Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Проблема лекарственной устойчивости патогенных микроорганизмов 9
1.2. Базидиомицеты — продуценты веществ, проявляющих антимикробную активность 18
1.3. Представители рода Coprinus - источник антибиотиков и других биологически активных веществ 37
1.4. Характеристика представителей вида Laetiporus sulphureus как продуцентов биологически активных веществ 44
ПРИЛОЖЕНИЕ К ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ 48
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Сбор материала и выделение грибов в культуру 54
2.2. Штаммы грибов 55
2.3. Тест-организмы 57
2.4. Питательные среды и методы культивирования 58
2.5. Хранение грибных культур 60
2.6. Получение моноспоровых вариантов грибных культур 60
2.7. Определение антимикробной активности 61
2.8. Микроскопирование 63
2.9. Методы первичного выделения антибиотиков 64
2.10. Тонкослойная хроматография 65
2.11. Электрофорез на бумаге 65
2.12. Биоавтография 66
2.13. Определение МПК 67
2.14. Исследование физико-химических свойств антибиотиков 67
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 68
3.1. Выделение штаммов рода Coprinus в культуру 70
3.2. Выявление и анализ антимикробной активности у представителей
рода Coprinus 78
3.3. Выделение антимикробных метаболитов штаммов Coprinus congregatus
2961-2 и Coprinus radiatus 2987 и характеристика их антибиотических свойств 94
3.4. Выделение в культуру штаммов Laetiporus sulphureus 105
3.4.1. Выделение штаммов грибов из природных источников 105
3.4.2. Микроскопические признаки штаммов при росте на агаризованных средах..108
3.4.3. Получение плодовых тел 112
3.5 Выявление и анализ антимикробной активности у штаммов Laetiporus sulphureus 116
3.6. Выделение антибиотически активных метаболитов штамма Laetiporus sulphureus 2990 118
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 132
ВЫВОДЫ 146
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 148
- Проблема лекарственной устойчивости патогенных микроорганизмов
- Сбор материала и выделение грибов в культуру
- Выделение штаммов рода Coprinus в культуру
Введение к работе
Широкое распространение устойчивых форм микроорганизмов, снижающее эффективность применения антибиотиков, является серьезной проблемой клинической практики. Особые опасения вызывает резко возрастающая частота инфекций, вызываемых метициллинрезистентными штаммами золотистого стафилококка (MRSА).
В связи с этим одной из наиболее актуальных проблем современной науки об антибиотиках является поиск новых препаратов, преодолевающих лекарственную устойчивость микроорганизмов. Одним из направлений поиска новых природных антибиотиков является изучение видов, ранее не рассматривавшихся или малоизученных как возможные продуценты антибиотиков. К числу таких организмов можно отнести базидиальные грибы.
В начале антибиотической эры базидиомицеты привлекли к себе внимание наряду с другими организмами. Флори с соавт. (1949) определил различную антимикробную активность при анализе, как плодовых тел, так и мицелиальных культур более чем у 2000 видов грибов. Один из полученных тогда грибных антибиотиков - плевромутилин, использовался в животноводстве для лечения инфекций, вызванных микоплазмами. Однако, в дальнейшем интерес к метаболитам грибов снизился, так как актиномицеты проявили себя как более богатый и легко культивируемый источник антибиотиков. На современном этапе базидиомицеты и другие высшие грибы стали заново исследоваться в этом отношении. Установлено, что базидиомицеты синтезируют огромное количество вторичных метаболитов, проявляющих антибактериальную, противогрибковую, антивирусную, цитотоксическую и галлюциногенную активность, а также обладающих свойствами иммуномодуляторов и гормонов [Anke, 1989; Molitoris, 1994; Феофилова, 1998; Wasser, Weis, 1999; Suay et al., 2000]. Зто произошло во многом благодаря новым достижениям в технологии ферментации, выделения, очистки и методологии определения
структуры полученных веществ, которые сделали возможным изучение различных организмов в качестве источников новых биологически активных метаболитов.
В настоящее время трудности, связанные с медленной скоростью роста базидиомицетов, получением плодовых тел в искусственных условиях, низким выходом продукта, компенсируются реальной возможностью выявления новых антибиотиков различной химической природы. Тот факт, что базидиомицеты до настоящего времени были недостаточно исследованы, вместе с тем, что они продуцируют широкий ряд антибиотиков различной структуры, позволяет предположить, что их можно рассматривать как новый источник биологически активных соединений.
Работа выполнена в порядке соискательства в рамках программ РАМН 002 «Поиск и изучение антибиотиков, эффективных в отношении бактерий, устойчивых к лекарственным препаратам» и 008 «Поиск и анализ новых антибактериальных и противоопухолевых антибиотиков».
Целью работы было выявление грибов-продуцентов антибиотиков, эффективных в отношении метициллинрезистентных стафилококкокков.
Для выполнения основной цели данной работы были поставлены следующие конкретные задачи:
Выделение из природных источников штаммов грибов.
Проведение скринингового исследования среди выделенных культур: выявление продуцентов антибиотически активных веществ и отбор наиболее перспективных продуцентов по антимикробному спектру и уровню активности.
Подбор среды для глубинного культивирования, обеспечивающей накопление антимикробных веществ в количествах, достаточных для их выделения и идентификации.
4. Наработка антибиотически активных веществ, синтезируемых наиболее перспективными продуцентами, выделение и определение их химической природы.
Новизна результатов. Впервые выявлено, что представители рода Coprinus (Fr.) S. F. Gray - перспективная группа продуцентов антибиотиков. Установлено, что представители рода Coprinus образуют вещества, эффективные в отношении метициллинрезистентных стафилококков.
Три антибиотика, эффективных в отношении MRSA, выделены из штамма Coprinus radiatus (Fr.) S. F. Gray 2987. Из трёх антимикробных веществ в наибольшем количестве образуется уже известный антибиотик лагоподин В, активность которого в отношении резистентных форм патогенных бактерий ранее не исследовалась. Образование лагоподина В у вида С. radiatus описано впервые.
Впервые установлено, что штамм С. congregates (Bull.) Fr. 2961-2 является продуцентом двух антибиотиков, подавляющих рост MRSA. Один из активных компонентов является уже известным антибиотиком группы микомицинов - немотином А. Синтез данного антибиотика ранее не был известен у представителя рода Coprinus, при этом впервые выявлена активность немотина А в отношении метициллинрезистентного золотистого стафилококка.
Впервые обнаружено, что вид Laetiporus sulphureus (Fr.) Bond et Sing, образует антибиотические вещества, активные в отношении MRSA. Три антибиотика, активные в отношении MRSA, выделены из штамма L. sulphureus 2990.
Были получены плодовые тела L. sulphureus, ранее образование плодовых тел в чистой культуре не было описано у данного вида.
Основное положение диссертационной работы, выносимое на . защиту, заключается в том, что представители базидиомицетов - грибы рода Coprinus и вид L. sulphureus являются перспективными продуцентами антибиотиков, эффективных в отношении метициллинрезистентных стафилококков.
Научно-практическая значимость. Создана коллекция базидиомицетов родов Coprinus и Laetiporus Murr., состоящая из 21 штамма. Из них 16 штаммов выделены из природы в ходе данной работы и 5 штаммов получены из коллекций ВКМ, ВКПМ, ИНА. В коллекцию вошли 5 штаммов, относящиеся к 3 видам рода Coprinus, отсутствующие в коллекциях ВКМ и ВКПМ. В отношении MRS А проявили активность 14 штаммов коллекции.
Разработан и внедрен в практику лаборатории метод «миделиального моста», позволяющий очистить грибную культуру от бактериальной контаминации.
Предложены условия анализа культуральной жидкости штаммов L. sulphureus, позволившие обнаружить 4 антибиотических вещества, эффективных в отношении MR.SA.
Подобраны условия поверхностного культивирования мицелиальной культуры L. sulphureus, обеспечивающие получение плодовых тел.
Автор выражает глубокую признательность за предоставление темы, руководство и ценные консультации члену-корреспонденту РАМН, профессору Ю. В. Дуднику, за постоянное внимание, ценные консультации и руководство кандидату биологических наук О. В. Ефременковой, за большую техническую помощь в работе научному сотруднику И. Г. Сумаруковой, лаборантам В. Ф. Васильевой и Н. Б. Жудиной; за плодотворное сотрудничество в изучении химической природы и выделении антибиотиков профессору Г. С. Катрухе, кандидатам биологических наук В. А. Зенковой, И. В. Толстых, В. В. Куляевой; за сотрудничество в изучении физиологии продуцентов кандидатам биологических наук О. В. Тихоновой и Л. М. Лурье, за помощь в идентификации видов и проведении цитологических исследований кандидату биологических наук О. В. Камзолкиной.
Проблема лекарственной устойчивости патогенных микроорганизмов
Основным фактором, приводящим к появлению и распространению лекарственной устойчивости у патогенных микроорганизмов, является широкое использование антибиотиков. Распространению устойчивых форм способствуют эмпирическая терапия, необоснованная профилактика заболеваний, неоправданный выбор препаратов широкого спектра действия, применение антибиотиков в животноводстве, в особенности в качестве кормовых добавок, неадекватные дозировки, прерывания курсов лечения, уменьшения сроков грудного вскармливания, импорт продовольствия и распространение сетей общественного питания по типу Fast food [Навалиш с соавт., 1982; Лазарева с соавт., 1997; Дудник, 1999]. Исследования коллекций клинически значимых микроорганизмов, выделенных до начала эры антибиотиков, не выявили у них устойчивости к препаратам, применяемым в медицинской практике в настоящее время.
С началом внедрения антибиотических препаратов в клиническую практику сообщения об устойчивости к ним появлялись очень быстро. Например, в 30-х годах прошлого века методами химического синтеза были получены новые органические соединения - сульфамиды, среди которых красный стрептоцид (пронтозил) был первым эффективным препаратом, оказавшим терапевтическое действие при тяжёлых стрептококковых инфекциях. Впервые противококковое действие стрептоцида в опытах на животных обнаружил в 1934 году Г. Домагк, а первое сообщение о неэффективности сульфаниламидов при гонорее было опубликовано уже в 1937г [Гаузе, 1959; Егоров, 1994; Сидоренко, 1999].
Формулы ряда антибиотиков, упомянутых в обзоре литературы, представлены в приложении к обзору (см. стр. 48)
Различают следующие основные механизмы устойчивости [Ланчини, Паренти, 1985; Сидоренко, 1995; Страчунский с соавт., 2000]:
активный энергозависимый выброс из клетки, как правило, определяющий множественную лекарственную устойчивость к препаратам разных химических классов (тетрациклины, фторхинолоны, макролиды, хлорамфеникол);
инактивация антибиотиков бактериальными ферментами в результате гидролиза (Р-лактамы) или в результате модификации молекулы (аминогликозиды, хлорамфеникол, фосфомицин, линкомицин);
снижение проницаемости внешних структур бактериальной клетки является наименее специфичным механизмом устойчивости и обычно приводит к формированию устойчивости одновременно к нескольким группам антибиотиков. Чаще всего причиной этого явления становится полная или частичная утрата пориновых белков;
известна система MAR - множественная устойчивость к антибиотикам. Активация MAR-системы приводит к одновременному снижению одного из пориновых белков и повышению активности одной из систем активного выведения. Возможно также снижение проницаемости за счет утраты или снижения количества пориновых белков в ассоциации с продукцией (З-лактамаз расширенного спектра;
модификация бактериальной мишени, на которую действует антибиотик ф-лактамы, фторхинолоны, эритромицин, линкомицин, рифампицин, тетрациклины, аминогликозиды, мупироцин, гликопептиды).
В данной работе особое внимание уделено устойчивости бактерий последнего типа. В 1929 году А. Флемингом был открыт пенициллин, который только в 1940 году удалось получить в чистом виде. С получением пенициллина как препарата возникло
Сбор материала и выделение грибов в культуру
Для выделения грибных штаммов в культуру в качестве исходного материала использовали:
1. Свежесобранные плодовые тела (высев не позднее 48 часов после сбора материала);
2. Подсушенные плодовые тела (после сбора материала проходило от 3-х суток до 2-х месяцев);
3. Отпечатки лизировавшихся плодовых тел на бумаге.
Выделение грибных штаммов в культуру проводили двумя методами.
Споровый метод. Споры суспендировали в стерильной воде и высевали в чашки Петри на агаровую среду. После 1-3 суток культивирования наблюдали с помощью микроскопа при увеличении в 100 раз проросшие споры и формирование микроколоний. Через 5-7 суток отдельные грибные колонии, как правило, образовавшиеся из нескольких проросших спор, отсевали в пробирки с агаровой средой.
Тканевый метод. С помощью стерильного скальпеля или бактериологической петли кусочек гименофора или мякоть из толщи плодового тела помещали в центр чашки Петри на поверхность агаризованной среды. Через 3-7 суток наблюдали рост мицелия, который отсевали в пробирки со скошенным агаром.
Очистка грибных культур от бактериальной контаминации. Очистку грибных культур от сопутствующей бактериальной микрофлоры проводили следующими традиционными методами: последовательными пересевами на питательную агаровую среду № 2 Гаузе или среду Чапека, внесением в среду смеси антибактериальных антибиодщрв. бензилпенициллина и стрептомицина при максимальной концентрации каждого 750 мкг/мл [Бухало, 1988; Stamets, 2000]. Положительный результат так же был получен при использовании разработанного нами метода мицелиального моста (см. стр. 75).
Проверка грибных культур на бактериальную контаминацию. С целью провоцирования роста бактерий в пробирки с ПТБ высевали грибную культуру, исследуемую на чистоту. После 1-3 суток инкубирования при температуре 28С и 37С проводили микроскопирование для оценки возможного роста бактерий.
2«2. Штаммы грибов
Объектами исследования данной работы являлись штаммы базидиомицетов, приведённые в таблице 5 (всего 21 штамм) основная часть которых (16 штаммов) бьша получена из природных источников в 1998 - 2001 гг., остальные 5 штаммов получены из коллекций культур микроорганизмов ВКМ, ВКПМ, ИНА (табл. 5а). Для определения систематической принадлежности исследуемых культур использовались следующие критерии: наличие долипоровой септы, пряжек на мицелии, получение в искусственных условиях плодовых тел. Видовая принадлежность определялась на основании морфологических признаков плодовых тел, описывавшихся при сборе грибов, спор и морфо-культуральных признаков. Для идентификации выделенных из природных источников видов использовали ряд определителей [Лебедева, 1949; Определитель грибов России, 1998; Гарибова, Сидорова 1999; Ainsworth and Bisby s dictionary of the fungi, 2001].
Выделение штаммов рода Coprinus в культуру
Поскольку целью данной работы был поиск антибиотиков, эффективных в отношении метициллинрезистентньгх стафиллококков, при первичном скрининге проводили определение МІЖ некоторых антибиотиков в отношении тест-культур, используемых для поиска продуцентов антибиотиков, преодолевающих лекарственную устойчивость. Особое внимание бьшо уделено устойчивости к Р-лактамным и гликопептидньм антибиотикам в связи с широким распространением патогенных бактерий, резистентных к действию тих групп антибиотиков [Сидоренко, 1995; Дудник, 1999; Страчунский с соавт., 2002; Srinivasan et al., 2002]. Наряду со стафилококками (S. aureus FDA 209Р (MSSA) и S. aureus ИНА 00761 (MRSА)) в качестве тест-объекта мы использовали L. mesenteroides ВКПМ В-4177, для которого свойственна высокая природная устойчивость к гликопептидным антибиотикам (табл. 7).
Было установлено, что штамм S. aureus ИНА 00761 (MRSА), являющийся клиническим изолятом, устойчив к оксациллину в концентрации 32 мкг/мл, коллекционный штамм L. mesenteroides ВКПМ В-4177 устойчив к ванкомицину в концентрации 512 мкг/мл, что также отмечалось другими авторами для представителей данного вида [Handwerger et al., 1994].
Таблица 7„ Определение МІЖ некоторых антибиотиков в отношении тест органюмов S. aureus FDA 209Р (MSSA), S. aureus ИНА 00761 (MRSA) и L. mesenieroides ВКПМВ-4177
Наибольший интерес представляли новые антибиотики узкого спектра действия эффективные в отношении грамположительных бактерий, включая метициллинрезистентные штаммы, и не влияющие на грамотрицательные бактерии и грибы.
Настоящая работа проводилась в ГУ НИИНА им. Г. Ф. Гаузе РАМН в рамках тем РАМН 002 «Поиск новых природных антибиотиков медицинского назначения, преодолевающих устойчивость патогенных бактерий» и 008 «Поиск и анализ новых антибактериальных и противоопухолевых антибиотиков».
Всего, в 1998 - 2001гг, сотрудниками Сектора микробиологии из природы было выделено 346 штаммов как низших, так и базидиальных грибов, произрастающих в Москве и Московской области. Среди грибов было идентифицировано 80 штаммов базидиомицетов, являющихся представителями родов Agaricus, Coprinus, Flammulina, -Hypholoma, Laetiporus, Lentinus, Pholiota, Piptoporus, Pleurotus, Polyporus. Антимикробная активность была обнаружена у 316 выделенных грибов, в том числе и базидиомицетов; среди выделенных грибов в отношении MRSA оказались активны 148 штаммов.
Автор диссертации проводил работу с базидиомицетами родов Coprinus и Laetiporus.
Данная работа была начата как продолжение исследований биосинтетической деятельности Coprinus radiatus, начатых в 1985 году во ВНИИ антибиотиков [Анисова с соавт., 1987]. Поэтому в первую очередь и наиболее подробно были изучены представители рода Coprinus.
