)) растворяли в 50 мл ДМФА, вносили п-толуилат лития (1,8 г, 12 ммоль) и нагревали с перемешиванием 1,5 ч при при 80С. Реакционную массу вы