Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Структура и основные физические характеристики липидных мембран 10
2.1.1. Развитие представлений и современные взгляды на структуру и функции биологических мембран 10
2.1.2. Структура липидных молекул и фазовые равновесия в мембранах 14
2.1.3. Модели биологических мембран 23
2.1.4. Кривизна бислоя и свободная энергия его деформации 25
2.1.5. Дефекты в биологических мембранах 28
2.1.5.1. Классификация дефектов 28
2.1.5.2. Свободный объем мембраны как количественная мера степени дефектности 30
2.1.5.3. Дефекты в мембранах как области повышенной чувствительности к действию инородных компонентов 32
2.1.6. Домены в липидных мембранах 34
2.1.7. Подвижность липидных молекул в мембранах 38
2.1.7.1. Латеральная диффузия 38
2.1.7.2. Трансбислойная миграция (флип-флоп) 39
2.1.7.3. Изменение скорости флип-флопа липидов под действием природных и синтетических эффекторов 42
2.1.8. Микровязкость мембранных структур 47
2.1.8.1. Использование флуоресцентных зондов для исследования физического состояния
биологических мембран 47
2.1.8.2. Изменение микровязкости мембран под действием экзогенных эффекторов 51
2.1.9. Электрические свойства липидных мембран 52
2.1.10. Проницаемость мембран 59
2.1.10.1. Проницаемость мембран для незаряженных соединений 59
2.1.10.2. Ионная проницаемость мембран 63
2.2. Взаимодействие водорастворимых полимеров с биологическими мембранами.„67
2.2.1. Нейтральные гидрофильные полимеры 67
2.2.1.1. Полиэтиленоксид: конформация в растворе и взаимодействие с мембранами 68
2.2.1.2. Гидрофильные поливиниламиды и полиакриламид 74
2.2.1.3. Полимеры, содержащие гидроксильные группы (поливиниловый спирт, декстраны и фруктаны): взаимодействие с липидными мембранами и клетками 75
2.2.2. Амфифильные гомо- и сополимеры 78
2.2.2.1. Амфифильные производные гидрофильных полимеров, содержащие статистически или равномерно распределенные короткие гидрофобные радикалы 78
2.2.2.2. Биогенные амфифильные интерполимерные комплексы поли-Я-З-окси-бутирата и полифосфата: биологическая функция, структура и влияние на проницаемость мембран.81
2.2.2.3. Поверхностно-активные вещества, состоящие из гидрофильных полимеров и углеводородов 82
2.2.2.4. Амфифильные полиалкиленоксиды 93
2.2.2.4.1.Синтез, номенклатура и физико-химические свойства полиалкиленоксидов 93
2.2.2.4.2.Взаимодействие плюроников с белками 104
2.2.2.4.3. Взаимодействие плюроников с липидными структурами 105
2.2.2.4.3.1. Связывание плюроников с бислойными мембранами и их локализация в бислое
2.2.2.4.3.2. Влияние плюроников на проницаемость липидных мембран 109
2.2.2.4.4. Медицинское применение плюроников 112
2.2.2.4.4.1. Использование плюроников в медицине в качестве эмульгаторов 115
2.2.2.4.4.1. Использование плюроников в медицине в качестве эмульгаторов 115
2.2.2.4.4.2. Использование антиадгезивных свойств плюроников для гидрофилизации полимерных поверхностей 116
2.2.2.4.4.3. Влияние плюроников на распределение латексных частиц и низкомолекулярных соединений между различными органами 116
2.2.2.4.4.4. Взаимодействие плюроников с компонентами иммунной системы 117
2.2.2.4.4.5. Влияние плюроников на функции биологических систем 119
2.2.2.4.4.6. Использование надмолекулярных ассоциатов плюроников для доставки лекарственных препаратов к очагу поражения 121
2.2.2.4.4.7. Множественная лекарственная устойчивость опухолей и ее преодоление с помощью плюроников 123
2.2.3. Полиэлектролиты 126
2.2.3.1. Закономерности адсорбции полиэлектролитов на мембранах 126
2.2.3.1.1. Адсорбция полиэлектролитов на твердых поверхностях и липидных везикулах, находящихся в гель-фазе 126
2.2.3.1.2. Взаимодействие полиэлектролитов с липидными мембранами, находящимися в жидко-кристаллической фазе 129
2.2.3.1.2.1. Взаимодействие полиэлектролитов с мультиламеллярными липосомами 129
2.2.3.1.2.2. Взаимодействие полиэлектролитов с мембранами преформированных малых и больших везикул 133
2.2.3.1.2.3. Взаимодействие полиэлектролитов с гигантскими липосомами 135
2.2.3.1.2.4. Взаимодействие полиэлектролитов с мембранами, содержащими белок 137
2.2.3.2. Влияние полиэлектролитов на динамические процессы в мембранах 139
2.2.3.3. Биологические эффекты полиэлектролитов и их использование в био-медицинских исследованиях 142
2.2.3.3.1. Взаимодействие поликатионов с биологическими мембранами 143
2.2.3.3.2. Биологические эффекты, вызываемые полианионами 145
2.2.3.3.3. Использование полиэлектролитов как носителей для доставки лекарств 146
3. Постановка задачи 151
4. Результаты и обсуждение 152
4.1. Взаимодействие нейтральных амфифильных полимеров с биологическими и липидными мембранами 152
4.1.1. Связывание полимеров с биологическими и липидными мембранами 152
4.1.1.1. Получение полимеров, меченых тритием 152
4.1.1.2. Связывание полимеров с клетками 154
4.1.1.2.1. Выделение клеток 155
4.1.1.2.2. Кинетика связывания 157
4.1.1.2.3. Оценка количественных параметров связывания полимеров с клетками 159
4.1.1.3. Связывание полимеров с микросомамальными мембранами 163
4.1.1.3.1. Выделение микросомальных мембран печени мыши.. 163
4.1.1.3.2. Определение количественных параметров связывания плюроника Р85 с микросомальными мембранами 164
4.1.1.4. Связывание полимеров с липидными везикулами (липосомами) 169
4.1.1.5. Изучение локализация полиалкиленоксидов в бислойных мембранах методом
малоуглового рассеяния нейтронов 177
4.1.2. Влияние полимеров на свойства липидных мембран 184
4.1.2.1. Влияние полимеров на микровязкость клеточных и модельных мембран 184
4.1.2.2. Влияние плюроника L61 на скорость флип-флопа в модельных липидных мембранах 190
4.1.2.3. Взаимосвязь между структурой амфифильных сополимеров и их способностью ускорять флип-флоп в липидных мембранах 195
4.1.2.2.4. Влияние плюроников на транспорт ионов через липидные мембраны 204
4.1.2.2.5. Влияние амфифильных сополимеров на проницаемость липидных мембран по отношению к противоопухолевому антибиотику доксорубицину 207
4.1.2.2.5.1. Определение количественных параметров взаимодействия доксорубицина с ДНК и липидными мембранами 207
4.1.2.2.5.2. Кинетика транспорта доксорубицина через мембраны моноламеллярных липосом 211
4.1.2.2.5.3. Влияние плюроника L61 на транспорт доксорубицина через мембраны липосом 217
4.1.2.2.5.4. Взаимосвязь между структурой амфифильных полимеров и их воздействием на транспорт доксорубицина через модельные мембраны 222
4.1.2.2.6. Влияние плюроника на транспорт различающихся по своей структуре соединений 224
4.1.2.2.7. Влияние состава липидного бислоя на его чувствительность к возмущающему действию плюроника 228
4.1.2.3. Физико-химические предпосылки возмущающего действия амфифильных полимеров на свойства мембран 235
4.2. Поликатионы 239
4.2.1. Влияние поли-(1Ч-этил-4-винилпиридина) на проницаемость липосомальных мембран по отношению к доксорубицину 244
4.2.2. Влияние молекулярной массы и химической структуры поликатиона на его способность ускорять транспорт доксорубицина через отрицательно заряженные липидные мембраны 247
4.2.3. Зависимость вызываемого поликатионами увеличения проницаемости мембран, от содержания в них анионных липидов 257
4.2.4. Влияние низкомолекулярного электролита на оказываемое поликатионом ускорение мембранного транспорта доксорубицина 259
4.2.5. Влияние природы анионных компонентов мембраны на ее взаимодействие с поликатионами 260
4.2.5.1. Взаимодействие поли(Ы-этил-4-вининилпиридиний бромида) с липидными везикулами, содержащими ганглиозид GM1 261
4.2.5.2. Взаимодействие поли(Ы-этил-4-вининилпиридиний бромида) с липидными везикулами, содержащими искусственно гидрофобизованный ос-химотрипсин 263
4.2.6. Причины воздействия поликатионов на проницаемость липидных мембран 272
4.3. Полианионы 276
4.3.1. Влияние полиакриловой кислоты на транспорт доксорубицина через липидную мембрану 276
4.3.2. Связывание полиакриловой кислоты с доксорубицином 278
4.3.2.1. Изменение свойств доксорубицина при взаимодействии с полиакриловой кислотой 279
4.3.2.2. Состав комплексов доксоорубицина с полиакриловой кислотой 282
4.3.2.3. Стабильность комплексов 284
4.3.2.4. Стабилизация комплексов за счет гидрофобной модификации поликислоты 287
4.3.3. Взаимодействие комплексов доксорубицина и полиакриловой кислоты с липосомами 288
4.3.3.1. Взаимодействие комплексов с безградиентными липосомами 289
4.3.3.2. Механизм взаимодействия комплексов с рН-градиентными везикулами 292
4.3.4. Влияние комплексов полиакриловой кислоты и доксорубицина на ионную
проницаемость липидных мембран 295
5. Заключение 297
6. Выводы 301
Список литературы
- Развитие представлений и современные взгляды на структуру и функции биологических мембран
- Гидрофильные поливиниламиды и полиакриламид
- Взаимодействие полиэлектролитов с липидными мембранами, находящимися в жидко-кристаллической фазе
- Оценка количественных параметров связывания полимеров с клетками
Введение к работе
Липидные мембраны играют ключевую роль в регуляции биохимических процессов, происходящих в живых организмах [1]. Поэтому исследование структурной организации липидных мембран и факторов, влияющих на их свойства, вызывают неослабевающий интерес. Известно, что при взаимодействии некоторых водорастворимых белков с биологическими мембранами происходит пермеабилизация мембран, латеральная сегрегация их компонентов, а иногда и слияние мембран [2]. Для выяснения физико-химической основы этих процессов большое значение имеют модельные работы, суть которых состоит в изучении взаимодействий в более простых системах с контролируемым составом [3]. В качестве одной из таких моделей часто исследуется взаимодействие бислойных мембран, построенных из синтетических или очищенных природных липидов, и синтетических полимеров, обладающих известным строением.
Взаимодействие водорастворимых полимеров с биологическими мембранами представляет и самостоятельный интерес. Во-первых, за последние два десятка лет предложен целый ряд подходов, открывающих перспективы использования водорастворимых полимеров в медицине и биотехнологии. Так, свойство некоторых полиэлектролитов усиливать иммунный ответ нашло применение при создании искусственных вакцин [4, 5]. Способность поликатионов образовывать прочные комплексы с нуклеиновыми кислотами и облегчать их проникновение в клетку нашло применение при конструировании реагентов для трансфекции [6-8]. Наконец, способность некоторых амфифильных сополимеров ингибировать мембранные переносчики и облегчать проникновение лекарств в живые клетки, нашла применение для создания новых лекарственных форм хемотерапевтических препаратов, эффективных против опухолей, проявляющих множественную лекарственную устойчивость [9, 10]. Наконец, «инертные» водорастворимые полимеры предлагается использовать в качестве носителей для создания «умных» конструкций для контролиуемого введения лекарственных препаратов [10-12].
Вторая область, обусловливающая большой интерес к исследованию взаимодействия полимеров с липидными мембранами находится в сфере наук о материалах. Развитие нанотехнологий, имеющих своей целью конструирование электротехнических устройств молекулярных размеров, стимулировало исследование липидных мезофаз и монослоев как природной высоко ориентированной среды, которую можно использовать для организации молекулярных ансамблей, выполняющих специфические функции. Адсорбция водорастворимых полимеров на таких липидных
Введение плёнках позволяет создавать структуры, которые рассматриваются как прообразы «нанопроводов» [13-14] и других устройств молекулярных размеров.
Еще одна практическая область, требующая всестороннего изучения закономерностей взаимодействия водорастворимых полимеров с липидными мембранами, лежит в области анализа. Оказалось, что ориентированные липидные моно- или бислои, сформированные на твердых подложках, могут быть удобной основой для создания датчиков, способных определять концентрацию веществ в омывающей их среде. Так же, как и в предыдущем случае, данные по взаимодействию полимеров с липидными мембранами могут позволить конструировать молекулярные ансамбли на поверхности электрохимических сенсоров [15].
К настоящему времени накоплен значительный материал, касающийся взаимодействия полимеров с липидными бислоями. Так, подробно исследованы закономерности образования комплексов полиэлектролитов с противоположно заряженными липидными мембранами. Исследованы структурные перестройки в мембранах, сопровождающие адсорбцию на их поверхности полиэлектролитов, и изменения в конформации полимеров, происходящие при образовании таких комплексов [16-19]. Исследовано взаимодействие некоторых полимеров с клеточными мембранами и изучены некоторые биохимические феномены, сопровождающие адсорбцию полимера [6, 9-Ю]. Обсуждаются различные пути взаимодействия биополимеров с мембранами и механизмы их воздействия на проникновение нуклеиновых кислот в клетки [7, 8]. Методы молекулярной динамики, бурно развивающиеся в последнее время, вслед за повышающимся уровнем вычислительных средств, позволяют по-новому взглянуть на процессы взаимодействия полимеров с мембранами [20]. В то же время остается ряд существенных вопросов, не получивших развития в литературе.
Несмотря на то, что закономерности, управляющие адсорбцией поликатионов на биологических мембранах, исследованы достаточно подробно, остается неизвестным по отношению к каким из компонентов биологических мембран, анионным липидам или белкам, поликатионы проявляют большее сродство.
Известно, что адсорбция поликатионов на противоположно заряженных липидных мембранах приводит к значительным структурным перестройкам в бислое, однако существенного воздействия на ионную проницаемость мембран эти перестройки не оказывают [18,19]. В то же время остается неисследованным вопрос, влияют ли изменения в латеральной организации мембран на их проницаемость по отношению к незаряженным соединениям, способным проникать через бислой по механизму растворения-диффузии.
Воздействие амфифильных блок-сополимеров этиленоксида и пропиленоксида (плюроников) с биологическими мембранах приводит к увеличению накопления лекарства в клетках. Показано, что этот эффект достигается за счет ингибирования белковых переносчиков, осуществляющих выброс лекарства из клеток. В то же время вопрос о взаимодействии полимера с липидной частью биологической мембраны остается неисследованным. В частности, отсутствуют количественные данные о связывании этих полимеров с липидными мембранами, и неизвестно, приводит ли адсорбция полимера к структурным изменениям в липидной части биологической мембраны.
Известно, что многие амфифильные сополимеры (неионные ПАВ) сильно различаются по своему воздействию на липидные мембраны. В то же время причины различий в действии различных амфифилов и взаимосвязь между их структурой и степенью воздействия на барьерные свойства мембран остаются до сих пор не ясными.
Неизвестной остаётся также и взаимосвязь между составом липидной мембраны и сродством полимеров к такой мембране.
Полиэлектролитные комплексы полианионов с биологически активными соединениями активно исследуются в медицине и фармакологии как лекарственные формы для пролонгирования действия медицинских препаратов. Неисследованными остаются вопросы, могут ли такие комплексы взаимодействовать с липидными мембранами, и может ли лекарство, включенное в состав таких конструкций, проникать через мембрану.
Для ответа на эти вопросы в настоящей работе будет рассмотрено взаимодействие водорастворимых полимеров с бислойными липидными мембранами. Такое взаимодействие возможно за счет зарядовых, гидрофобных, водородных или дипольных взаимодействий. Бислойная мембрана, построенная из фосфолипидов и стеролов, представляет собой жидкокристаллическую структуру с пространственно разделенными гидрофобной областью (областью остатков жирных кислот - рис. 1 (3)), областью, содержащей протоноакцепторные группы (область глицериновых остатков - рис. 1 (2)) и областью, содержащей заряженные группы (область полярных головок - рис. 1 (1)).
Кардиалипин
Фосфатидилхолин
гл
Рис. 1. Формулы фосфолипидов и схематическое изображение липидного бислоя. Стрелками показаны три области липидного
Щ бислоя: 1 - область остатков жирных кислот; 2 - область
> х
|} глицериновых остатков; 3 -область полярных головок.
Введение Можно ожидать, что полимеры, обладающие гидрофобными группами, будут заглубляться в область остатков жирных кислот, а катионные полимеры будут взаимодействовать с полярными головками анионных липидов. Наконец, анионные полимеры, не взаимодействующие с отрицательно заряженным бислоем в нейтральной среде, могут образовывать комплексы с лекарствами, влияя тем самым на их проникновение. Исходя из этого, в настоящей работе мы остановимся на рассмотрении трех основных групп водорастворимых полимеров. При этом будут рассмотрены закономерности, управляющие адсорбцией этих полимеров на липидных мембранах, и вызываемые этими полимерами структурные перестройки в бислое. Помимо этого, будет рассмотрено влияние этих полимеров на проницаемость липидных мембран по отношению к малым ионам и незаряженным соединениям.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Развитие представлений и современные взгляды на структуру и функции биологических мембран
Липиды, наравне с нуклеиновыми кислотами и белками, являются важнейшими компонентами всех живых организмов и составляют «химическую основу жизни». Мембраны формируют внутриклеточные компартменты, с их помощью происходит разделение содержимого компартментов и окружающей их среды. Однако мембраны не только разделяют клетку, но и участвуют в регуляции всех связей и взаимодействий, которые осуществляются между наружной и внутренней средой. Это может проявляться в виде физического переноса ионов или молекул через мембрану или в форме передачи информации, за счет осуществления конформационных переходов, индуцируемых в мембранных белках [21].
Впервые фосфолипиды в биологических экстрактах были обнаружены Вокленом в 1811 году. Позже Гобли выделил фосфорсодержащий липид из этанольного экстракта яичного желтка и назвал его «лецитин» от греческого Xsfyioa, т.е. яичный желток. В 1850 году он обнаружил, что из лецитина может быть получена глицерофосфорная кислота, а в 1874 году он предложил структуру лецитина, в которую входили олеиновая кислота, маргариновая (гептадекановая) кислота, фосфоглицерин и холин [22]. К 1927 году были охарактеризованы три наиболее широко распространённых липида: лецитин (фосфатидилхолин), кефалин (фосфатидилэтанолами) и сфингомиелин.
В 1895 году Овертоном и позже Остерхаутом была высказана гипотеза, что липиды - это основной компонент биологических мембран [22, 23]. Овертоном было сформулировано правило, согласно которому способность веществ проникать через биологические мембраны коррелирует со способностью этих веществ растворяться в алифатических углеводородах. [22]. В то время уже возникает представление о том, что липидная мембрана - это прослойка жирной фазы, несмешивающейся с водой, и отделяющая клетку от внешней среды.
Революционный скачок в понимании структуры мембраны и её функций произошел после публикации в 1917 году работы Ирвинга Лэнгмюра, в которой впервые
История была описана модель липидной мембраны, основанная на монослое липидных молекул, нанесенных в виде бензольного раствора на поверхность воды [24]. После этого в 1925 году Гортеру и Грэнделу [25] удалось продемонстрировать, что площадь монослоя, построенного из клеточных липидов вдвое больше площади липидной мембраны. Они впервые высказали предположение о бислойном строении биологических мембран эритроцитов. В 1935 году Дэйвсон и Даниелли высказывают предположение о том, что мембрана состоит из липидной прослойки, находящейся между двумя слоями белка [26]. Эта модель принималась в качестве основной парадигмы на протяжении без малого сорока лет после её публикации. И только в 1972 году Сингер и Николсон, опираясь на данные по электронной микроскопии клеточных мембран, рентгеновской дифракции и данные по химической модификации мембранных белков, предложили жидкостно-мозаичную модель биологической мембраны, согласно которой мембрана представляет собой жидкокристаллическую бислойную ламеллярную липидную фазу, стабилизированную гидрофобными взаимодействиями, в которой плавают белковые молекулы [27].
Биологические мембраны выполняют целый ряд специфических функций. Во-первых, это ограничение и обособление клеток и органелл. Обособление клеток от межклеточной среды обеспечивается плазматической мембраной, защищающей клетки от внешнего химического и механического воздействия. Плазматическая мембрана обеспечивает также сохранение разности концентраций метаболитов и неорганических ионов между внутриклеточной и внешней средой. Во-вторых, плазматическая мембрана обеспечивает контролируемый транспорт метаболитов и ионов, определяя состав внутренней среды, что существенно для гомеостаза, т.е. поддержания постоянной концентрации метаболитов и неорганических ионов и других физиологических параметров. Обмен с внешней средой осуществляется преимущественно с помощью мембранных белков - переносчиков и пор. Плазматическая мембрана обеспечивает восприятие внеклеточных сигналов и их передачу внутрь клетки, а также инициацию подобных сигналов. Благодаря наличию границы между полярной и неполярной средой, именно в мембранах осуществляются ферментативные реакции с неполярными
Обзор литературы. Глава 1. субстратами. Примерами могут служить биосинтез липидов, метаболизм неполярных ксенобиотиков, окислительное фосфорилирование, фотосинтез. Наконец, мембранные белки обеспечивают межклеточные взаимодействия и заякоривание цитоскелета, поддерживающего форму клетки и регулирующего ее движение.
Таким образом, основной функцией плазматической мембраны можно считать обеспечение избирательного взаимодействия клетки с внешней средой. Отделение клетки от внешней среды осуществляется при помощи двойного слоя липидов, практически непроницаемого для подавляющего числа веществ (ионов и больших полярных молекул). Взаимодействие клетки с внешней средой осуществляется при помощи разного рода мембранных белков. В ряде случаев их активность сильно зависит от липидного окружения, свойств липидного бислоя [28, 29]. Следовательно, избирательная проницаемость плазматической мембраны должна непосредственным образом зависеть от свойств липидного бислоя.
Существенным фундаментальным дополнением к представлениям о структуре биологических мембран послужили работы последних лет, в которых проводилось наблюдение за диффузией единичных липидных молекул. В этих работах были использованы методы, основанные на комбинации оптической и флуоресцентной микроскопии с компьютерным анализом изображения. В том случае, когда временное разрешение анализирующей изображение аппаратуры позволяет следить за эволюцией системы в микросекундном диапазоне, удается выявить, что биологические мембраны не однородны, а разделены на латеральные компартменты.
Гидрофильные поливиниламиды и полиакриламид
К этой группе полимеров относятся поливинилпирролидон, поливинилкапролактам и полиакриламид. Полимеры этой группы также являются типично водорастворимыми полимерами. В водной среде они сильно гидратируются с образованием прочных водородных связей. Никаких указаний на возможность взаимодействия этих полимеров с липидными бислойными мембранами в литературе не имеется. В то же время гидрофильный характер этих полимеров, и связанная с этим свойством, чрезвычайно низкая токсичность (при высокой токсичности мономеров), обусловили их широкое использование в био-медицинских исследованиях. В частности, аналогично ковалентным конъюгатам полиэтиленоксида с фосфолипидами, липидные производные поливинилпирролидона было предложено использовать для стерической стабилизации липосом [243,244].
Высокая способность поли-(М-винилпирролидона) к гидратации способствует его широкому применению в качестве криопротектора при низкотемпературном консервировании эмбрионов [245]. Оказалось, что наиболее удачным оказывается использование в качестве криопротекторов смесей поливинилпирролидона и сахарозы, поскольку водородные связи между карбонильными группами полимера и гидроксилбными группами сахара препятствуют его кристаллизации, и поэтому способствуют стеклованию раствора при понижении температуры [246].
Было показано, что в процессе высыхания мембран подвижность липидных молекул уменьшается, причем взаимодействие полярных головок липидов с
Обзор литературы. Глава 2. низкомолекулярными углеводами препятствует этому эффекту, защищая мембраны от разрушения в процессе замораживания. Поливинилпирролидон обладает противоположным эффектом: его макромолекулы вытесняются из гидратной оболочки мембран, однако, благодаря высокому сродству к воде, он способствует дегидратации липида. На основании этого в работе [247] делается вывод, что криопротекторный эффект поливинилпирролидона связан исключительно с его способностью к стеклованию, и не может быть объяснен его стабилизирующим действием на мембраны (в ходе дегидратации он даже способствует «высыханию» липидной мембраны).
Поливинилпирролидон образует комплексы в водном растворе с различными протонодонорными соединениями. Константы образования таких комплексов лежат в пределах от 1 до 10 М". Широкое применение в медицинской практике нашел комплекс поливинилпирролидона с иодом («повидон-иод», «иодобак») [248]. Способность поливинилпирролидона к комплексообразованию определяется протоноакцепторной способностью этого полимера, и сильно зависит от его гидратации. Конформационные равновесия в водных растворах поливиниламидов были недавно подробно исследованы в работах Ю.Э.Кирша. [249,250].
Полиакриламид также не вызывает никаких изменений в структуре липидных мембран. Благодаря высокой гидрофильности, полиакриламидные пленки могут быть использованы в качестве гидрофильных подложек для получения бислойных липидных плёнок для биосенсоров [251]. При этом гидрофильный характер поверхности полимера обеспечивает создание ровной липидной пленки, по своим свойствам идентичной пленкам, получаемым в водной среде.
Водные растворы полиуглеводов и поливинилового спирта по свойствам очень похожи на растворы поливиниламидов, поскольку эти полимеры также очень гидрофильны. Они также очень склонны к образованию водородных связей, однако, в отличие от поливиниламидов, полиуглеводы и поливиниловый спирт проявляют не только протоноакцепторные, но и протонодонорные свойства. Поэтому они могут взаимодействовать с полярными головками липидных молекул, проявляющими протоноакцепторные свойства, за счет образования водородных связей.
Действительно, в работе [252] было показано, что при контакте с липидными мембранами поливиниловый спирт способен вызывать повышение температуры фазового
Нейтральные гидрофильные полимеры перехода димиристоил-ФХ. По всей видимости, стабилизация бислоя достигается за счет образования множественных водородных связей с полярными головками липидных молекул. Это свойство поливинилового спирта было использовано для создания стабилизированных липосом для контролируемой доставки лекарств [253]. В этом случае слой поливинилового спирта создавали на липосомальной мембране, за счет присоединения к молекулам полимера гидрофобных «якорных» групп, которые были способны заглубляться в мембрану. Подобно липосомам, покрытым полиэтиленоксидом, везикулы, покрытые ПВС, были существенно более стабильны в кровотоке, чем липосомы из ФХ. Интересно, что улучшения фармакологических характеристик лекарства удавалось добиться и при заполнении внутренней полости липосом гелем поливинилового спирта. В этом случае прикрепление бислоя к поверхности геля проводили, модифицируя поверхность гелевых наночастиц остатками жирных кислот, после чего такие частицы использовали для получения везикул. Благодаря наличию гидрофобных остатков на поверхности, в присутствии липида на частицах формировалась бислойная мембрана, динамические свойства которой слабо отличались от свойств обычной липосомальной мембраны [254].
Благодаря высокой склонности к образованию водородных связей, поливиниловый спирт нашел также широкое применение в качестве «мукоадгезивого» средства, т.е. препараты на его основе имеют высокое сродство к слизистым оболочкам, богатым углеводными полимерами [255]. Аналогичные свойства отмечаются и у водорастворимых хитозана и декстрана, которые также используются для получения мукоадгезивных липидных везикул для доставки лекарств к слизистым оболочкам кишечника [256,257]
Полиуглеводы различного строения - один из наиболее широко распространенных в природе классов полимеров. Некоторые водорастворимые полиуглеводы оказывают сильное влияние на свойства клеток и липидных мембран. Особое внимание привлекли полимеры фруктозы, содержащиеся в некоторых морозо- и засухоустойчивых видах растений, грибов и бактерий. Фруктаны различаются по природе связей между остатками фруктозы: инулины содержат (3(2— 1) гликозидные связи, леваны - (3(2—»6)-связи, а герминаны - связи обоих типов. Благодаря различиям в геометрии гликозидных связей эти полимеры принимают различные конформации - инулин может принимать или спиральную конформацию с 6 звеньями в каждом витке спирали, или укладываться в виде плоского зиг-зага. Леваны могут принимать только конформацию сильно закрученной Зправой спирали с шагом 2,5 звена на виток. [258] В работах де Круйффа было показано, что адсорбция фруктанов инулинового и леванового строения на липидных мембранах приводит к значительной стабилизации Ьа-фазы липида.
Взаимодействие полиэлектролитов с липидными мембранами, находящимися в жидко-кристаллической фазе
Взаимодействие полиэлектролитов с противоположно заряженными бислойными мембранами и мембранами клеток изучено очень подробно. Можно сказать, что этот класс полимеров стал первым, чье взаимодейстие с мембранами привлекло к себе внимание исследователей различных школ. Первые работы в этой области относятся к концу 60-х -началу 70-х годов. Поскольку природные мембраны несут, как правило, отрицательный заряд, то на них наиболее активно адсорбируются поликатионы. Поэтому значительная часть работ в этой области была посвящена именно взаимодействию поликатионов с отрицательно заряженными липидными мембранами и их воздействию на клеточные процессы.
В последние годы бурное развитие методов генетической инженерии поставило задачи облегчения транспорта ДНК в живые клетки, и было показано, что липосомы, несущие положительный заряд, также способны облегчать проникновение ДНК в клетки. Поэтому большое количество работ в последние годы посвящено т.н. «липоплексам», т.е. комплексам ДНК с катионными липосомами. Поскольку закономерности, управляющие адсорбцией поликатионов и полианионов на противоположно заряженных мембранах в своей основе аналогичны, в настоящем обзоре мы будем рассматривать их совместно.
Полиэлектролиты способны эффективно адсорбироваться на противоположно заряженных поверхностях. Все теории взаимодействия полиэлектролитов с поверхностями основываются на том, что свободная энергия такой системы складывается из (1) энергии электростатического отталкивания ионных атмосфер; (2) энергии взаимодействия противоионов с полимером и поверхностью; (3) энергии кулоновского и/или вандерваальсового притяжения между разноименно заряженным полиэлектролитом
Обзор литературы. Глава 2. и поверхностью; (4) энтропийного вклада, связанного с подвижностью малых ионов, входящих в двойные электрические слои; и, наконец, (5) энтропией самой полимерной цепи [460]. Очевидно, что первые два фактора, а также фактор (5) вносят положительные (дестабилизирующие) вклады в свободную энергию адсорбции. Т.е. основными силами, стабилизирующими комплекс, являются энергия притяжения между полимером и поверхностью, а также энтропийный вклад, обусловленный высвобождением малых ионов, входящих в состав ионной атмосферы.
Прежде всего, кратко рассмотрим закономерности адсорбции полиэлектролитов на твердых поверхностях. Теоретическое рассмотрение такой адсорбции основано на теории самосогласованного поля, согласно которой рассчитывается потенциал взаимодействия между полимером и поверхностью в каждой точке. Теоретическое рассмотрение приводит к выводу, что наиболее значительные вклады в свободную энергию адсорбции полимера вносят кулоновские взаимодействия полимера с поверхностью, описываемые моделью Гуи-Чэпмена-Штерна (уравнение (8) в разделе 2.1.9), и повышение энтропии малых ионов, высвобождающихся в результате образования ионных контактов между полимером и поверхностью [461]. При этом фактор энтропии малых ионов действует на больших расстояниях, а кулоновские взаимодействия начинают играть определяющую роль при рассмотрении уже сформировавшегося комплекса, когда расстояния между взаимодействующими зарядами оказываются порядка длины нескольких А [461].
Оказывается, что распределение плотности мономеров по мере удаления от поверхности сильно зависит от жесткости полимера. В случае гибкоцепного полимера содержание звеньев в адсорбционном слое закономерно снижается по мере удаления от поверхности, а при увеличении жесткости цепи - содержание звеньев проходит через максимум. По мере увеличения концентрации низкомолекулярного электролита в растворе этот максимум несколько «отодвигается» от поверхности и уменьшается по величине [462]. Качественно сходные результаты были получены как для сильных [462], так и для слабых полиэлектролитов (с линейной потностью заряда 5%) [463]. При этом увеличивается доля звеньев полимера, содержащихся в «петлях» и «хвостах», а толщина полимерного слоя при этом растет. Уменьшение линейной плотности заряда приводит к росту доли полимерных звеньев, содержащихся в петлях и хвостах [464]. Эти закономерности вполне согласуются с экспериментальными данными по толщине слоя полимера, адсорбируемого на твердой подложке, [465] коллоидных латексных [466] или
Взаимодействие полиэлектролитов с модельными липидными мембранами неорганических частицах [467]. Во всех случаях адсорбированный на поверхности полимер давал слой конечной толщины, которая уменьшалась при увеличении ионной силы.
С закономерностями адсорбции полиэлектролитов на твёрдых поверхностях пересекаются работы, посвященные адсорбции поликатионов на липидных везикулах, находящихся в гель-фазе. Добавление поликатионов к таким везикулам, несущим отрицательный заряд, приводит к их эффективной адсорбции. Измерения -потенциала везикул с адсорбированным поликатионом показали, что полная нейтрализация заряда (,-потенциал равен 0) достигается при добавлении поликатиона в количестве равном количеству отрицательного заряда на внешней поверхности везикул [468].
Существенной особенностью взаимодействия полиэлектролитов с противоположно заряженными частицами коллоидных размеров является их агрегация. Агглютинация коллоидных частиц с помощью полиэлектролитов известна уже на протяжении 30-40 лет и подробно описана в соответствующих руководствах [469]. Движущей силой этого процесса является адсорбция полиэлектролитов на поверхности частиц, приводящая к уменьшению их поверхностного заряда. Поскольку стабилизация коллоидов в растворе обусловлена в основном их взаимным отталкиванием, то уменьшение поверхностного заряда частиц приводит к дестабилизации системы и агрегации коллоидных частиц [470]. В ряде случаев адсорбция избыточных количеств полимера, наоборот, приводит к электростатической стабилизации коллоидных систем за счет взаимного отталкивания одноименно заряженных частиц [471].
Аналогичные явления наблюдают и при адсорбции поликатиона поли-(Ы-этил-4-винилпиидиний бромида) на отрицательно заряженных липидных везикулах, находящихся в гель-фазе: по мере снижения заряда везикул происходит их агрегация, а добавление избыточных количеств полиэлектролита приводит к снижению размеров агрегатов. При этом заряд частиц, получавшихся в результате адсорбции избыточных количеств полимера, положителен, а их размер несколько превышает размеры исходных везикул [18, 19]. Это дало возможность авторам приписать увеличение размера таких «перезаряженных» частиц появлению слоя полиэлектролита на их поверхности.
Оценка количественных параметров связывания полимеров с клетками
Использование полиэлектролитов как носителей для доставки лекарств представляет собой важный аспект биологического применения этих полимеров. В этом случае используется способность полиэлектролитов образовывать зарядовые комплексы с противоположно заряженными лекарствами. Такие комплексы могут рассматриваться как самоорганизующиеся системы, стабилизированные за счет межмолекулярных
Обзор литературы. Глава 2. взаимодействий (в основном, электростатических и гидрофобных). С начала 80-х годов эти комплексы активно используются для доставки генетического материала и низкомолекулярных лекарств в клетки.
Было обнаружено, что проникновение ДНК и олигонуклеотидов в клетки облегчается при включении их в состав комплексов с поликатионами. Данный аспект использования поликатионов нашел отражение в целом ряде современных обзоров [7, 532-536]. Поскольку этот вопрос выходит далеко за рамки настоящей работы, поэтому здесь стоит лишь упомянуть о некоторых аспектах этой тематики. В целом ряде работ было показано, что интерполиэлектролитные комплексы, образованные поликатионами и плазмидной ДНК (или олигонуклеотидами) эффективно проникают в клетки путем эндоцитоза как in vivo, так и in vitro. Влияние поликатионов на проникновение полинуклеотидов через липидные мембраны тесно связана с их влиянием на структуру и проницаемость мембран. Критическими параметрами поликатионов, влияющими на их трансфецирующую активность, являются линейная плотность заряда и молекулярная масса. В последнее время ведутся активные поиски поликатионов, обладающих пониженной токсичностью, но проявляющих при этом высокую трансфецирующую активность. В связи с этим весьма перспективными оказываются работы в направлении синтеза блок-иономеров [537] и дендримеров [538, 539].
Анионные полимеры нашли своё применение для доставки противоопухолевых препаратов. Конъюгирование таких полимеров с лекарствами уменьшает токсичность препаратов, что было продемонстрировано в работе [540]. Неокарциностатин был сконъюгирован с сополимером дивинилового эфира и малеинового ангидрида (DIVEMA) Мг-23000. Такой конъюгат был в три раза менее токсичен и более эффективен, чем свободное лекарство in vivo. Аналогичные результаты были получены в работе [541, 542], где в качестве лекарства использовали доксорубицин, а в качестве полимера DIVEMA. Было показано, что терапевтическая активность лекарства, включенного в состав таких конструкций значительно увеличивается, в первую очередь, за счет увеличения времени циркуляции лекарства в кровотоке.
Нековалентные комплексы катионных лекарств с полианионами также активно исследуются как молекулярные контейнеры для доставки лекартсв in vivo. Нерастворимые комплексы поли(акриламидо-2-метил-1-пропансульфонат натрия-ко-метилметакрилат) с катионными лекарствами было предложено использовать для перорального введения,
Биологическая активность полиэлектролитов поскольку при попадании в кислую среду в желудке комплексы диссоциируют с высвобождением лекарства [543]. Показано, что кинетика высвобождения лекарства зависит от гидрофобности полимера и самого лекарства. В то же время, включение известного антинеопластического препарата винкристина в состав нерастворимых комплексов с гепарином и декстран сульфатом с последующим встраиванием комплексов в липосомы сопровождалась понижением острой токсичности лекарства, хотя и уменьшает его противоопухолевую активность [544].
Целый ряд работ посвящен нековалентной иммобилизации доксорубицина на полимерных носителях. Так, в работе [545] было исследовано действие доксорубицина, встроенного в наночастицы полиалкилцианоакрилата in vivo. Гистологические исследования с использованием флуоресцентной микроскопии показали, что происходит быстрый захват наночастиц макрофагами костного мозга. Токсичность таких наночастиц по отношению к клеткам крови и костного мозга выше, по сравнению со свободным лекарством.
В работе [546] предлагается использовать синтетический анионный полипептид полиаспарагиновую кислоту для снижения побочной токсичности антибиотика гентамицина, вызывающего фосфолипидоз за счет адсорбции на липидных мембранах клеток. Включение гентамицина в состав комплексов приводило к снижению токсичности препарата. Аналогичные результаты были получены и при использовании комплексов полиаспартата с доксорубицином [547]
Сополимер стирола и малеинового ангидрида использовали в качестве носителя для противоопухолевого препарата карциностатина [548]. Было обнаружено, что конъюгат эффективно проникал в клетки при понижении рН среды и не проникал в нейтральных условиях. Таким образом удалось придать противоопухолевому препарату дополнительную избирательность действия, основанную на том, что рН раковых опухолей в среднем на 1 -2 единицы ниже, чем рН нормальной ткани [549].
В работах Kataoka с сотр. [550, 551] был синтезирован блок-сополимер полиаспартата и полиэтиленоксида. К полипептидной части сополимера с помощью карбодиимида присоединяли доксорубицин, добиваясь высоких степеней заполнения полимера антибиотиком. Получающийся блок сополимер приобретал благодаря пришитому доксорубицину ярко выраженную дифильную природу, и образовывал мицеллы в водном растворе.
