Введение к работе
Актуальность проблеми. В связи с интенсивным развитием генетической инженерия я биотехнологии возрастает практическое использование синтетических ДНК в качестве искусственных генов биологически активных пептидов и белков, регуляторних участков геноме, зондов и т.д.
Одним из перспективних методов получения протяженных ДНК дуплексов, а также дуплексов с различными точечными модификациями является метод химического лигирования (ХЛ), который заключается в сборке двуспиральных ДНК путем конденсации олигонуклеотидных блоков на комплементарной матрице под действием химических реагентов. Значительное снижение требований к структуре субстратов при ХЛ (по сравнению с ферментативным лигированием) открывает возможность введения широкого круга модификаций (неприродные меж-нуклеотидные связи, точечные модификации оснований и углеводофос-фвтного остова) в ДНК-дуплексы в процессе их сборки в водных растворах. Оде одним преимуществом метода ХЛ при использовании в качестве конденсирующего агента бромистого циана (BrCN) является высокая скорость реакции (время реакции - 1 минута).
Для различного рода исследований в области физико-химической биологии все чаще требуются значительные количества ДНК. При получении препаративных количеств ДНК преимущество химического способа лигирования над ферментативным становится очевидным, так как стоимость химических роагентов (напр., карбодиимида или BrCN) на 3 порядка ниже по сравнению с Т4-ДНК-лигазой.
В связи с этим представлялось целесообразным' оценить возможности метода ХЛ для получения протяженного ДНК-дуплекса (гена) и изучить биологическую активность такого гена In vitro и tft vivo.
Цель работы. Работа посвящена использованию метода BrCN-индуцируемого химического лигирования для получения функционально-значимого протяженного ДНК-дуплекса: разработке стратегии сборки, определению факторов, влияющих на ее эф1»зктивность, изучению биологической активности полученного гена In vitro и In vivo.
Научная новизна'и практическая ценность работы. Впервые лро-вэдона полностью неэнзиматическая сборка функционально-значимого фрагмента ДНК. Показано, что в процессе сборки по происходит мутаций нуклеотидного материала. Биологическая активность синтезированного исключительно химическими методами гена In vitro п In
vtvo демонстрирует возможность использования метода ХЛ при сборке
генов.
Показано, что одним из основных факторов, определяицих эффективность образовашя новой межнуклеотидной связи, является природа иуклеотидов в участке "сшивания". Обнаружена корреляция между эффективностью ХЛ в зависимости от природи иуклеотидов в участки "сшивания" и локальными сиквонс зависимыми изменениями параметров ДНК (литературные дашше). НаиОолее ярко эта корреляция проявляется в дуплексах, где акцептором 3'-фосфата является 5'-гидроксильная группа. Выявлена общая для ВгСН и водорастворимого карбодиимида зависимость эффективности ХЛ от структуры реакционного узла. Предложены практические рекомендации наиболее рационального планирования разбивки целевой последовательности на фрагменты для проведения эффективного ХЛ.
Методом ХЛ с выходами 2-69* получен широкий набор ДШ-душшксов, содержащих некомшшментарныв нары основания и цирофос-фатные межнуклеотидные связи.
Публикации и апробация работы. Но материалам диссертации опубликовано 10 работ. Результаты исследования докладывались на конференции молодых ученых химического факультета МГУ (г. Москва, 1989), VII Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных веществ (г. Рига, 1989), VII Международном симпозиуме по химии компонентов нуклеиновых кислот (г. Бехин. Чехословакия, 1990). I Всесоюзной конференции "Геном человека" (Москва, 1990), Международной конференции по химии нуклеиновых кислот (Япония. 1990), Международном симпозиуме "Синтетические олигонук-леотидц: проблемы и перспективы практического применений" (г. Москва, 1991), II Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и приклад-нив аспекты молекулярной биологии (г. Самарканд, 1991).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на && страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения рьзультатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы (Л'С? ссылок), содержит *2?~рисунков и 7 таблиц.
Похожие диссертации на Оптимизация метода химического легирования при сборке протяженных ДНК. Синтез гена
