Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о противовирусном иммунитете при гепатите 12
1.1 Особенности структуры вируса гепатита С 12
1.2. Факторы неспецифической защиты, участвующие в противовирусном иммунитете при гепатите С 15
1.3. Специфический иммунный ответ при вирусной инфекции... 23
1.3.1. Т-клеточный иммунный ответ 24
1.3.2. В-клеточный (гуморальный) иммунный ответ 35
1.4. Современное представление о механизмах персистенции HCV 41
Глава 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Общая характеристика обследованных больных и объем проведенных исследований 46
2.2. Определение субпопуляций лимфоцитов и маркеров активации на их поверхности методом проточной цитометрии 51
2.3. Определение сывороточных иммуноглобулинов класса Е, М, A, G, подклассов IgG, цитокинов и компонентов системы комплемента методом ИФА 52
2.4. Оценка функциональной активности Т-клеток с помощью методов РТМЛ
и спонтанного розеткообразования 55
2.5. Определение уровня циркулирующих иммунных комплесов в сыворотке крови 57
2.6. Оценка активности фагоцитарной системы 57
2.7. Серологические и молекулярно-генетические методы исследования, морфологические исследования гепатобиоптатов 60
Глава 3. Результаты исследования 63
3.1. Клинико-лабораторная и морфологическая характеристика больных ХГС
у которых было проведено иммунологическое исследование крови 63
3.2. Характеристика Т-клеточного иммунитета при хроническом гепатите С 69
3.2.1. Содержание Т-лимфоцитов в периферической крови у больных хроническим гепатитом С 69
3.2.2. Оценка общей функциональной активности Т-лимфоцитов у больных хроническим гепатитом С 71
3.2.3. Экспрессия активационных маркеров на Т-лимфоцитах у больных хроническим гепатитом С 74
3.3. Характеристика В-клеточного иммунитета при хроническом гепатите С 76
3.3.1. Содержание В-клеток и экспрессия активационных маркеров на их поверхности у больных ХГС 76
3.3.2. Уровень сывороточных иммуноглобулинов и циркулирующих иммунных комплексов у больных хроническим гепатитом С 79
3.4. Изучение факторов врожденного иммунитета (неспецифической резистентности) при хроническом гепатите С 85
3.4.1.Экспрессия CD56 и CD8 молекул на естественных киллерах у больных хроническим гепатитом С 85
3.4.2. Оценка функциональной активности нейтрофилов у больных хроническим гепатитом С 88
3.4.3. Уровень компонентов системы комплемента у больных хроническим гепатитом С 91
3.4.4. Уровень цитокинов у больных хроническим гепатитом С 93
3.5. Сравнительный анализ групп больных ХГС, имеющих различное количество В-лимфоцитов, экспрессиругощих HLA-DR 99
3.6. Сравнительный анализ групп больных ХГС с различными субтипами вируса гепатита С 104
3.7. Сравнительный анализ групп больных ХГС с различной степенью активности патологического процесса в печени 110
3.8. Сравнительный анализ групп больных ХГС с различными стадиями хронического гепатита 116
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 123
Выводы 138
Практические рекомендации 139
Список литературы 140
- Факторы неспецифической защиты, участвующие в противовирусном иммунитете при гепатите С
- Современное представление о механизмах персистенции HCV
- Определение сывороточных иммуноглобулинов класса Е, М, A, G, подклассов IgG, цитокинов и компонентов системы комплемента методом ИФА
- Характеристика В-клеточного иммунитета при хроническом гепатите С
Введение к работе
Актуальность проблемы. В мире проживает, как минимум, 500 млн человек, инфицированных вирусом гепатита С (HCV) [1]. Особенностью HCV-инфекции является ее преимущественно бессимптомное течение, В период острого гепатита желтуха проявляется только менее чем у 20% инфицированных. Молниеносный (фульминаитный) гепатит развивается очень редко [156]. Персистенция вируса гепатита С длится многие годы по типу медленной инфекции, приводя к развитию хронического гепатита С (>85%), цирроза печени (20-30%) и гепатокарциномы (4-8%) [31, 156]. Частота формирования хронической патологии печени, вызванной HCV, по крайней мере в 10 раз выше чем при вирусном гепатите В [31]. HCV присуща высокая скорость мутаций. Наиболее лабильны гены, кодирующие поверхностные антигены вируса, являющиеся основной мишенью иммунной атаки. При такой высокой изменчивости HCV происходит как бы постоянное «состязание на скорость» между образованием новых антигенных вариантов и механизмами их нейтрализации в котором, в итоге, побеждает вирус [31].
I-1CV, в отличие от вируса гепатита В (HBV), оказывает прямое цитопатическое действие [31, 46]. Углубленное изучение гистопатологических, клинических и иммунологических особенностей хронической HCV-инфекции показало, что в патогенезе поражений печени, помимо прямого цито пати чес кого эффекта вируса, могут играть роль и иммунные механизмы. Появились многочисленные свидетельства того, что иммунные реакции, возникающие при длительной персистенции HCV, могут привести к появлению органослецифических и неспецифических аутоантител, с последующим развитием внепеченочных проявлений хронической HCV-инфекции [19, 30]. HCV - не только гепатотропный, но и лимфотроппый вирус. Описана его репликация в мононуклеарных клетках крови, что может служить постоянным стимулом для активации Т- и В- лимфоцитов с последующим образованием аутоантител и циркуляцией иммунных комплексов [10, 19].
Проблеме патогенеза гепатита С и изучению характера иммунного ответа на вирусный агент посвящены многие исследования. Эффективность и тип иммунного реагирования на различные инфекционные агенты определяются активностью клеточного и гуморального звеньев иммунитета. Развитие иммунного ответа регулируется через продукцию иммунокомпетентными клетками, в частности, Т-хелперами 1-го и 2-го типов, регуляторных молекул цитокинов. Ведущая роль в осуществлении противовирусного иммунитета отводится Т-клеточному иммунному ответу, но из-за низкой иммуногенности вируса гепатита С наблюдается слабая Т-клеточная реакция [24]. Процессы хронизации при гепатите С (ГС) также связывают с формированием гуморального иммунного ответа [86, 126, 177, 196], который развивается при доминирующем влиянии Т-хелперов 2-го типа.
Результаты оценки иммунного статуса различных контин гейтов, инфицированных HCV, весьма противоречивы. Дальнейшее изучение иммунного ответа при различных формах ГС, поможет найти эффективные методы коррекции системы защиты инфицированных, повысит результативность лечения.
Цель исследования. На основании комплексного клинико-иммунологического обследования дать характеристику противовирусного иммунитета у больных хроническим вирусным гепатитом С (ХГС), оценить диагностическую значимость иммунологических показателей при хроническом гепатите С.
Задачи исследования.
1. Выявить нарушения со стороны различных звеньев иммунитета при хроническом гепатите С.
2. Провести сравнительный анализ показателей Т-клеточного, В- клеточного и врожденного иммунитета между больными ХГС и здоровыми лицами, а также между группами больных с различными генотипами HCV, степенью активности ХГ, степенью фиброза.
3. Установить степень корреляционных взаимосвязей между иммунологическими и клиническими показателями при хроническом гепатите С. -
4. Разработать предложения по иммунологическому обследованию больных хроническим вирусным гепатитом С.
Научная новизна.
У больных ХГС проведено углубленное комплексное иммунологическое исследование с помощью таких высокочувствительных современных методов исследования как проточная цитометрия и иммуноферментный анализ. Проведен корреляционный анализ между клиническими и иммунологическими показателями.
Впервые изучено содержание Т-киллеров (CD3+CD56+), естественных киллеров, экспрессирующих молекулу CD8 (CD3'CD8+), Т- и В-лимфоцитов, экспрессирующих молекулы активации CD25 и HLA-DR, подклассов IgG, компонентов системы комплемента и низкомолекулярных иммунных комплексов в периферической крови больных ХГС, что позволяет уточнить иммунопатогенез заболевания.
Было проведено сравнение иммунологических показателей между группами больных с различными генотипами HCV, степенью активности патологического процесса, степенью фиброза.
Практическая значимость.
На основе исследуемого материала рекомендовано определение иммунологических показателей, которые могут служить дополнительными информативными критериями, позволяющими дифференцировать субтипы HCV За и lb, а также судить о степени активности патологического процесса в печени и степени фиброза, что поможет практическому врачу выбрать правильную стратегию лечения
Основные положения., выносимые на защиту.
1, У больных ХГС, в целом, иммунный ответ характеризуется увеличением количества В-клеток, экс премирующих HLA-DR, повышением уровней сывороточных IgM, IgA и низкомолекулярных ЦИК при отсутствии характерных изменений со стороны субпопуляций Т-клеток, что свидетельствует об отклонении иммунного ответа почти у половины больных ХГС в сторону Th2. Нарушение цитокиновой регуляции иммунного ответа у пациентов с ХГС проявляется в гиперпродукции провоспалительных цитокинов ИЛ-lp, ИЛ-8 и недостаточной продукции ИЛ-2.
2. Изменения некоторых иммунологических показателей при сравнении отдельных подгрупп пациентов с ХГС, различающихся по субтипам HCV, активности патологического процесса в печени и выраженности фиброза могут служить дополнительными критериями позволяющими дифференцировать субтипы HCV lb и За, а также ориентировочно прогнозировать степень активности патологического процесса в печени и стадию хронического гепатита.
Апробация и реализация работы. Материалы диссертации доложены на 4-й научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000» (Санкт-Петербург, 23-25 мая 2000), 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 26-27 апреля 2001), 5-й научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001» (Санкт-Петербург, 21-24 мая 2001),
Всероссийской научной конференции, посвященной 125-летию со дня рождения профессора Н.К.Розенберга и 105-летию основания кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 17-18 октября 2001), 6-й Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002» (Санкт-Петербург, 20-23 мая 2002), 1-й съезд военных врачей медико-профилактического профиля ВС РФ (Санкт-Петербург, 26-28 ноября 2002), научной конференции и 7-м съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (Санкт-Петербург, 5-6 декабря 2002), 7-го Всероссйского научного Форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 23-26 июня 2003).
По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 222 источника, в том числе 44 отечественных и 178 зарубежных авторов. Текст иллюстрирован 31 таблицами и 9 рисунками.
Факторы неспецифической защиты, участвующие в противовирусном иммунитете при гепатите С
Защита организма от инфекции складывается из последовательного включения в борьбу с проникшим возбудителем факторов естественной резистентности (врожденный иммунитет) и специфического иммунного ответа (приобретенный иммунитет), составляющих в конечном счете единый функциональный комплекс [29, 39].
Факторы естественной резистентности включаются в защиту сразу после внедрения возбудителя во внутреннюю среду организма. Их действие продолжается в течение всего периода борьбы организма-хозяина с инфекцией, но наиболее эффективно они работают в течение первых 4-х часов после внедрения инфекционного агента, когда они являются практически единственными защитниками [39].
HCV, как и возбудители вирусных гепатитов иной этиологии, относится к гепатотропным вирусам. Он попадает в печень непосредственно через кровь и проникает в гепатоциты, где происходит его репликация [32].
Среди факторов неспецифической резистентности основную роль в элиминации вируса играют естественные киллеры, интерфероны и макрофаги [29]. Главными защитниками организма на ранней стадии инфекции являются NK-клетки, Они характеризуются наличием двух важных функций. Во-первых, NK-клетки обладают цитотоксической активностью в отношении вирусинфицированных клеток [39]. Они распознают клетки, которые подверглись изменениям, вызванными инфекцией и уничтожают их. В очагах инфекции естественные киллеры находятся в активированном состоянии. NK-клетки поражают клетки-мишени, нагруженные антителами IgG (G1 и G3), при участии своих рецепторов для IgG (FCYRIII, или CD 16). Эта активность названа антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностыо (АЗКЦ). Клетки-эффекторы, которые осуществляют клеточно-опосредованный цитолиз инфицированных клеток называют К-клетками (разновидность NK-клеток) [29, 44, 151]. Эти клетки не экспрессируют ни Т-клеточных, ни В-клеточных антигенсвязывающих рецепторов. NK-клетки чаще всего выявляют с использованием момоклональных антител к CD 16 (Fey RIII), CD56 и CD57 [29]. В работе Е,А. Иоанниди [11] выявлено снижение уровня NK-клеток (CD 16) у больных острым гепатитом С (ОГС) как на высоте клинических проявлений (у Ул больных), так и в период выздоровления (у 86% больных). Причем у больных, потребляющих наркотики наблюдалось стойкое снижение уровня этих клеток. Обследование пациентов с хроническим гепатитом С (ХГС) также показало снижение экспрессии антигена CD 16 на лимфоцитах [21]. Авторы считают, что причиной этого являются нарушения в механизмах активации NK-клеток [21]. Сниженная экспрессия CD16 у больных ХГС, в свою очередь, может быть связана с уменьшением числа К-клеток и их участием в антителозависимом клеточно-опосредованном цитолизе [21].
Другой важной функцией NK-клеток является участие в общем каскаде синтеза цитокинов, активирующих новых участников иммунной защиты. Они обладают способностью продуцировать ИФН-а, -р и -у, ИЛ-1, -2, -3, -8, ФНО-а и -(З, ГМ-КСФ, хемотаксические факторы, а также проста гланди ны, р эндорфин, серотонин, адреналин и мел атонии [39, 44]. Возможно, некоторые из этих факторов выступают в качестве кофакторов цитолиза. Однако, по видимому, их главная роль состоит в иммунорегуляции [44], л
Активность естественных киллеров в отношении инфицированных клеток может быть усилена в 100 раз под влиянием ИЛ-12 и ИФН-а, продуцируемых моноцитами/макрофагами и ИФН-Р, продуцируемого фибробластами. Кроме того, ИЛ-12 совместно с фактором некроза опухоли (ФИО) обладает способностью индуцировать синтез NK-клетками ИФН-у, также обладающего выраженной способностью активировать моноциты/макрофаги и новые NK-клетки. Следовательно, еще до вступления в борьбу с инфекцией антигенспецифичсских Т-лимфоцитов, главных продуцентов у-интерферона, NK-клетки начинают продукцию этого важного участника защиты организма от внутриклеточных возбудителей [39, 154].
На стадии неспецифической защиты активированные макрофаги продуцируют цитокины, действие которых определяет основные механизмы защиты на первых этапах развития инфекционного процесса. Существует цитокиновая сигнальная сеть, участвующая в регуляции реакций врожденного и специфического иммунитета, в том числе воспаления, противовирусной защиты, пролиферации антигенспецифичных Т- и В-клеток, активации их функций [29]. На ранней стадии воспаления продуцируются и секретируются провоспалительные цитокины, участвующие в запуске специфического иммунного ответа и в эффекторной его фазе. В эту группу включают: ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ФНО-а, ИФН-у. Альтернативную группу представляют противовоспалительные цитокины, из числа которых в наибольшей степени охарактеризованы: ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, и ТФР-р [36].
В ряде работ показано, что формирование хронического гепатита С сопровождается значительным повышением уровня провоспалительных цитокинов, таких как ФНО-а, ИЛ-ір, ИЛ-6, ИЛ-8, причем уровни ФНО-а и ИЛ-lp при циррозе печени и гепатоцеллюлярной карциноме были выше, чем при ОГС и ХГС [22, 108, 152]. Избыточная секреция этих цитокинов говорит о нарушении регуляции их выработки, что может стать причиной иммунопатологии и способствовать прогрессированию заболевания. Известно, что ФНО-а как самостоятельно, так и в комплексе с другими цитокинами участвует в активации цитотоксичности клеток [14, 43]. Мононуклеары периферической крови (МНПК) больных ХГС продуцировали in vitro повышенные количества ФНО-а, особенно в случаях высокой активности сывороточной аланинаминотрансферазы (АлАТ), что говорит о возможном вкладе этого цитокина в процесс иммунного воспаления в печени [42]. Концентрация ИЛ-6 была повышена у всех HCV-инфицированных, а ИЛ-8 — только в начальных стадиях заболевания [5].
Современное представление о механизмах персистенции HCV
По современным представлениям главным механизмом персистеиции HCV является мультивариантная изменчивость вируса с непрерывно продолжающимся образованием квазивидов. Причем скорость мутаций существенно превышает скорость репликации вируса, что и определяет его многолетнее персистирование.
Еще один механизм персистеиции связан с возможностью внепсченочной репликации HCV. У большинства пациентов с острым гепатитом С иммунная система неспособна элиминировать вирус, что позволяет HCV непрерывно реплицироваться в гепатоцитах и, возможно, в других клетках. Показано, что репликация HCV, хотя и медленная, может происходить в гематопоэтических стволовых CD34 клетках [79]. Спектр внепсченочной репликации HCV — это клетки-предшественники гемопоэза, лимфоциты и моноциты периферической крови, миофибробласты [10, 30, 135, 198]. В этом случае вирусы становятся недосягаемыми для иммунного контроля [31, 203, 220]. Эти факты могут объяснять извращение иммунных функций инфицированных лимфоцитов и моноцитов, позволяющее вирусу "избегать" иммунного надзора и реплицироваться в "иммунонеприкосновенных" местах. Такая "иммунонеприкосновенная" локализация вируса является одной из причин не только хронизации процесса, но и неэффективности лечения противовирусными препаратами [30]. В тоже время нет единого мнения о том, происходит ли репликация HCV не только в печени, или еще и в других органах и тканях. По данным некоторых авторов вирус реплицируется исключительно в гепатоцитах [18, 129, 175]. Так, американские ученые опубликовали свои исследования, на основании которых сделан вывод о том, что HCV пассивно адсорбируется на мононуклеарах крови, поступая из сыворотки, а не размножается в них [132].
Итальянские ученые в своих исследованиях обнаружили, что состав квазивидов HCV в печени, мононуклеарах периферической крови и плазме неоднороден как по числу генетических вариантов, так и по их электрофоретической мобильности. Геномные варианты, присуствующие в печени и/или клетках крови, не были обнаружены в плазме, в то же время, некоторые варианты вируса были найдены только в плазме [147]. Исследования испанских ученых показали более высокую вариабельность генома вируса гепатита С в сыворотке, чем в печени и мононуклеарах периферической крови. Причем, геномные последовательности из мононуклеарных клеток и клеток печени были более близки друг другу, по сравнению с таковыми из сыворотки [169]. Тесты в культурах МНПК подтверждают концепцию о том, что дивергенция может происходить за счет вирусной адаптации или роста в различных типах клеток [146].
Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в обратнотранскриптазном (RT) варианте позволили преодолеть трудности обнаружения РНК HCV, которые были связанны с низким уровнем возбудителя в организме хозяина. В последние годы стало возможным определять не только геномную плюс-цепь РНК, но и минус-цепь РНК, синтезируемую в процессе репликации вируса и служащую матрицей для вновь образующихся плюс-цепей РНК HCV. Е.И. Лакина с соавт. [18] изучали образцы лимфоцитов пациентов с HCV-инфекцией, содержавшие геномную РНК, гнездовым методом ПЦР с праймерами на негативные цепи РНК HCV. Ни в одном из образцов такие цепи РНК не были выявлены. Эти данные могут свидетельствуют в пользу представления об отсутствии репликации вируса в клетках крови [209] и поволяют предположить, что лимфоциты выступают скорее как "резервуар" и (или) "переносчик" вируса, чем место его репликации [18].
Считается, что HCV обладает прямым цитопатическим действием, т.е. вызывает цитолиз инфицированных гепатоцитов [32, 46, 48, 97]. Такое действие само по себе недостаточно для персистенции вируса. Но, в отличие от вируса гепатита Л (HAV), HCV обладает не сильной, а слабой иммуногенностью. В сочетании со слабой иммуиогенностыо прямое цитопатическое действие HCV может в определенной мере способствовать развитию хронической патологии печени [31].
В то же время, существует мнение, что повреждение печени при ГС вызывается только иммуно-опосредованными механизмами. Так, российские авторы в своих исследованиях не обнаружили зависимости между присутствием РНК HCV в печени и основными показателями активности патологического процесса [18]. Этот факт позволил им сделать заключение о том, что HCV не оказывает прямого цитопатического действия на клетки печени, повреждение которых, по-видимому, является следствием действия иммунных механизмов. Это предположение согласуется с данными других авторов об отсутствии корреляции между количеством РНК HCV в печени, гистологической картиной и степенью фиброза [72, 170].
Вместе с тем, нельзя полностью исключать и непосредственное повреждение клеток печени, вызванное, например, высвобождением вируса из гепатоцитов, поскольку механизм "выхода" вируса из клеток до сих пор не ясен [18,138].
Обсуждается также роль прямого цитопатического действия HCV на гепатоциты за счет активации рецепторов особого рода — Аро I/Fas-рецепторов (CD95) [85]. У больных острым или хроническим вирусным ГС экспрессия рецепторов Аро I/Fas на гепатоцитах возрастает более чем в 3-5 раз. Этого не наблюдается у больных с острыми алкогольными поражениями печени [84, 188]. Стимулятором рецепторов Аро I/Fas является матричная РНК (мРНК). Такая лигандная мРНК не обнаруживается в здоровой печени, вместе с тем во всех случаях гепатоцеллюлярного повреждения отмечаются более высокие значения лигандной мРНК. Исследования показали, что при заболеваниях печени, вызванных HCV и HBV, экспрессия лигандной мРНК осуществляется на цитотоксических Т-лимфоцитах, что подтверждает важную роль иммунной системы в патогенезе хронических вирусных гепатитов [34].
Определение сывороточных иммуноглобулинов класса Е, М, A, G, подклассов IgG, цитокинов и компонентов системы комплемента методом ИФА
Определение в сыворотке крови интерлейкина-6 (ИЛ-6), фактора некроза опухолей-а (ФНО-а), интерферона -а (ИФН-а), интерлейкина-1р (ИЛ-1р), интерлейкина-2 (ИЛ-2), интерлейкина-8 (ИЛ-8) проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для этого использовались зарубежные коммерческие тест-системы «Boehringer Mannheim» (Австрия) и отечественные - ЗАО "Вектор-Бест-Балтика", НПО «Протеиновый контур». Методом ИФА определяли также сывороточные иммуноглобулины IgE и подклассы IgG (IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4), а также компоненты системы комплемента С1-инг, СЗ, СЗа, С4, С5 и С5а с использованием отечественных диагностикумов (ООО "Стибиум плюс") и (ЗАО "Вектор-Бест-Балтика"), соответственно.
Все эти тест-системы основаны на «сендвич»- методе твердофазного иммуноферментного анализа с применением моноклональных антител к двум различным эпитопам цитокина. При этом одно антитело используется для покрытия лунок планшета для ИФА, другое антитело, коныогировашюе с ферментом, чаще всего пероксидазой хрена, используется для проявления цветной реакции. Анализ проводится в три стадии.
На первой стадии калибровочные пробы с известной концентрацией определяемого фактора, а также исследуемые образцы инкубировали (1,5 ч) в лунках стрипованного планшета с иммобилизованными на поверхности лунок высокоспецифичными антителами (МКА) к определяемому фактору. Затем лунки трижды промывали промывочным буфером с последующим декантированием. Остатки жидкости удаляли постукиванием рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге. На второй стадии связавшийся в лунках с первыми МКА определяемый фактор обрабатывали вторыми МКА, меченные биотипом и инкубировали в течении 1,5 ч при непрерывном встряхивании. После инкубации повторяли процесс промывания. На третьей стадии во все лунки планшета вносили коныогат стрептавидина с пероксидазой хрена и инкубировали в течении часа при непрерывном встряхивании. После удаления избытка коныогата в лунки вносили субстратную смесь, содержащую перекись водорода и о-фенилендиамин (ОФД). При этом ОФД окисляется с образованием красителя, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации определяемого фактора в анализируемом образце. Ферментативную реакцию останавливали добавлением стоп-реагента, а интенсивность окраски измеряли на фотометре для ИФА при длине волны 492 им.
Спонтанную и индуцированную продукцию клетками крови цитокинов ИЛ1-р, ИЛ-2 и ИЛ-8 в ИФА определяли с применением отечественных диагіюстикумов (ТОО «Цитокин», «Протеиновый контур»). Для этого, к 0,6 мл гепаринизированной крови добавляли 2,4 мл среды Игла с 2мМ глутамина и 80 мкг/мл гентамицина (т.е кровь разводят в 5 раз). Затем готовили рабочие растворы индукторов синтеза цитокинов - фитогеммаглютинина (ФГА) и ЛПС-содержащего препарата продигиозана следующим образом: к 1,8 мл среды Игла добавляют 200 мкл маточного раствора ФГА (1мкг/мл). Таким образом получают раствор, в котором в 100 мкл содержится 10 мкг ФГА, что является оптимальной дозой для стимуляции продукции ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6. Для приготовления рабочего раствора продигиозана смешивали 2,4 мл среды Игла и 800 мкл 0,005% раствора продигиозана, в результате в 100 мкл полученного раствора содержится 1 мкг продигиозана. Этот раствор используется для индукции синтеза ИЛ-1, ФНО-ос, ИЛ-8, ИФН-ое. Затем в 96-луночный планшет для культивирования клеток в первые шесть лунок каждого ряда вносили по 100 мкл рабочего раствора ФГА, в следующие шесть лунок каждого ряда - по 100 мкл рабочего раствора продигиозана и в последние шесть лунок каждого ряда - по 100 мкл среды Игла. Подготовленные образцы периферической крови вновь тщательно перемешивали и вносили по 100 мкл во все лунки ряда. Культивирование проводили в С02-инкубаторе в течении 24 часов, после чего осторожно отбирали супернатанты и исследовали на наличие цитокинов методом ИФА, как уже описано выше.
Сывороточные ИЛ-10, ИЛ-2 и ИЛ-8, их спонтанную и индуцированную продукцию клетками крови определяли совместно с лабораторией ГосМИИ ОЧБ (руководитель лаборатории — доктор медицинских наук, профессор А.С. Симбирцев)
Кроме ИФА использовались также другие методы определения интерферонов и иммуноглобулинов:
1. Сывороточные сумм. ИФН, ИФН-а, ИФН-у определяли методом количественной гемадсорбции по Н.Б. Финтеру (1964) в модификации О.А. Аксенова (1987) совместно с лабораторией СПНИИ детских инфекций (руководитель лаборатории - доктор медицинских наук, профессор О.А. Аксенов).
2. Сывороточные иммуноглобулины классов М, G и А определяли методом простой радиальной иммунодифузии по G.Mancini ct al. (1965).
Характеристика В-клеточного иммунитета при хроническом гепатите С
Определение CD 19 показало, что 64% больных имеют нормальное содержание В-лимфоцитов, 26% - повышенное и 10% пониженное. Сравнительный анализ средних значений относительного содержания CD между группой больных ХГС и группой здоровых лиц не показал достоверных различий (табл. 3.8.).
На В-лимфоцитах, также как и на Т-лимфоцитах, определяли активационные молекулы HLA-DR и CD25. Исследование относительного содержания клеток с фенотипом CD3"HLA-DR+ (В-клетки) показало, что повышение их числа наблюдалось у 48,5% больных, столько же больных имели нормальные зачения (48,5%) и 3% - пониженные (рис. 3.4.).
При определении активационной молекулы CD25 на поверхности В-клеток (CD3"CD25+) отмечалось повышение уровня экспрессии этого маркера у 31%) больных ХГС, у 17%о - отмечалось понижение и у 52% пациентов находилось в пределах нормы. Сравнительный анализ средних значений показателей активации В-лимфоцитов между группой больных и группой здоровых лиц выявил статистически значимые различия с высокой степенью достоверности по относительному содержанию В-лимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR (табл. 3.8). Относительное содержание В-лимфоцитов, экспрессирующих CD25 было несколько выше (но не достоверно р=0,1) у больных ХГС.
Несмотря на небольшое количество человек в контрольной группе (табл. 3.8.), при сравнении средних значений относительного содержания CD3"HLA-DR+ между группами больных и здоровых, фактическая величина t-критсрия Стыодента (3,21) была выше его критической точки (2,7) при р 0,01. При сравнении средних значений относительного содержания CD19+HLA-DR+ между этими группами фактическая величина t-критерия Стыодента (2,49) также превышала критический (2,04) при р 0,05.
При проведении корреляционного анализа между относительным содержанием лимфоцитов, экспрессирующих молекулы активации CD25 и HLA-DR с одной стороны и CD 19 с другой (табл. 3.9.) была выявлена прямая сильная связь между HLA-DR и CD 19 и прямая средней силы связь между CD25 и CD19. Эти данные могут косвенно указывать на то, что среди лимфоцитов у больных ХГС активированны, в основном, В-клетки.
Как видно из полученных данных (табл. 3.8., рис. 3.4.), почти у половины больных ХГС (48,5%) В-клетки, по-видимому, активированы па стадии представления антигена Т-хелперам. Следовательно, у этих больных Т-хелперы скорее всего "склоняются" к дифференцировке в Тп2. Повышение количества В-лимфоцитов, экспрессирующих CD25 у 31% больных ХГС может указывать на то, что В-клетки у этих больных, возможно, находятся в стадии пролиферации, что также подтверждает развитие Th2 ответа неэффективного при элиминации вирусного патогена.
В сыворотке здорового человека около 65% общего белка составляет альбумин, а остальные белки принято делить в соответствии с их электрофоретической подвижностью на а-, р- и у-глобулины. Фракции у-глобулинов соответствуют антитела - иммуноглобулины [34]. Биохимический анализ сыворотки крови показал (табл. 3.2.), что большинство больных ХГС (80%) имели повышенное содержание у-гло були нов. Средние значения относительного содержания у-глобулинов у больных (22,9%±0,4) были гораздо выше верхней границы нормы (12-18%).
Сывороточные иммуноглобулины являются важнейшими показателями гуморального звена иммунной системы. При проведении иммунологического исследования по содержанию иммуноглобулинов в сыворотке крови методом радиальной иммунодиффузии по G.Mancini были получены следующие результаты.
![Клинико-биохимическая характеристика больных туберкулезом легких с сопутствующими хроническими гепатитами B и/или C [Электронный ресурс]](/i/i/4605/189084.png "Клинико-биохимическая характеристика больных туберкулезом легких с сопутствующими хроническими гепатитами B и/или C [Электронный ресурс] Харламова Юлия Михайловна")
