Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 4
ДНК-сенсоры на основе углеродных и золотых электродов. Детекция гибридизации и структурных дефектов ДНК электрохимическими методами
1.1. Введение 4
1.2. Принципы основных электрохимических методов, упоминаемых далее в тексте . Иммобилизация ДНК на углеродных электродах 10
1.4.1. Иммобилизация ДНК прямой адсорбцией 10
1.4.2. Нековалентная иммобилизация ДНКметодолі приложения потенциала 14
1.4.3. Ковалентная иммобилизация ДНК на поверхности электрода 16
1.5. Детекция ДНК на углеродных электродах 20
1.5.1. Детекция с использованием электрохимических индикаторов 20
1.5.1.1. [Co(phen)3J3+ 20
1.5.1.2. [Со(Ыру)3]3+ 23
1.5.1.3. Дауномиции 24
1.5.1.4. [0$04,Ыру] 29
1.5.1.5. Метиленовый синий 31
1.5.2. Прямая детекция по пикам окисления гетероциклических оснований 34
Иммобилизация ДНК на золотых электродах 40
1.6.1. Самоорганизующиеся моиослои на золотых поверхностях 40
1.6.2. Ковалентное связывание ДНК с предварительно сформированными 42 самоорганизующимися монослоями бифункциональных соединений
1.6.3. Формирование монослоев тиолсодержагцей ДНК 45
1.6.4. Образование монослоев ДНК, содержащих тиофосфатные диэфирные связи. 2
1.7. Детекция ДНК на золотых электродах 52 1,7.1. Детекция с использованием электрохимических индикаторов 52 1.7.1.1. Детекция с использованием метиленового синего 1.8. Заключение 61
2. Обсуждение результатов 64
Синтез олигонуклеотидов с гидрофобными заместителями и их применение для детекции повреждений в ДНК
2.1. Цель работы 64
2.2. Химическая модификация олигонуклеотидов. Методы введения гидрофобных остатков в олигонуклеотиды для ковалентной и нековалентной иммобилизации
2.2.1. Синтез олигонуклеотидов, содержащих остатки олеиламина 66
2.2.2. Получение и свойства олигонуклеотидов, содержащих линкер с сулъфгидрилъной группой на 5 -конце
2.3. Свойства олигонуклеотидов, содержащих остатки олеиламина 76
2.3.1. Исследование термической стабильности дуплексов, образованных модифицированными олигонуклеотидами
2.3.2. Устойчивость олигонуклеотидов с остатками олеиламина к ферментативному гидролизу
2.3.3. Ферментативное лигирование олигонуклеотидов, содержащих остатки олеипамина
2.3. ЗА. Ферментативное лигирование олигонуклеотидов в водных растворах в 83
отсутствие липосом
2.3.3.2. Ферментативное лигирование олигонуклеотидов в присутствии липосом 85
2.3.4. Влияние олигонуклеотидов с гидрофобными заместителями на свойства 89
фосфолипидных монослоев на границе раздела вода-воздух
2.4. Создание прототипа ДНК-биосенсора для детекции точечных повреждений в 97
ДНК-дуплексах
2.4.1. Иммобилизация олигонуклеотидов на поверхности золотого электрода 98
2.4.2. Выбор электрохимического индикатора и метода анализа 100
2.4.4. Определение наличия и количества АП-сайтов в двухцепочечной ДНК 104 методом дифференциальной импульсной волътамперометрии
2.4.5. Определение наличия дезаминированпых оснований в двухцепочечной ДНК 109
3. Экспериментальная часть 113
3J. Материалы и методы 113
3.2. Синтез олигонуклеотидов 114
3.3. Синтез модифицированных звеньев для введение в олигонуклеотиды 115
3.4. Определение кинетических параметров ферментативного гидролиза 119 олигонуклеотидов (Ш) и (IX) ФДЭ змеиного яда
3.5. Липосомы диолеилфосфатндилхолипа 120
3.6. Ферментативное лигирование олигонуклеотидов 120
3.7. Изотермы зависимости поверхностного давления от площади поверхности 120
3.8. Создание монослоев тиолсодержащих олигонуклеотидов на золоте 121
3.9. Электрохимическая детекция метиленового синего и ферроцианида калия на 122 ДНК-модифицироваиных электродах
Выводы 123
4. Список литературы 124
- Нековалентная иммобилизация ДНКметодолі приложения потенциала
- Формирование монослоев тиолсодержагцей ДНК
- Получение и свойства олигонуклеотидов, содержащих линкер с сулъфгидрилъной группой на 5 -конце
- Изотермы зависимости поверхностного давления от площади поверхности
Введение к работе
Актуальность проблемы Область исследований, посвященных ДНК и ее роли в биологических процессах, находится в стадии интенсивного развития и требует создания новых, все более совершенных методов генной детекции Область применения таких методов различна - от диагностики точечных мутаций, связанных с наличием в организме наследственных заболеваний, до выявления ДНК патогенных микроорганизмов, присутствие которых в пищевых продуктах необходимо контролировать Наиболее часто для определения наличия в исследуемом образце ДНК заданной последовательности используется ее способность к гибридизации с комплементарным фрагментом, иммобилизованным на поверхности сенсора Существует широкий спектр материалов, используемых при изготовлении сенсоров Иммобилизация фрагментов ДНК на различных поверхностях с целью создания биосенсоров представляет, таким образом, интенсивно развивающееся и перспективное направление в химии нуклеиновых кислот
Целью настоящего исследования являлась разработка новых методов детекции нарушений в структуре ДНК-дуплексов с использованием модифицированных олигонуклеотидов В этой связи требовалось провести синтез и изучение свойств синтетических олигонуклеотидов, содержащих гидрофобные заместители двух типов -олеиламина в произвольном положении олигонуклеотидной цепи и меркаптододеканола на 5 -конце, которые будут использоваться для нековалентной иммобилизации на гидрофобных поверхностях, а также для ковалентной иммобилизации на золотых электродах Важная часть работы посвящена демонстрации практического применения синтезированных олигонуклеотидов для детекции ДНК
Научная новизна и практическая ценность В ходе работы впервые синтезированы олигонуклеотиды, содержащие остатки олеиламина в составе гетероциклических оснований и меркаптододеканола на 5 -конце Отработаны условия хроматографической очистки продуктов с использованием гидрофобных свойств введенных заместителей Определена устойчивость модифицированных олигонуклеотидов к нуклеазной деградации, изучена термическая стабильность дуплексов и влияние липосом диолеилфосфатидилхолина на их образование, изучена возможность детекции нарушений в ДНК-дуплексах по изменению термодинамических характеристик липидных монослоев, с которыми связывались модифицированные олигонуклеотиды С использованием иммобилизации серосодержащих олигонуклеотидов создан прототип электрохимического сенсора для детекции некомплементарных пар оснований в составе ДНК-дуплексов на основе золотых электродов
Публикации и апробация работы По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ Результаты настоящего исследования были представлены на международных конференциях "Trends in Nucleic Acid Chemistry" (Москва, ноябрь 2000 г), 7th Ibn Sma International Conference on Pure and Applied Heterocyclic Chemistry, 2000, March, 25-28, Alexandria, Egypt, Vll-th International Congress on Bioelectrochemistry and Bioengineenng, 2001, Bratislava, Slovakia
Структура диссертации и объем работы Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, посвященного ДНК-сенсорам на основе углеродных и золотых электродов, детекции гибридизации и структурных дефектов ДНК электрохимическими методами, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (140 ссылок), содержит 40 рисунков, 17 схем, 13 таблиц
Нековалентная иммобилизация ДНКметодолі приложения потенциала
Различные углеродсодержащие материалы широко используются при создании электрохимических детекторов для количественного и качественного определения ДНК. Наиболее распространены графитовая паста [16,32-36] и трафаретные графитовые электроды, полученные нанесением различных углеродсодержащих слоев на подложки трафаретным способом [37-40]. Кроме того, в качестве материала для электрода могут выступать графитовая ткань [41] и стеклоуглерод [34,42-50]. Для последнего показана невозможность использования при проведении прямой электрохимической детекции ДНК [42]. Однако, данный материал удобен для ковалентной иммобилизации исследуемой ДНК [51], а также для осуществления электрополимеризации на нем окислительно-восстановительных гидрогелей для последующей иммобилизации ДНК-проб [52], Ниже рассмотрены основные методы связывания ДНК с поверхностью углеродных электродов и проведено сравнение эффективности и удобства используемых методов.
При нековалентной иммобилизации ДНК на углеродной поверхности основную роль играют, вероятнее всего, гидрофобные взаимодействия гетероциклических оснований с поверхностью электрода. В большинстве работ раствор, содержащий ДНК для иммобилизации, концентрируют высушиванием на электродной поверхности, при этом, вероятнее всего, происходит связывание гетероциклических оснований с поверхностью углерода за счет Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий. Материал электрода влияет на эффективность адсорбции, поэтому интересным представлялось сравнение условий, используемых для иммобилизации ДНК на различных по структуре поверхности углеродных электродах.
Трафаретные электроды с графитовым напылением использовали в работе Бучковой [39] для детекции повреждений в ДНК, а также аптиоксидантов, предотвращающих возникновение таких повреждений. Для иммобилизации раствор ДНК наносили на поверхность трафаретных графитовых электродов и оставляли для высыхания на 8 часов. Таким образом на поверхности электрода удавалось получить стабильный тонкий (-100 мкм толщиной) слой двухцепочечной ДНК из тимуса теленка.
В работе Фойты [53] для эффективной иммобилизации аддуктов ДНК с комплексом OsCVbipy на электродах на основе пиролитического графита оказалась достаточной прямая адсорбция из буферного раствора в течение 1 мин. Стеклоуглерод использовался в качестве материала для электродов в работе Ченга [43]. Для получения стабильного слоя одно- или двухцепочечной ДНК из тимуса теленка на стеклоуглероде, ее раствор высушивали па поверхности электрода и выдерживали электрод в дистиллированной воде в течение 24 часов, удаляя неадсорбированную ДНК. Авторами установлено, что в случае предварительного окисления стсклоуглсрода раствором НЫОз/КгСггС при потенциале +1,6 В (отн. СГЭ) поверхностная плотность как одно-, так и двухцепочечной ДНК в несколько раз превышала максимальную плотность монослоя. В этой связи авторы делают вывод, что окисление в указанных жестких условиях вызывало значительные изменения в структуре поверхности стеклоуглерода, в частности, увеличение шероховатости. Термическая устойчивость слоев адсорбированной на стеклоуглероде ДНК уменьшалась в ряду дцДНК/окисленный стеклоуглерод онДНК/окисленный стеклоуглерод » оцДНК/стеклоуглерод дцДНК/стеклоуглерод. Даже при нагревании в буферном растворе до Ю0С в течение 3-5 мин слой ДНК на окисленном стеклоуглероде сохранялся. Таким образом, методом иеспецифической адсорбции оказалось возможным получить стабильный электрод с прочно адсорбированной ДНК. Авторами указывается, что слой нековалентно иммобилизованной ДНК был неустойчив к действию 0,2 М NaOII, однако выдерживал действие 1 М раствора НС1 в течение 44 часов. Следует отметить, что в указанных условиях происходит апуринизация ДНК, в результате которой нарушается структура дуплексов и одноцепочечных фрагментов ДНК, поэтому вызывает сомнение пригодность таких электродов для дальнейших измерений.
Среди особенностей неспецифической адсорбции ДНК на углероде авторы отмечают необходимость полного высушивания раствора ДИК на поверхности. Объясняется это необходимостью исчезновения гидратной оболочки вокруг оснований, которые при этом более эффективно взаимодействуют с поверхностью углерода за счет Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий. Обратный процесс, регидратация, оказывается затрудненным, и в результате слой ДНК на графите оказывается стабильным, в частности, к промывкам и нагреванию. Была показана невозможность дальнейшей гибридизации одпоцепочечной ДНК, прочно связанной основаниями с поверхностью стеклоуглерода за счет гидрофобных взаимодействий, с комплементарными фрагментами из раствора. В случае, когда на поверхности иммобилизовали дуплекс, его разрушение для восстановления слоя одноцепочечной ДНК проводили погружением в раствор, нагретый до 100С [43]. Авторы отмечают необходимость исключения условий, благоприятных для неспецифической нековалентнои адсорбции, при использовании другого метода иммобилизации, ковалентного взаимодействия молекул ДНК с поверхностью.
В работе Оливейры Бретт [45] иммобилизацию двухцепочечных фрагментов ДНК на стеклоуглеродных электродах проводили высушиванием капли раствора ДНК в ацетатном буфере. В результате, на небольшом по площади стеклоуглеродном электроде (d=7 мм) образовывался практически однородный слой ДНК толщиной 0,1 мм. Метод прямой адсорбции из раствора также использован для получения тонкого слоя ДНК на поверхности стеклоуглеродного электрода в работах [48,49]. С этой целью раствор целевой ДНК в ацетатном буфере оставляли на поверхности электрода до полного высыхания.
Хю и соавт, [33] использовали в качестве материала для электрода графитовую пасту, покрытую бромидом цетилтриметиламмония (ЦТАБ). Данный реагент модифицировал поверхность электрода, образуя компактный монослой, характеризующийся высокой плотностью положительного заряда, причем заряженные группы оказываются экспонированными в раствор (рис. 1.1).
Формирование монослоев тиолсодержагцей ДНК
Было показано, что пик восстановления метиленового синего был существенно выше в случае электрода, на котором были иммобилизованы фрагменты одноцепочечной ДНК. В случае чистых электродов, а также электродов, на поверхности которых изначально или благодаря гибридизации находилась двуспиральная ДНК, сигнал метиленового синего был существенно меньше. Графитовые электроды с этой точки зрения существенно отличаются от золотых, для которых увеличение сигнала метиленового синего в результате связывания с двухцепочечной ДНК используется при детекции гибридизации и наличия однобуквенных несоответствий. Вероятно, причины столь различного поведения индикатора по отношению к одно- и двухцепоченой ДНК связаны с ее ориентацией относительно поверхности электрода - горизонтальной при связывании с углеродом и практически вертикальной при образовании монослосв на золотом электроде (подробно см. ч. 1.6.3). Авторами [34] показано, что существует минимальное значение сигнала метиленового синего, соответствующее определенной концентрации ДНК-мишени в растворе, при увеличении которой происходила адсорбция избытка одноцепочечной ДНК на поверхности электрода. Связывание метиленового синего с такими негибридизованными фрагментами приводило к увеличению пика его восстановления распространены комплексы кобальта с ароматическими полиядерными молекулами. Природа взаимодействия таких комплексов с ДНК зависит от ионной силы (при высоких значениях / это, в основном, интеркаляция, тогда как при низких / молекулы взаимодействуют в основном за счет электростатического притяжения), что может использоваться исследователями для выборочной детекции одноцепочечной ДНК. и дуплексов. Использование индикаторов совместно с электродами на основе углеродных нанотрубок позволяет добиться существенного увеличения чувствительности и воспроизводимости аналитических методов детекции ДНК. Механизм взаимодействия с ДНК рассмотренных комплексов переходных металлов и других электрохимических индикаторов, а также природа детектируемой ДНК представлены в табл. 1.3.
Основным сигналом, используемым при детекции ДНК по пикам окисления собственно гетероциклических оснований, является пик гуанина. Потенциал его окисления (1,3В отн. СВЭ) существенно ниже значений, при которых происходит окисление остальных ДНК-оснований (dA (1,4 В), dC (1,6 В), и dT (1,7 В). Пониженное значение потенциала является преимуществом при амперометрической детекции, однако влияет на то, что гуанин является наиболее уязвимым местом при окислительных повреждениях ДНК [69,70].
Проводящие свойства слоя ДНК па поверхности электрода описываются двумя различными механизмами - электронным и ионным. Электронная проводимость осуществляется за счет стопки из пар оснований, в которой к-система в случае совершенного дуплекса является общей для всего дуплекса [71,72]. Этот случай неприменим для одноцепочечных фрагментов и реализуется в случае вертикальной ориентации дуплекса на поверхности, как, например, на золотых электродах, покрытых слоем тиолсодержащей ДНК (см. ч. 1.6.3). Отмечено, что при адсорбции двухцепочечиой ДНК на углеродных электродах продольная ось двойной спирали оказывается параллельной поверхности, и пары оснований, таким образом, расположены вертикально [73]. Вероятно, в случае, когда цепь ориентирована параллельно, реализуется второй тип проводимости, ионный, когда переносчиками заряда выступают ионы натрия и другие катионы из числа противоионов фосфатных групп ДНК. В последнем случае играет роль лишь полиэлектролитная природа ДНК, тогда как наличие совершенной двуспиральной структуры, необходимой для формирования непрерывных межплоскостных стэкинг-взаимодействий оснований, необязательно. Подтверждает данный тип проводимости тот факт, что слои ДНК на углероде обладают хорошей проводимостью несмотря на доказанное участие гетероциклических оснований в гидрофобном связывании с поверхностью.
Группой под руководством Ванга [16] наличие гибридизации с исследуемым образцом фиксировалось прямым хронопотенциометрическим анализом, по появлению пика окисления гуанинов (ЕР=+1,01В) целевой последовательности. Для сравнения авторами проведено исследование процесса гибридизации с использованием электрохимического индикатора [Со(рпеп)э]3+, изначально регистрируемый сигнал которого растет при возникновении гибридизации на поверхности электрода. Преимущества безиндикаторного метода по сравнению с традиционным использованием электрохимических индикаторов заключаются в общем упрощении системы детекции и отсутствии фонового сигнала сенсора. Предел детекции 27-звенного олигонуклеотида при времени гибридизации 4 минуты составил 120 нг/л. Пик окисления гуанина возникал и при наличии в исследуемом растворе некомплементарной последовательности, однако в случае комплементарного олигонуклеотида сигнал был в 400 раз интенсивнее, что позволяет говорить лишь о несущественном влиянии неспецифической адсорбции. Авторами [16] рассмотрена возможность усовершенствования предложенного метода путем изменения условий гибридизации, минимизации неспецифической адсорбции, а также за счет использования иммобилизованных пептидо-нуклеиновых кислот (ПНК) для повышения эффективности процесса гибридизации.
Электроды на основе графитовой пасты использовались Вапгом [32] для детектирования ароматических аминов (производных ди- и поли циклических конденсированных аренов), способных иптеркалировать в двойную спираль ДНК. Наряду с изменением сигнала окисления гуанина в результате интеркаляции на хронопотепциограмме возникали пики аминов - интеркаляторов, регистрируемые уже при концентрациях порядка 0,1 мкМ.
Этим же коллективом под руководством Ванга в работе [54] в качестве метода детекции ДНК на карандашном графите предлагается использовать высокочувствительный метод инверсионной потенциометрии. Пик анодного окисления гуанина при +0,96В использовался в качестве электрохимического сигнала. Проведено сравнение эффективности этого метода анализа ДНК на стандартно используемых электродах из графитовой пасты и стеклоуглерода с детекцией на предложенном авторами карандашным графите.
Получение и свойства олигонуклеотидов, содержащих линкер с сулъфгидрилъной группой на 5 -конце
Авторы отмечают, что эффективность электронного транспорта с участием двухцепочечной ДНК оказывается очень высокой, поскольку скорость переноса заряда от поверхности электрода к метиленовому синему, связанному в произвольных местах дуплекса (в случае предварительного насыщения дуплексов индикатором) и в концевых частях, максимально удаленных от поверхности, практически не различима [96].
В работе Тани и соавт. [122] авторы также отмечают сдвиг потенциала пиков метиленового синего на квадратно-волновой вольтмаперограмме для ДНК-модифицированного золотого электрода по сравнению с чистой золотой поверхностью. Однкао, при этом сигнал метиленового синего на электроде, содержащем иммобилизованный одноцепочечный олигонуклеотид, был смещен в положительную область на 10-15 мВ по сравнению с дуплексом. Дифференциальная импульсная вольтамперометрия с использованием индикатора метиленового синего применялась Керманом в работе [93] для определения наличия ковалентно иммобилизованной одно- и двухцепочечной ДНК на поверхности сенсора, покрытого монослоем 3-меркаптопропионовой кислоты. Основной закономерностью, отмеченной авторами, является уменьшение сигнала метиленового синего на дифференциальной импульсной вольтамперограмме при образовании дуплекса (рис. 1.17)
Дифференциальная импульсная волътамперограмма метиленового синего на золотом электроде, содержащем (а) иммобилизованные одноцепочечные олигонуклеотиды и (Ь) - после гибридизации с комплементарными фрагментами ДНК [93].
Кроме того, авторы [93] исследуют роль аминогрупп гетероциклических оснований при связывании с метиленовим СИНИМ. Выяснилось, что при замещении всех остатков гуанина на инозин пик метиленового синего был ниже, что указывает на участие аминогрупп в связывании с индикатором. Тем не менне, связывание метиленового синего с дуплексом оказывалось достаточно сильным. Компьютерное моделирование взаимодействия индикатора с ДНК подробно описано в работе Энеску [123].
Вольтамперометрические характеристики метиленового синего, связанного с ДНК-модифицированным электродом, хорошо отражает исследование, проведенное Яу [107]. В данной работе методом циклической вольтамперометрии изучались электрохимические свойства метиленового синего и другого известного интеркалятора, доксорубицина, на ДНК-модифицированном золотом электроде. Помимо слоя ДНК, на электроде формировали слой гексадецшшеркаптана, который полностью блокировал доступ к поверхности, и, соответственно, электрохимические процессы с участием гидрофильного доксорубицина, тогда как в случае гидрофобного метиленового синего оказывалось возможным диффузионное проникновение электрохимического индикатора в гидрофобный слой.
Циклические вольтампсрограммы метиленового синего (I) и доксорубицина (II) (а) перед и (Ь) посіє иммобилизации одноцепочечного 22-звенного HS-олигонуклеотида с последующей обработкой (с) гексадецилмеркаптаном на золотой поверхности [W7J.
Рис. 1.18 демонстрирует, что сигнал метиленового синего (I) при -0,3В лишь незначительно уменьшался для ДНК-модифицированного электрода, покрытого гидрофобным слоем, по сравнению с электродом, содержащим лишь фрагменты ДНК, тогда как в случае доксорубицина (II) пик полностью исчезал. Авторы [107] отмечают, что окислительно-восстановительный процесс с участием метиленового синего существенно ускоряется в присутствии иммобилизованных как одно-, так и двух цепочечных фрагментов ДНК. Однако возможность интеркаляции в двойную спираль и переноса заряда с участием ДНК повышают значение тока окисления-восстановления метиленового синего по сравнению с одноцепочечной ДНК. Указанные данные находятся в противоречии с данными, полученными Керманом в работе [93], где авторы объясняют уменьшение тока окисления интеркалировавшего индикатора экранированием с участием заряженной двойной спирали ДНК-Группой Бартон [108] предложен подход, способствующий повышению эффективности отклика электрохимических индикаторов при детекции некомплсментарных пар. Авторы отмечают, что абсолютное значение электрохимического сигнала интеркалятора лимитировано максимальной поверхностной плотностью интеркалировавших молекул (-50 пмоль/см2). С целью получения более интенсивного отклика предложено использовать эффект электрокаталитического восстановления ферроцианида калия с участием индикатора метиленового синего, связанного с двойной спиралью ДНК на небольшом расстоянии от поверхности слоя [96]. Сам по себе, ферроцианид калия не дает электрохимического отклика на поверхностях, покрытых конденсированными монослоями ДНК. Метиленовый синий играет роль переносчика электронов, необходимых для восстановления ферроцианида калия, причем на циклической вольтамперограмме процесс выглядит практически необратимым.
В работе [108] показано, что такой метод удобен для определения однобуквенных замен в составе иммобилизованного дуплекса, причем по сравнению с пиком самого метиленового синего (уменьшение до 50% в случае наличия некомплементарного звена) пик ферроцианида на циклической вольтамперограмме уменьшается в 6 раз. Показано, что более сильно связанный с ДНК дауномицин менее эффективен в подобном электрокаталитичсеком процессе, тогда как достаточно активный электрокатализатор [Ru(NH})5Cl] + не мог использоваться для детекции некомплементарных пар.
В работе Бартон [124] изучена возможность переноса заряда через двойную спираль ДНК/ДНК и ДНК/РНК дуплексов в различных формах: А, В и Z. Исследования проводились методом вольтамперометрии с участием метиленового синего в качестве электрохимически активного интеркалятора. Показано, что электрохимический сигнал восстановления метиленового синего практически не отличался для А и В-форм дуплеков, тогда как для Z-формы интенсивность пика была значительно ниже (рис. 1.19)
Изотермы зависимости поверхностного давления от площади поверхности
Среди методов детекции ДНК широко распространенными в силу своей чувствительности и универсальности являются методы, предусматривающие введение радиоизотопов или флуоресцентных меток. Альтернативу составляют методы прямой детекции ДНК на различных поверхностях, в частности, электрохимические, микрогравиметрические, а также методы, основанные на изменениях поверхностных свойств липидных монослоев. Основное достоинство последних в том, что изучение поведения ДНК на поверхности монослоев позволяет не только говорить о наличии гибридизации, но также дает возможность более глубоко понять особенности взаимодействия таких важных для человеческого организма биомолекул, как ДНК и липиды. Методы, несомненно, являются очень чувствительными, и с этой точки зрения представляют достойную альтернативу электрохимическим и иным методам детекции ДНК, в той или иной степени традиционным. В этой, достаточно новой области проводятся интенсивные исследования [3,136,137], однако, с нашей точки зрения, еще рано говорить об однозначных преимуществах или недостатках применения такого метода для детекции гибридизации ДНК.
Нам представлялось интересным изучить особенности гибридизации коротких фрагментов ДНК на поверхности мономолекулярных липидных слоев, образующихся на границе вода-воздух, а также влияние на гибридизацию ориентации олигонуклеотидных цепей на поверхности таких слоев. В качестве исследуемых фрагментов ДНК мы использовали 19-звенные олигонуклеотиды (табл. 2.1), модифицированные остатками олеиламина по З -концу (I), а также по обоим концам одновременно (III).
Данные модификации позволяли включать олигонуклеотиды в состав монослоев диолеилфосфатидилхолина, а также смешанных монослоев диолеилфосфатидилхолина (12) с октадециламином (13). В результате на границе раздела вода - воздух образовывался смешанный слой ДНК/липид. Наличие в составе концевого участка олигонуклеотидов длинного гидрофобного заместителя позволяло им встраиваться в гидрофобную часть монослоя, оставляя олигонуклеотид экспонированным в раствор и способным к гибридизации с комплементарной последовательностью (рис. 2.7).
Характеристикой поверхностного слоя являлась изотерма сжатия (поверхностное давление П - площадь поверхности А), регистрируемая для монослоя, сформированного методом Лэнгмюра (рис. 2.8).
Принцип метода измерения поверхностного давления монослоев Лэнгмюра Метод заключается в регистрации поверхностного давления на границе раздела фаз жидкость-воздух при постоянном сжатии монослоя в изотермических условиях. На классической изотерме слоя ацилфосфатидилхолина на водной поверхности [138,139] (рис. 2.9) различают три основных участка, соответствующих различным структурным состояниям монослоя. 70-1
С точки зрения упорядоченности и концентрации молекул мопослоя на поверхности можно провести аналогию с различными фазовыми состояниями вещества в объеме. В области I (рис. 2.9), являющейся аналогом газообразного состояния, молекулы свободно ориентированы в пределах монослоя, и при сжатии такой поверхности вплоть до определенного момента они практически не взаимодействуют друг с другом. Эта фаза характеризуется достаточно небольшим изменением давления при существенном изменении площади поверхности. При давлении порядка 7 мН/м монослой переходит в состояние II (аналогичное твердому состоянию в объеме), характеризующуюся плотной упаковкой молекул монослоя и их четкой ориентацией друг относительно друга. При этом гидрофобные «хвосты» максимально изолированы от водной фазы гидрофильными «головками» (рис. 2.8). Классический липидный монослой в этот момент характеризуется значительными изменениями поверхностного давления даже при небольших сжатиях, что отражается скачкообразным участком на изотерме. После некоторого предельного значения давления, составляющего для диолеилфосфатидилхолина 47 мН/м, происходит нарушение монослоя вследствие невозможности дальнейшего сжатия. Последняя фаза III характеризуется практически постоянным значением поверхностного давления, поскольку молекулы вынуждены перераспределяться, образуя неоднородные участки. По изотерме однородного слоя липида на чистой поверхности можно судить о площади, приходящейся на одну молекулу монослоя, которая в нашем случае составила 0,57±0,02 им . Указанное значение согласуется с данными, полученными ранее Филипсом [139]. Сдвиг изотермы в ту или иную сторону позволяет говорить об изменении поверхностной плотности вследствие тех или иных изменений структуры монослоя. Гибридизация олигонуклеотидов, связанных с липидными монослоями, с комплементарной последовательностью ведет к изменению геометрии и жесткости фрагментов монослоя, благодаря чему сравнение изотерм может использоваться для детекции гибридизации (рис. 2.10).
Изотермы монослоя диолеилфосфатидилхолшіа (1) в присутствии природного опигонуклеотида /X, (2), опигонуклеотида III, содержащего остатки олеиламина на обоих концах (3), смеси III с неколпглементарпой последовательностью IX (4) и дуплекса Н1+Х(5).
В соответствии с полученными нами результатами, присутствие в растворе опигонуклеотида IX табл. 5, не содержащего остатков олеиламина, не вызывало изменений в характере изотермы, однако относительно чистого фосфатидилхолина (рис. 2.10, кривая 1) параметры монослоя изменились - поверхностное давление увеличилось (рис. 2.10, кривая 2). Как следствие, изменились и давления перехода между фазами (8 мН/м и 50,5 мН/м для переходов 1- П и II—Ш, соответственно). Кроме того, площадь, приходящаяся на молекулу монослоя, существенно увеличилась (табл. 2.5) Эффект, видимо, объясняется изменением ионной силы буферного раствора, вызванным присутствием олигонуклеотида, поскольку поверхностное давление находилось в прямой зависимости от концентрации олигонуклеотида.
Аналогичные результаты были получены в случае взаимодействия монослоя с олигонуклеотидом I, содержащим гидрофобный остаток на только на 3 -конце. В том случае, если в растворе присутствовал олигопуклеотид I, поверхностное давление и площадь на молекулу существенно увеличивались по сравнению с чистым монослосм (рис. 2.11, кривые 1 и 2). Однако, в обоих случаях, когда к системе добавляли олигонуклеотид, некомплементарный (IX) или комплементарный (X) встроенному в монослой, изотерма смещалась в сторону уменьшения площади, приходящейся на молекулу липида (рис. 2.11, кривые 3 и 4, соответственно). Как видно из сравнения изотерм 3 и 4, изменения как площади, так и поверхностного давления, были более выражены в случае присутствия в растворе комплементарной цепи. Рассчитанные значения площади, приходящейся на молекулу липида, практически совпадают для систем, в которые добавлен олигонуклеотид, комплементарный либо некомплементарный встроенному в мопослой. П (мН/м) п
Изотермы моиослоя диолеилфосфатидтхолана (1) в присутствии олигонуклеотида 1, содержащего 3 -концевой остаток олеиламипа (2), дуплекса I+X (3) а смеси I с некомплементарной последовательностью IX (4).
В работе Женга [136] было показано аналогичное уменьшение поверхностного давления для слоев яичного фосфатидилхолина, содержащих олигодезокситимидиловую кислоту, модифицированную по 5 -концу остатком пальмитиновой кислоты, в присутствии комплементарной последовательности. Исходя из предположения, что олитонуклеотиды участвуют в электростатическом взаимодействии с поверхностью монослоя, можно заключить, что, аналогично олигодезокситимидилату, происходит отдаление олигонуклеотида I от липидного моиослоя в результате гибридизации. Очевидно, что в случае олигонуклеотида Ш, модифицированного по обоим концам, система является более стабильной. Сделанные предположения подтверждаются тем фактом, что при добавлении комплементарного олигонуклеотида к системе монослой фосфатидилхолииа/олигонуклеотид III вместо десорбции происходило дальнейшее увеличение площади, приходящейся на молекулу моиослоя.
При сравнении изотерм, полученных для олигонуклеотидов III и I, изменения поверхностного давления и площади при их связывании с монослоем оказываются очень близкими (рис 2.10 и 2.11). Можно предположить, что в случае модификации по одному из концов (олигонуклеотид III) ДНК также ориентирована параллельно относительно поверхности монослоя и участвует в электростатических взаимодействиях с холиновыми группами фосфолипидов. Конформация олигонуклеотида 1 способна меняться в результате гибридизации с комплементарной последовательностью. Длина дуплекса, образованного двумя 19-звенными олигонуклеотидами ( б,6 нм), достаточно невелика и позволяет дуплексу X+I быть направленным перпендикулярно к поверхности монослоя. В случае если представить возможной гибридизацию с иммобилизованным олигонуклеотидом I, привязанным к поверхности за оба конца, ориентация его при образовании дуплекса измениться не должна.
Как уже было упомянуто, для создания общей картины влияния гидрофобных взаимодействий олигонуклеотидов на н сконденсированный мопослоем (участок I изотермы) требовалось проведение дополнительных экпериментов, которые включали в себя изучение поведения монослоев диолеилфосфатидилхолипа в присутствии олеиновой кислоты по методу Лэнгмюра. Эксперименты проводили в лаборатории биофизики физико-математического факультета университета Братиславы, Словакия. Было показано, что на начальном, неконденсированном участке изотермы поверхностное давление уменьшалось при добавлении олеиновой кислоты, тогда как существенного уменьшения давления в случае конденсированного монослоя (участок II) удавалось добиться лишь при высоком содержании олеиновой кислоты (соотношение ДОФХ/олеиновая кислота не более 5:1). В наших условиях, когда олеильными фрагментами были модифицированы добавляемые олигонуклеотиды, расчеты показывают, что максимально возможной было соотношение 140:1 в случае олигонуклеотида, содержащего два остатка ол сил амина. Таким образом, можно заключить, что изменение поверхностных свойств липидного монослоя в конденсированном состоянии (II) в преобладающей степени определялось электростатическими взаимодействиями с отрицательно заряженными фосфатными группами олигонуклеотида. Максимальное рассчитанное мольное соотношение ДОФХ/олигонуклеотид составляло в условиях эксперимента 15 для одноцепочечных и 7,5 для двухцепочечпых олигонуклеотидов. Регистрируемые изменения площади поверхности, составляющие 0,03-0,07 нм2 (табл. 2.5), находятся в хорошем соответствии с теоретически возможными изменениями, возникающими благодаря электростатическим взаимодействиям ДОФХ с олигонуклеотидами.
![Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур](/i/i/4471/365034.png "Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур Устинов Алексей Викторович")
