Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 9
1.1. Системы и методы анализа связи «структура – активность» 9
1.1.1 Исследования методом Quantitative Structure-Activity Relationship 11
1.1.2 Общая схема Quantitative Structure-Activity Relationship исследования 16
1.1.3 Молекулярные дескрипторы 18
1.1.4 Метод SARD-21 в прогнозе и создание новых соединений с заданными свойствами 22
1.2 Метод молекулярного докинга 24
1.2.1 Разработка новых биологически активных структур методами молекулярного докинга 29
1.3 Механизм биологической активности противовоспалительных лекарственных средств 30
1.3.1 Циклооксигеназный путь 32
1.3.2 Липоксигеназный путь 35
1.3.3 Дуэльные ингибиторы циклооксигеназы и липоксигеназы 38
Глава 2. Экспериментальная часть 40
2.1 Конструирование потенциально активных ингибиторов 5-липоксигеназы 40
2.1.1 Основные направления и объем исследований в рамках компьютерной системы SARD-21 40
2.1.2 Основные этапы исследований 41
2.1.3 Методика эксперимента 41
2.2 Моделирование QSAR с использованием программы GUSAR 45
2.3 Молекулярный докинг потенциально эффективных ингибиторов в активный центр 5-липоксигеназы и изомерных форм циклооксигеназы 48
2.3.1 Моделирование активного центра 5-липоксигеназы 49
2.3.2 Методика эксперимента 50
Глава 3. Результаты и их обсуждение 52
3.1 Прогнозирование новых потенциальных ингибиторов 5-липоксигеназы методом SARD-21 52
3.1.1 Обоснование метода расчета 52
3.1.2. Анализ решающего набора признаков 53
3.1.3. Тестирование РНП на экзаменационных выборках моделей М1-М4 56
3.1.4 Влияние циклических и ациклических признаков структуры на ингибирующую активность 5-липоксигеназы клеток крови крыс 62
3.1.5. Влияние циклических и ациклических признаков на ингибирующую активность 5-липоксигеназы клеток крови человека 68
3.1.6 Сравнительный анализ структурных дескрипторов моделей М1 и М3 з
3.1.7 Сравнительный анализ структурных дескрипторов моделей М2 и М4 73
3.1.8. Выбор направлений молекулярного дизайна действующих веществ нестероидных противовоспалительных препаратов «Рофекоксиб» и «Кетопрофен» 74
3.1.9. Прогноз токсичности производных 2-(3-метилфенил) пропановой кислоты и 4-[4-(Метилсульфо-нил)фенил]-3-фенил-2(5H)-фуранона с помощью on-line компьютерной системы GUSAR on-line 80
3.2 Прогнозирование значений параметра эффективностей ингибирования 5 липоксигеназы, циклооксигеназы 1, 2 и блокаторов рецепторов CysLT R1/R2 методом QSAR. 82
3.2.1 Обоснование метода расчета 82
3.2.2 Анализ GUSAR моделей прогноза величины IC50 для 5-липоксигеназы клеток крови крыс 84
3.2.3 Анализ GUSAR модели прогноза величины IC50 для циклооксигеназы – 1 клеток крови крыс 89
3.2.4 Анализ GUSAR моделей прогноза величины IC50 для циклооксигеназы – 2 клеток крови крыс 91
3.2.5 Анализ GUSAR моделей прогноза величины IC50 и Ki для блокаторов рецепторов CysLT-R1/R2 клеток крови человека 94
3.2.6 Прогноз биологической активности соединений полученных в результате молекулярного дизайна действующих веществ нестероидных противовоспалительных лекарственных препаратов «Рофекоксиб» и «Кетопрофен» 98
3.3 Докинг потенциальных ингибиторов 5-липоксигеназы в ее активный центр и в активный центр изоформ циклооксигеназ 101
3.3.1 Расчет парциальных атомных зарядов в активном центре 5-липоксигеназы 101
3.3.2 Молекулярный докинг потенциально эффективных ингибиторов 5-липоксигеназы в ее активный центр 103
3.3.3 Молекулярный докинг потенциально эффективных ингибиторов 5-липоксигеназы в активный центр ЦОГ-1 111
3.3.4 Молекулярный докинг потенциально эффективных ингибиторов 5-липоксигеназы в активный центр биомолекулы 1PXX 118
Заключение 125
Выводы 126
Список сокращений и условных обозначений 127
Список литературы 128
- Общая схема Quantitative Structure-Activity Relationship исследования
- Молекулярный докинг потенциально эффективных ингибиторов в активный центр 5-липоксигеназы и изомерных форм циклооксигеназы
- Тестирование РНП на экзаменационных выборках моделей М1-М4
- Докинг потенциальных ингибиторов 5-липоксигеназы в ее активный центр и в активный центр изоформ циклооксигеназ
Введение к работе
Актуальность работы. Исследования в пограничных между биологией, медициной и химией областях являются источником новых знаний, приводящих к развитию новых методов и приемов для решения конкретных задач. Одним из важнейших направлений, получивших развитие в последние десятилетия, является теоретическое предсказание новых структур органических соединений с заданным свойствами. Особенно перспективно это направление в области разработки новых лекарственных препаратов. Дело в том, что выяснение молекулярного механизма взаимодействия этих препаратов с биологическими системами живых организмов является чрезвычайно трудной задачей, однако существуют проблемы, требующие безотлагательного решения, такие, как лечение конкретных заболеваний человека. Для решения этой задачи было разработано несколько методов исследования связи между молекулярной структурой и биологической активностью химических соединений. С появлением мощной вычислительной техники и созданием необходимого программного обеспечения для решения подобных задач эти методы в последнее десятилетие получили широкое распространение. С помощью этих методов нельзя получить прямых сведений о механизме взаимодействия, обуславливающего биологическую активность, однако они позволяют решать важные практические задачи. Обсуждаемые методы составляют комплекс приемов, объединяющих так называемую теорию распознавания образов, в рамках которой, в частности, был разработан и описан целый ряд методов исследований. Метод Ханша, основанный на соотношении линейности свободных энергий, возник в результате применения к задачам медицинской химии методов физической органической химии и методов многомерного статистического анализа. Благодаря созданию мощной вычислительной техники появилась также возможность применения методов молекулярной механики исследования связи между структурой и активностью. Мировая практика создания новых биологически активных соединений, лекарственных препаратов и других веществ с заданными свойствами базируется на этом комплексе математических методов прогнозирования. Такой подход позволяет более оперативно и целенаправленно решать практически важные проблемы с меньшими экономическими затратами. Вместе с тем нет единого алгоритма компьютерного поиска и создания потенциальных лекарственных препаратов. В связи с этим разработка методики виртуального скрининга представляет собой практически важную задачу. В данной работе разработка методики виртуального скрининга для поиска биологически активных веществ произведена на примере прогнозирования новых эффективных ингибиторов образования лейкотриенов и блокаторов чувствительных к ним рецепторов.
Ключевым ферментом биосинтеза лейкотриенов в организме человека и животных является 5-липоксигеназа (5-ЛОГ). Однако, чрезмерная
выработка лейкотриенов провоцирует такие заболевания, как астма, артриты, псориаз и ишемическая болезнь сердца. В живых системах активации синтеза лейкотриенов способствует гиперпродукции арахидоновой и лино-леновой кислот на фоне сниженной активности изоформ циклооксигеназ (ЦОГ-1 и ЦОГ-2) при использовании нестероидных противовоспалительных лекарственных препаратов (НПВП). Известно, что естественными ингибиторами биосинтеза лейкотриенов являются их синтетические аналоги, а также простагландины, образующиеся по циклооксигеназному пути окисления арахидоновой кислоты. Таким образом, к настоящему времени в отечественной и зарубежной литературе накоплен значительный объем информации по данной проблеме, однако систематический анализ взаимосвязи между строением и активностью разных классов ингибиторов 5-ЛОГ не проводился и все результаты поиска эффективных ингибиторов биосинтеза лейкотриенов, катализируемого 5-ЛОГ, носят разрозненный характер. В этой связи поиск биологически активных соединений, способных блокировать активность как 5-ЛОГ, так и изомерных форм ЦОГ, представляет собой перспективное направление в области фармакологии и биохимии для предотвращения и лечения аллергий и воспалений различной этиологии.
Целью работы является структурный анализ и конструирование ингибиторов каталитического синтеза метаболитов арахидоновой кислоты с использованием комплекса методов виртуального скрининга. Задачи работы:
-Установление количественной взаимосвязи между строением и селективностью действия гетероароматических соединений в отношении изомерных форм ЦОГ, 5-ЛОГ и цистенил лейкотриенов.
-Формирование и апробирование моделей прогноза ингибиторов изоформ ЦОГ и 5-ЛОГ.
-Конструирование новых соединений с высокой эффективностью противовоспалительного действия и сниженной токсичностью.
-Молекулярный дизайн и молекулярный докинг в активные центры изомерных форм ЦОГ и 5-ЛОГ потенциально эффективных низкотоксичных ингибиторов образования лейкотриенов.
Научная новизна. В рамках теории распознавания образов разработаны модели распознавания структур - потенциальных ингибиторов ферментов - оксигеназ. Для достижения поставленной цели сформированы базы данных веществ и созданы решающие правила для конструирования новых ингибиторов ферментов - оксигеназ. Предложены, варианты модификации структур действующего вещества (ДВ) «Кетопрофен» и ДВ «Рофекоксиб», применяемых в качестве противовоспалительных средств, для снижения токсичности и усиления противовоспалительной активности. Разработана новая методика виртуального скрининга для поиска селективных ингибиторов изоформ ЦОГ и 5-ЛОГ, базирующаяся на комплексе теоретических ме-
тодов и подходов, включая SAR- и QSAR-методы, а также молекулярный докинг.
Практическая значимость. Разработанную методику рекомендуется использовать при поиске новых нестероидных противовоспалительных средств и при модификации известных структур с целью оптимизации комплекса их терапевтических свойств (токсичности и эффективности). Сформированные модели прогноза можно использовать для отсева потенциально неэффективных структур, а также для скрининга имеющихся баз данных с целью поиска новых противовоспалительных средств.
На защиту выносятся
- методика виртуального скрининга для поиска селективных ингибиторов изоформ ЦОГ и 5-ЛОГ, базирующаяся на комплексе теоретических методов и подходов, включая SAR- и QSAR-методы, а также молекулярный докинг.
-модели распознавания селективных ингибиторов изоформ ЦОГ и 5-ЛОГ, а так же чувствительных к ним цистеинил лейкотриенов CysLT-R1/R2
-результаты модификации ДВ «Кетопрофен» и ДВ «Рофекоксиб» и создание на их основе новых структур ингибиторов изоформ ЦОГ, 5-ЛОГ и цистеинил лейкотриенов, обладающих сниженной токсичностью и усиленной противовоспалительной активностью.
-результаты докинга сконструированных соединений в активные центры изоформ ЦОГ и 5-ЛОГ.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлены на всероссийских и международных конференциях: Международная школа-конференцияя для студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальная математика и ее приложения в естествознании» (Уфа, 2010, 2011); Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010, 2011, 2013); Международная научно -техническая конференция «Наука и образовании» (Мурманск, 2010, 2011, 2012); Международная конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010); Всероссийская научная конференция «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2012); В сборнике материалов конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 2013).
Публикации. По материалам работы опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах, тезисы 11 докладов на Международных и Всероссийских конференциях.
Личный вклад автора состоит в проведении экспериментальных исследований, обработке данных, интерпретации полученных результатов.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 196 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав, заключения, выво-
Общая схема Quantitative Structure-Activity Relationship исследования
Методология 3D QSAR в вычислительном плане гораздо более сложная, чем 2D QSAR - моделирование. Она, включает в себя несколько этапов, позволяющих получить численные дескрипторы структуры соединения. Конформация соединения должна быть определена экспериментальными данными или методом молекулярной механики, а затем усовершенствована путем минимизации энергии [16], после чего, конформеры должны быть равномерно выровнены в пространстве. Набор конформеров с рассчитанными на основе отобранных дескрипторов свойствами, в дальнейшем подвергается тестированию на обучающей и тестовой выборке.
Согласованно зависимые 3D QSAR дескрипторы представляют собой группу методов, которые требуют выравнивания молекулы до расчета дескрипторов и сильно зависят от информации о рецепторе моделируемого лиганда. В случае, когда такие данные имеются, выравнивание должно сопровождаться изучением комплексов рецептор-лиганд. В противном случае для наложения структуры в пространстве должны быть использованы чисто вычислительные методы [17]. Эти методы опираются, например, на атом-атомные или подструктуро-каркасные соответствия.
Сравнительный анализ молекулярного поля – CoMFA (Comparative molecular field analysis) [18] использует электростатические (кулоновские) и стерическое (Ван-дер-Ваальсовские) энергетические поля, определенные для тестируемого соединения. Выравнененная молекула находится в 3D-сетке, в каждую точку которой помещается атом-зонд с вычисленным единичным зарядом и потенциалом (кулоновским и леннард-джонсонским) полей энергии. В дальнейшем, они служат в качестве идентификаторов анализа, при котором используется регрессия частичных наименьших квадратов. Этот анализ позволяет выделить области структуры, положительно и отрицательно влияющие на активность.
Метод сравнения индексов молекулярного подобия - CoMSIA (The Comparative Molecular Similarity Indices Analysis) [19] аналогичен CoMFA и так же использует зондирующий атом по всей решетке сетки, в которую погружена молекула при этом рассчитываются сходство между атомами-зонда и исследуемой молеку 21 лы. По сравнению с CoMFA, CoMSIA использует потенциальную функцию дифференциала, а именно функции Гауссиана. Затем рассчитываются стерические, электростатические и гидрофобные свойства, поэтому атом зонда имеет единичную гидрофобность в качестве дополнительного свойства. Использование потенциальной функции Гауссиана вместо функции Леннарда-Джонса и кулоновских функций, позволяет получить точную информацию в точках сетки, расположенных в пределах молекулы. Характер потенциальных функций в методе CoMFA в этих точках позволяет применять высокие значения функций.
Согласованно независимые 3D QSAR дескрипторы представляет собой группу 3D дескрипторов, не требующих наложения соединений. При этом метод The Comparative Molecular Moment Analysis (CoMMA) [20] использует моменты второго порядка распределения массы и распределения заряда. Моменты относятся к центру массы и центру диполя. Дескрипторы CoMMA включают главные моменты инерции, величины дипольного момента и главного квадрупольного момента. Кроме того, определяются дескрипторы, связанные с зарядами массовых распределений, то есть величины проекций диполя на главные моменты инерции и перемещения между центром масс и центром диполя.
Для описания гидрофобных взаимодействий, водородных связей и доноров-акцепторных взаимодействий метод VolSurf [21] помещает исследуемую молекулу в трехмерную решетку, содержащую разные специфические зонды. Полученные решетки используются для вычисления дескрипторов, опираясь на объем или поверхность 3D контуров, определяемых тем же значением энергии взаимодействия молекул зонда. С помощью различных зондов и пороговых значений энергии, могут быть рассчитаны различные молекулярные свойства. К ним относятся молекулярный объем и поверхность, гидрофобные и гидрофильные участки. Кроме того этот подход позволяет вычислить факторы, связанные с поверхностью гидрофобных и гидрофильных участков, находящихся на поверхности молекулы.
Сравнение 2D и 3D QSAR подходов. Принято считать, что 3D- подходы превосходят 2D-подходы в разработке лекарственных препаратов. Тем не менее, исследования показывают, что такое предположение не всегда может быть досто 22 верным. Например, результаты обычного CoMFA- исследования часто могут быть невоспроизводимыми из-за их непосредственной зависимости от качества полученных ориентаций жестко выстроенных молекул на мониторе пользователя [22].
Такие проблемы выравнивания типичны в 3D подходах, и, хотя были предложены некоторые решения, однозначное 3D выравнивание структуры различных молекул по-прежнему остается сложной задачей. Кроме того, различие между 2D-и 3D-QSAR подходами не является четким. Существует также более глубокая связь между 3D-QSAR и топологическим 2D-методом. Это связано с тем, что геометрия соединения во многих случаях зависит от его топологии. Наглядный пример был представлен Эстрадом и соавт., который показал, что двугранные углы бифенила в зависимости от заместителей, присоединенных к нему, могут быть предсказаны топологическими индексами [23].
Молекулярный докинг потенциально эффективных ингибиторов в активный центр 5-липоксигеназы и изомерных форм циклооксигеназы
Для моделирования количественной взаимосвязи между строением и ингибиторами биосинтеза лейкотриенов использовалась программа GUSAR (General Unrestricted Structure-Activity Relationships) [85]. Подход в технике QSAR- моделирования, реализованный в данной программе, основан на сочетание теории нечетких множеств и самосогласованной регрессии для получения количественной оценки биологической активности.
Структуры соединений, вошедшие, в обучающие массивы всех построенных моделей представлены, в приложении (табл. 5-12).
Обучающая выборка ОМ5 для модели М5 сформирована на основе 113 соединений, изученных в качестве ингибиторов 5-ЛОГ в работе [86]. Ингибирую-щая активность этих соединений измерена методом связывания по степени снижения каталитической активности 5-ЛОГ резидентных макрофагов у самцов белых мышей и представлена в нмоль/л в виде количественного параметра IC50.
Обучающие массивы ОМ6 для модели М6 и ОМ7 для модели М7 сформированы на основе 47 и 107 производных гидроксамовой кислоты соответственно. Ингибирующая активность этих структур, определена по отношению к 5-ЛОГ в базофильных лейкемических клетках крови крыс описанных в работах [87].
Модель М8 формировалась на основе обучающего массива ОМ8 и сдержит 61 соединения, являющихся производными карбоксоамида. Значения IC50 для этих соединений определены по отношению к ЦОГ-1 в базофильных лейкемиче-ских клетках крови крыс описанных в работе [88].
Обучающий массив ОМ9 для модели М9 сформирован на основе 113 соединений, изученных в качестве ингибиторов ЦОГ-2 в работе [89]. Ингибирующая активность этих соединений измерена методом связывания по степени снижения каталитической активности ЦОГ-2 резидентных макрофагов у самцов белых мы 46
шей и представлена в нмоль/л в виде количественного параметра IC50. Отобранные соединения являются производными 4,5,6,7-тетрагидро-2Н-изоиндола и бен-зотиофена, характеризуются наличием в своей структуре двух бензольных заместителей, связанных с гетероциклическими ароматическими фрагментами, и по способности ингибировать каталитическую активность ЦОГ-2 лежат в интервале: 0.6 700 нмоль/л.
Соединения обучающего массива ОМ10 для модели М10 являются производными бутилфенола. В этот массив входит 24 соединения, значения IC50 для которых определено эффективностью ингибирующего действия по степени снижения каталитической активности ЦОГ-2 макрофагов у самцов белых мышей линии J774A в работе [90].
Для модели М11 использовался обучающийся массив ОМ11, в который вошли 76 соединений, являющихся производными карбоксилхалконов описанных в работе [91]. Значение IC50 для этих соединений измерено путем измерения антагонистической активности по отношению CysLT-R1/R2 рецепторам в клетках человека dU937.
Модель М12 сформирована на основе 36 соединений обучающего массива ОМ12. Все эти соединения являются производными (хинолин-2-илметокси)-фенила. Значения Ki для них измерено связыванием in vitro в отношении рецептора цистеинил лейкотриена D4 выделенных из мембран легких морской свинки [92].
Все структуры соединений обучающих массивов построены в программе MarvinSketch 5.9.1 [93] и с использованием программы Discovery Studio Visualiser [94] переводили в sdf-формат.
Для вычисления регрессионных коэффициентов с целью дальнейшего построения моделей количественного прогноза ингибирующей активности в отношении 5-ЛОГ, ЦОГ-1, ЦОГ-2 и к CysLT-R1/R2 рецепторам использовалось 2 типа дескрипторов: 1) MNA-дескрипторы; 2) QNA-дескрипторы. Их расчет осуществляется программой GUSAR автоматически из структурных формул химических соединений с учетом валентности и парциальных зарядов содержащихся в них атомов, но без указания специфики типов связи. Детальное описание идеологии расчета MNA- и QNA-дескрипторов приведено в работах [95].
Следует отметить, что программа способна строить регрессионные уравнения, как опираясь исключительно на один из этих типов дескрипторов, так и сочетать их наборы в консенсусном подходе. При этом регрессионные уравнения, построенные на базе MNA- и QNA-дескрипторов, не отображаются в явном виде. Исходя из идеологии консенсусного подхода, модели количественного прогноза биологической активности по каждому из данных типов дескрипторов рассчитываются независимо друг от друга, а затем с помощью метода самосогласованной регрессии комбинируются в оптимальные сочетания. Качество QSAR-моделей оценивалось по следующим параметрам: N –число структур в обучающем массиве; R2 – квадрат коэффициента регрессии; Q2 – коэффициент регрессии при скользящем контроле; F- - критерий Фишера; SD- стандартное отклонение; V-число переменных в конечном регрессионном уравнении. Построение моделей в программе GUSAR проводилось со следующими параметрами: 1) Leave Many Out = 20 итераций, то есть процедура скользящего контроля была реализована 20 раз. 2) № of leave out = 20%, то есть в течение каждой итерации скользящего контроля из обучающего массива случайным образом автоматически исключалось 20% соединений. 3) Leverages =0.99 - параметр доверительной вероятности. 4) Similarity=0.70 - этот параметр значит, что степень сходства структур обучающего массива на основании коэффициента Токимото составляет как ми нимум 70%. 5) kNN RMSE/Average RMSE=1, то есть величины случайной среднеквадра тичной и средней ошибки, с учетом метода ближайшего соседа, рассчитанные в рамках евклидвой метрики, полностью совпадают друг с другом (ошибка единичного расчета не превышает ошибку расчетного эксперимента).
6) № of Models =10, то есть в конечном итоге из огромного набора построенных QSAR-моделей для каждого из обучающих массивов отбирались 10 моделей с наилучшими статистическими характеристиками.
Одновременно с расчетом значения IC50 или Ki, GUSAR рассчитывает вклад каждой функциональной группы в активность данной молекулы. Зеленый означает, что влияние атома примерно соответствует предсказанным значением активности для целой молекулы. Синий означает, что конкретный атом может снизить активность. Красный означает, что конкретный атом может увеличить активность. Таким образом, метод GUSAR дает качественную эффективности заместителей. В то же время сочетание этого метода с методом SARD-21 позволяет не только установить уровень эффективности заместителей, но и охарактеризовать эту эффективность в количественной величиной коэффициента информативности r.
Молекулярный докинг потенциально эффективных ингибиторов в активный центр 5-липоксигеназы и изомерных форм циклооксигеназы
В качестве мишеней, моделирующих ферменты 5-ЛОГ человека, ЦОГ-1 и ЦОГ-2 крыс были выбраны структуры макромолекул из PDB (http://www.rcsb.org) с кодами 3о8у, 3n8x и 1PXX соответственно. Структуры всех лигандов были построены в программе MarvinSketch версии 5.3.6 [93] и оптимизированы методом молекулярной механики при наложении силового поля AMBER-99SB в программе UCSF Chimera [96]. Подготовку структур лигандов и макромолекулы проводили в программе AutoDockTools [97]. Первоначально все молекулы воды были удалены из структуры белка. Файлы рецептора и лигандов были конвертированы в формат PDBQT-файла с добавлением недостающих атомов водорода и парциальных атомных зарядов, рассчитанных по методу Гастайгера [98]. 2.3.1 Моделирование активного центра 5-липоксигеназы
Активный центр 5-ЛОГ содержит негемовый ион Fe с условным зарядом 2+, координационно-связанный с тремя полярными гистидиновыми фрагментами HIS372, HIS550, HIS367, карбонильной группой аспарагина ASN554, карбоксильной группой С-терминального изолейцина ILE673 и молекулой воды H2O, (рис. 2.1) [99]. Лиганды при их взаимодействии с активным центром должны замещать молекулу воды H2O.
Тестирование РНП на экзаменационных выборках моделей М1-М4
Визуальный анализ исследованных комплексов «макромолекула-лиганд» позволяет заключить, что большинство из потенциальных лигандов, полученных при структурной модификации ДВ «Кетопрофен» и ДВ «Рофекоксиб», достаточно надежно стабилизируются в активном центре 5-ЛОГ благодаря тг-тг и Т-стэкинговым взаимодействиям. Соединения КЗ, К4, К5, Кб, К7, R12, R17, R22 и R24 исключены из массива потенциальных ингибиторов 5-ЛОГ, в связи с недостаточной стабилизацией в активном центре, таким образом, совместное исполь 107
Установлено, что Т-стэкинговые взаимодействия возникают между бензольными фрагментами потенциальных ингибиторов 5-ЛОГ и бензольным фрагментом близко расположенных к ним РНЕ 421 и РНЕ177 (рис. 3.23 и 3.24, табл. 3.29); тг-тг-взаимодействия наблюдаются между бензольными фрагментами ли-гандов и имидазольными фрагментами HIS367 и HIS372.
Кроме того, определяющую роль при ориентации лигандов в активном центре 5-ЛОГ играет наличие полярной области, образованной негемовым ионом Fe1+, координационно- связанным с тремя полярными гистидиновыми фрагментами HIS 372, HIS 550, HIS 367, карбонильной группой аспарагина ASN 554 и ближайшей СОО-группой изолейцина ILE 673. В частности, полярные имидазольные фрагменты аминокислот HIS 372, HIS 367 и ILE673 образуют водородные связи с лигандами K5, K6, K7, K11, K12, K13, K14, R10, R12, R14, R21 и R23 табл. 3.28 и 3.29. В отсутствие молекул ингибиторов шестое положение в этом комплексном соединении занимает молекула воды H2O 906, координационно-связанная с ионом железа 1+, рис. 2.1.
Результаты докинга ДВ «Кетопрофен», ДВ «Рофекоксиб» и ДВ «Зилеутон» в активный центр фермента 5-ЛОГ.
Установлено, что молекулы 2-(3-бензоилфенил) пропановой кислоты (ДВ «Кетопрофен»), 4-[4-(Метилсульфо-нил)фенил]-3-фенил-2(5H)-фуранон (ДВ «Ро-фекоксиб») и N-[1-(1-бензотиен-2-ил)этил]-N-гидроксимочевины (ДВ «Зилеутон») при позиционировании в активном центре 5-ЛОГ вследствие различий в строении образуют три близко расположенных кластера. Молекулы ДВ «Кетопрофен» и ДВ «Рофекоксиб» являются селективными ингибитороми изомерных форм цик-лооксигеназ и характеризуется незначительным ингибирующим действием по от по ношению к 5-ЛОГ. В соответствии с полученными результатами, их структуры позиционируется близко к входу в активный центр макромолекулы 3о8у на расстоянии не ближе 0,42 и 0,56 нм соответсвенно относительно иона железа Fe1+ (рис. 3.26).
Бензотиофеновый фрагмент ДВ «Зилеутон» находится на расстоянии 0,57 нм от негемового иона железа Fe1+. Таким образом, молекула зилеутона, которая согласно экспериментальным данным является селективным ингибитором 5-ЛОГ, входит во внешнюю координационную сферу полярного комплекса, образованного ионом Fe1+, координационно связанного с имидазольными циклами HIS367, HIS 372, HIS 550, и кислородсодержащими фрагментами ASN 554, ILE673. Она достаточно надежно удерживается в активном центре 5-ЛОГ благодаря водородным связям, а также тг-тг и Т-стэкинговым с близлежащими аминокислотными фрагментами (табл 3.28 и рис 3.26).
Важную роль при ориентации лигандов в активном центре 5-ЛОГ играет гидрофобная полость, образованная преимущественно неполярными аминокислотами (LEU414, ILE415, LEU368, LEU607, LEU420, РНЕ421, РНЕ177, ALA424, ALA410, ALA603, VAL604, PR0569), в которой позиционируются бензольные фрагменты молекул тестируемых соединений. Некоторые из этих аминокислотных остатков, в частности ALA424, образуют водородные связи с карбонильными фрагментами лигандов (рис. 3.25 и рис 3.26, табл. 3.4). На ориентацию полярных фрагментов лигандов в активном центре 5-ЛОГ влияют аминокислоты с полярными незаряженными, а также отрицательно и положительно заряженными R-группами, такие как: HIS 372, HIS 367, GLN 363, TYR181, THR364, ASN 425, TRP599, LYS423. Например, аминогруппа TYR181 образует водородные связи с кислородсодержащими фрагментами лигандов К5, Кб, К11, К12 и R24. Аминогруппа полярного незаряженного аминокислотного остатка ASN 425 образует водородные связи с лигандами К12, К14, R6 и R11 (табл 3.28 и 3.29), что свидетельствует о достоверности найденных докинг-решений.
Визуальный анализ исследованных комплексов “макромолекула-лиганд” позволяет заключить, что большинство из лигандов, полученных при структурной модификации ДВ «Кетопрофена» и ДВ «Рофекоксиба», достаточно надежно стабилизируются в активном центре ЦОГ-1 благодаря тг-тг и Т-стэкинговым взаимодействиям с бензольными фрагментами близко расположенных к ним аминокислотных фрагментов. В частности, Т-стэкинговые взаимодействия возникают между бензольными фрагментами потенциальных ингибиторов 5-ЛОГ и TYR 385 и TRP 387, (рис. 3.27 и 3.28, табл. 3.29); тг-тг-взаимодействия наблюдаются между карбоксильной группой лигандов и гуанидиловым остатоком ARG 120.
Докинг потенциальных ингибиторов 5-липоксигеназы в ее активный центр и в активный центр изоформ циклооксигеназ
Установлено, что молекулы 2-(3-бензоилфенил) пропановой кислоты (ДВ «Кетопрофен»), 4-[4-(Метилсульфо-нил)фенил]-3-фенил-2(5H)-фуранон (ДВ «Ро-фекоксиб») и N-[1-(1-бензотиен-2-ил)этил]-N-гидроксимочевины (ДВ «Зилеутон») при позиционировании в активном центре 5-ЛОГ вследствие различий в строении образуют три близко расположенных кластера. Молекулы ДВ «Кетопрофен» и ДВ «Рофекоксиб» являются селективными ингибитороми изомерных форм цик-лооксигеназ и характеризуется незначительным ингибирующим действием по от по ношению к 5-ЛОГ. В соответствии с полученными результатами, их структуры позиционируется близко к входу в активный центр макромолекулы 3о8у на расстоянии не ближе 0,42 и 0,56 нм соответсвенно относительно иона железа Fe1+ (рис. 3.26).
Бензотиофеновый фрагмент ДВ «Зилеутон» находится на расстоянии 0,57 нм от негемового иона железа Fe1+. Таким образом, молекула зилеутона, которая согласно экспериментальным данным является селективным ингибитором 5-ЛОГ, входит во внешнюю координационную сферу полярного комплекса, образованного ионом Fe1+, координационно связанного с имидазольными циклами HIS367, HIS 372, HIS 550, и кислородсодержащими фрагментами ASN 554, ILE673. Она достаточно надежно удерживается в активном центре 5-ЛОГ благодаря водородным связям, а также тг-тг и Т-стэкинговым с близлежащими аминокислотными фрагментами (табл 3.28 и рис 3.26).
Важную роль при ориентации лигандов в активном центре 5-ЛОГ играет гидрофобная полость, образованная преимущественно неполярными аминокислотами (LEU414, ILE415, LEU368, LEU607, LEU420, РНЕ421, РНЕ177, ALA424, ALA410, ALA603, VAL604, PR0569), в которой позиционируются бензольные фрагменты молекул тестируемых соединений. Некоторые из этих аминокислотных остатков, в частности ALA424, образуют водородные связи с карбонильными фрагментами лигандов (рис. 3.25 и рис 3.26, табл. 3.4). На ориентацию полярных фрагментов лигандов в активном центре 5-ЛОГ влияют аминокислоты с полярными незаряженными, а также отрицательно и положительно заряженными R-группами, такие как: HIS 372, HIS 367, GLN 363, TYR181, THR364, ASN 425, TRP599, LYS423. Например, аминогруппа TYR181 образует водородные связи с кислородсодержащими фрагментами лигандов К5, Кб, К11, К12 и R24. Аминогруппа полярного незаряженного аминокислотного остатка ASN 425 образует водородные связи с лигандами К12, К14, R6 и R11 (табл 3.28 и 3.29), что свидетельствует о достоверности найденных докинг-решений.
Для оценки эффективности ингибирования структурами потенциальных ингибиторов 5-ЛОГ биосинтеза простагландинов, проведен молекулярный докинг этих веществ в АЦ ЦОГ-1 и ЦОГ-2. В качестве мишени ЦОГ-1 выбрана биомолекула с кодом 3n8x. В тот же активный центр для сравнения позиционированы структуры арахидоновой кислоты, ДВ «Кетопрофена», ДВ «Рофекоксиба» и ДВ «Нимесулида». Результаты докинга этих соединений, а также тестовой молекулы – арахидоновой кислоты – в активный центр макромолекулы 3n8x, представлены в табл. 3.29.
Как видно из табл. 3.29, 40 предложенных соединений характеризуются высокой афинностью с активным центром данной макромолекулы и меньшей энергией связывания по сравнению с молекулой арахидоновой кислоты.
Энергия и константа связывания потенциальных ингибиторов 5-ЛОГ и тестового соединения арахидоновой кислоты в активный центр молекулы 3n8x.
Структура соединения Свободнаяэнергиясвязывания,ккал/моль Константа инги-биро-вания King , мкмол ь/л Число в кластере, всего 20 решений Аминокислотные фрагменты макромолекулы 3о8у, участвующие в образовании водородных связей и полярных взаимодействиях с молекулами лигандов Аминокислотные фрагменты макромолекулы 3о8у, участвующие в образовании 7Г-тги Т-стэкинго-вых взаимодействий
Визуальный анализ исследованных комплексов “макромолекула-лиганд” позволяет заключить, что большинство из лигандов, полученных при структурной модификации ДВ «Кетопрофена» и ДВ «Рофекоксиба», достаточно надежно стабилизируются в активном центре ЦОГ-1 благодаря тг-тг и Т-стэкинговым взаимодействиям с бензольными фрагментами близко расположенных к ним аминокислотных фрагментов. В частности, Т-стэкинговые взаимодействия возникают между бензольными фрагментами потенциальных ингибиторов 5-ЛОГ и TYR 385 и TRP 387, (рис. 3.27 и 3.28, табл. 3.29); тг-тг-взаимодействия наблюдаются между карбоксильной группой лигандов и гуанидиловым остатоком ARG 120.
Установлено, что молекулы 2-(3-бензоилфенил) пропановой кислоты (ДВ «Кетопрофен»), 4-[4-(Метилсульфо-нил)фенил]-3-фенил-2(5Н)-фуранон (ДВ «Рофекоксиб») и Щ4-Нитро-2-феноксифенил)метансульфонанилид (ДВ «Нимесулид») при позиционировании в активном центре ЦОГ-1 вследствие различий в строении образуют 3 близко расположенных кластера докинг-решений.
Молекула 2-(3-бензоилфенил) пропановой кислоты и 4-[4-(Метилсульфо-нил)фенил]-3-фенил-2(5Н)-фуранона являются селективными ингибитороми изомерных форм циклооксигеназ и характеризуется хорошим ингибирующим действием по отношению к ЦОГ-1.
Молекула N-(4-Нитро-2-феноксифенил)метансульфонанилид (ДВ «Нимесулид») которая согласно экспериментальным данным является селективным ингибитором ЦОГ-1. Она достаточно надежно удерживается в активном центре 5-ЛОГ благодаря водородным связям, а также тг-тг и Т-стэкинговым с близлежащими аминокислотными фрагментами, (табл 3.29 рис 3.31).
Боковые цепи аминокислот активного центра ЦОГ-1 - HIS 90, ARG 120, TYR 355, и GLU 524 - вступают в полярные взаимодействия с карбоксильной группой лигандов, находящихся в АЦ, что способствует сужению его входного “канала”. Подобные взаимодействия плотно фиксируют ингибитор на его месте.
