Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 6
1.1. Блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида 6
1.1.1. Номенклатура 6
1.1.2. Физико-химические свойства 6
1.1.3. Аналитическое определение плюроников в присутствии липидов 8
1.2. Биологические мембраны 12
1.2.1. Структура биологических мембран 12
1.2.2. Свойства липидного бислоя 15
1.2.3. Микровязкость бислоя и способы её измерения 16
1.2.4. Липидный состав биологических мембран 18
1.2.5. Проницаемость липидных мембран 31
1.2.6. Модельные системы, используемые для исследования проницаемости мембран 34
1.3. Взаимодействие плюроников с компонентами биологических мембран. 37
1.3.1. Взаимодействие плюроников с белками 37
1.3.2. Взаимодействие плюроников с липидными структурами 39
1.3.2.1. Связывание плюроников с бислойными мембранами и их локализация вбислое 39
1.3.2.2. Влияние плюроников на проницаемость липидных мембран 43
1.4. Применение плюроников в медицинских целях 46
1.5. Множественная лекарственная устойчивость опухолей и влияние на неё плюроников 47
1.6. Использование фотоактивируемых групп для исследования локализации веществ в клетке 52
2. Постановка задачи 55
3. Экспериментальная часть 57
3.1. Материалы 57
3.2. Методы 58
3.2.1. Анализ полимеров 58
3.2.2. Введение аминогруппы в двублочный сополимер REP 59
3.2.3. Получение REP-NH2, меченного тритием 61
3.2.4. Модификация REP-NH2 флуоресцентной и фотоактивируемой группой 62
3.2.5. Определение коэффициента распределения сополимеров между гексаном и водой 64
3.2.6. Приготовление липосом 64
3.2.7. Определение микровязкости мембраны липосом 65
3.2.8. Связывание сополимеров с липосомами 66
3.2.9. Транспорт доксорубицина в липосомы с градиентом рН 67
3.2.10. Проникновение сополимера внутрь липосом 68
3.2.11. Культивирование клеток и анализ цитотоксичности доксорубицина и сополимеров 69
3.2.12. Связывание 3H-REP-NH2 с клетками 71
3.2.13. Проникновение REP-NBD внутрь клеток 71
3.2.14. Анализ взаимодействия REP-NBD с клетками методом конфокальной микроскопии 72
3.2.15. Взаимодействие клеток с REP, содержавшим фотоактивируемую метку 73
4. Результаты и их обсуждение 77
4.1. Свойства двублочного сополимера REP 77
4.2. Взаимодействие блок-сополимеров с клетками 80
4.2.1. Связывание REP с клетками разного типа 80
4.2.2. Локализация REP при связывании с клетками 83
4.2.3. Идентификация партнёров полиалкиленоксидов в мембране 87
4.3. Взаимодействие блок-сополимеров с липосомами 101
4.3.1. Взаимодействие дву- и трёхблочного сополимеров с липосомами из яичного лецитина 101
4.3.2. Влияние состава липидного бислоя на взаимодействие полиалкиленоксидов с липосомами 112
5. Заключение 124
6. Выводы 130
Список сокращений 131
Список литературы
- Аналитическое определение плюроников в присутствии липидов
- Введение аминогруппы в двублочный сополимер REP
- Связывание REP с клетками разного типа
- Влияние состава липидного бислоя на взаимодействие полиалкиленоксидов с липосомами
Введение к работе
Амфифильные полиалкиленоксиды, в частности, блок-сополимеры этиленоксида (ЭО) и пропиленоксида (ПО) состава (ЭО)т/2(ПО)п(ЭО)т/2, называемые также плюрониками, являются хорошо известными малотоксичными поверхностно-активными соединениями, нашедшими широкое применение в медицине и фармакологии [1]. Сравнительно недавно было обнаружено, что при введении противоопухолевых антибиотиков антрациклинового ряда, таких как доксорубицин, фарморубицин и дауномицин, совместно с небольшими дозами плюроников, терапевтическая активность лекарства заметно усиливается. Это влияние сополимеров особенно заметно на опухолях, проявляющих множественную лекарственную устойчивость (MDR) [2].
Эта устойчивость, то есть возрастание необходимой токсической концентрации антибиотика, возникает при длительном лечении опухолей с помощью химиотерапии [3]. Она обусловлена возникновением и активацией множества защитных механизмов клетки, направленных на понижение внутриклеточной концентрации лекарств и устранение последствий их токсического действия. Появляющаяся устойчивость проявляется в отношении широкого круга веществ с разнообразной структурой. Проявление MDR приводит к необходимости увеличения количества вводимых в организм антибиотиков, что в конечном итоге сказывается на их общетоксическом воздействии на больного. Таким образом, устранение устойчивости раковых клеток является одной из важнейших задач современной онкологии. В настоящее время препарат для преодоления MDR на основе плюроников проходит клинические испытания за рубежом [4].
Ранее было показано, что плюроники подавляют устойчивость, связываясь с клетками в виде единичных макромолекул, при этом они уменьшают внутриклеточігую концентрацию АТФ и ингибируют целый ряд механизмов устойчивости, от сегрегации антибиотиков в кислых везикулах [5] до активации антиапоптотических процессов на уровне транскрипции [6].
Кроме того, было установлено, что влиянием, подобным плюроникам, обладают и другие полиалкиленоксиды, в том числе блок-сополимеры глицерина и пропиленоксида [7].
Тем не менее, до сих пор неизвестна природа ключевой стадии взаимодействия блок-сополимера с клеткой, и как это взаимодействие приводит к вышеописанным событиям. Речь идёт о том, что неизвестно, например, взаимодействуют ли полиалкиленоксиды непосредственно с мембранными белками, ответственными за выброс лекарств из клетки, или какими-либо другими белками, участвующими в механизмах устойчивости. Иными словами, неизвестна важная составляющая молекулярного механизма взаимодействия блок-сополимеров с клеткой, а именно какие компоненты биологической мембраны непосредственно взаимодействуют с сополимером, и какую роль в этом взаимодействии играет их химическая природа.
Знание молекулярного механизма взаимодействия полимеров с клеткой позволит определить сферу применения существующих препаратов на основе плюроников и в дальнейшем направленно синтезировать препараты с большей эффективностью и кругом применения. Поэтому в настоящей работе мы сделали первую попытку обнаружения тех молекулярных компонентов клетки, взаимодействием с которыми обусловлено вышеописанное влияние полиалкиленоксидов на устойчивость раковых клеток.
1. Обзор литературы
Аналитическое определение плюроников в присутствии липидов
Количественное исследование взаимодействия полиалкиленоксидов с биологическими мембранами связано с определением плюроников в присутствии липидов. Этот анализ затруднён, поскольку в связи с химической инертностью плюроников их определение основано на образовании комплексных соединений [15]. Присутствие таких ПАВ как липиды препятствует образованию этих комплексов и затрудняет определение концентрации сополимеров. Кроме того, липиды могут образовывать комплексы с теми же веществами, что и плюроник. Поэтому для определения количества плюроников в смеси с липидами, как правило, используют полимеры, содержащие изотопную или флуоресцентную метку. Флуоресцентные метки обычно представляют собой полициклические соединения с молекулярной массой 200-500 Да [16]. Введение таких групп в макромолекулу может изменить соотношение гидрофобностей её цепей и характер её взаимодействия с биологической мембраной. Кроме этого, спектральные характеристики большинства таких меток зависят от микроокружения. В гидрофобном окружении, например, в сердцевине бислоя или в ядре мицелл, интенсивность флуоресценции отличается от таковой в воде. Введение изотопных меток методически более сложно, но меньше влияет на свойства полимера. Известно, что соотношение скоростей процессов для меченого и немеченого соединения (изотопный эффект) равно квадратному корню из соотношения молекулярных масс этих веществ. Например, введение одного атома трития на молекулу с молекулярной массой 2000 приводит к изменению кинетических параметров системы всего на 0,05%.
Процесс радиоактивного распада трития описывается уравнением: 3Н- 3Не + е+ve
Период полураспада трития составляет 12,4 года. Максимальная энергия распада составляет 18,6 кэВ, средняя - 5,6 кэВ. Радиоактивность трития составляет 29 Ки/ммоль. Регистрацию распада трития осуществляют с помощью достаточно чувствительного метода - жидкостной сцинтилляционной спектрометрии. Пробег образующихся при распаде р-частиц (глубина проникновения) в воздухе составляет 0,6 см, в биологической ткани - 1 мкм. Таким образом, тритий является эффективным и относительно безопасным с радиологической точки зрения изотопом.
Введение трития в плюроники может быть осуществлено как при синтезе полимера, так и путём замены изотопа Н на Н в готовом продукте. Такая замена может быть осуществлена с помощью изотопного обмена на катализаторах, ядерно-химических методов (метода Вильцбаха, Р-распада меченых соединений, метода атомов отдачи), физико-химических методов (фотолиза, на химических ускорителях и разряда, радиационно-химического синтеза и метода термической активации трития).
Метод термической активации трития (МТАТ) хорошо разработан на кафедре радиохимии Химического факультета МГУ и позволяет получать меченые соединения самых разных классов. Метод основан на процессе атомизации двухатомных газов на нагретых металлических нитях. Атомарный тритий получается диссоциацией молекулярного трития на вольфрамовой проволоке при температуре близкой к 2000 К. Такой способ генерации атомарного трития и называется, собственно, методом термической активации трития (МТАТ) [17]. Горячие атомы трития бомбардируют холодную мишень вещества и в результате ряда химических реакций способны замещать водород в молекулах мишени. Регулируя интенсивность потока атомов на мишень и их энергетические характеристики, можно выбрать оптимальные условия получения меченых веществ различных классов, в том числе биополимеров из природных объектов [18].
При действии атомарного трития на органические соединения происходят реакции замещения водорода на тритий, присоединения трития по кратным связям, а также реакции с функциональными группами. В том случае, если решается задача получения меченного тритием материнского соединения, целевой реакцией является замещение протия на тритий по связи С-Н. В условиях, когда температура атомизатора не превышает 2000 К, замещение протекает в два этапа: 3Н + RH -» R + Н3Н R + 3H- R3H
Лимитирующей является стадия отрыва водорода, энергия активации которой в зависимости от типа связи лежит в пределах 0,25-0,4 эВ. Реакция рекомбинации имеет нулевую энергию активации и может происходить и с тепловыми атомами трития. Вероятность реакции атома трития при первом столкновении с углеводородными группами органических молекул, входящих в состав мишени, была определена экспериментально [19]. Оказалось, что в условиях свободного пробега атомов от атомизатора до мишени (давление газа 0,5 Па, расстояние между атомизатором и мишенью 3 см) эта вероятность уменьшается от 18% до 2,5% при изменении температуры атомизатора от 2000 до 1660 К. При предварительной термализации атомов в газовой фазе до 77 К вероятность реакции при первом соударении оказалась настолько мала, что её не удалось измерить с помощью использованного экспериментального подхода. Вместе с тем было показано, что и при столь низкой температуре атомы трития способны вступать в реакцию с образованием меченного по связи С-Н соединения. Скорее всего, при малой энергии атомов трития реакция происходит по другому механизму, происходит туннельный переход отрываемого атома водорода.
Введение аминогруппы в двублочный сополимер REP
В работе были использованы трёхблочный сополимер этиленоксида и пропиленоксида плюроник L61 (Serva, Германия) и двублочный сополимер этиленоксида и пропиленоксида REP (НИОПИК, Москва), предоставленный нам профессором И.Н.Топчиевой. N-гидроксисукцинимидный эфир пара-1-трифторметилдиазиринилбензойной кислоты (фотоактивируемая метка TMD) был любезно предоставлен сотрудником НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Г.А. Коршуновой.
Клетки эритролейкемии человека линии К562 и сублинии, обладающей устойчивостью к противоопухолевому антибиотику доксорубицшгу, K562/DOX, были получены от профессора А.Н. Саприна (Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии). Другая устойчивая сублиния этих же клеток - K562iS9, полученная трансформацией клеток К562 ретровирусом со встроенным геном mdrl, линия аденокарциномы молочной железы человека MCF7 и её устойчивая сублиния MCF7/R, полученная селекцией на среде, содержащей доксорубицин, были предоставлены д.б.н. А.А. Штилем (Институт канцерогенеза ВОНЦ РАМН).
Фосфатидилхолин (лецитин), выделенный из яичного желтка, был приобретён у фирмы "Биолек" (Харьков, Украина) (раствор в этаноле, 100 мг/мл) и фирмы "Sigma" (Германия) (раствор в гексане, 100 мг/мл, хранящийся под аргоновой подушкой).
Были использованы следующие препараты липидов: кардиолипин, раствор в этаноле, 5 мг/мл ("Биолек", Харьков, Украина), фосфатидилэтаноламин (кефалин), выделенный из замороженного яичного желтка, раствор в этаноле, 10 мг/мл, ганглиозид и сфингомиелин, выделенные из бычьего мозга, и фосфатидная кислота, дипальмитоил, синтетическая, 5 мг/мл в смешанном растворителе хлороформ-метанол (1:2 по объему), фирмы "Sigma" (США), холестерин, моногидрат, фирмы "Serva", Германия.
Также были использованы в аналитических и синтетических целях: доксорубицин, НИИ антибиотиков, Москва, Россия; 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен, "Reanal" (Венгрия); гидроксид тетраметиламмония, пентагидрат, "ICN" (США); гидроксиэтилпиперазинсульфокислота (HEPES) «Панэко» (Россия); лимонная кислота, моногидрат, "LaChema" (Чехия); бычий сывороточный альбумин (БСА), «Serva»; фенилметилсульфонилфторид (PMSF), ингибитор протеаз; дитионит натрия, х.ч., Бельгия, расфасовано «Реахим»; NBD-C1, Sigma, США; карбонилдиимидазол, Acros, Бельгия; 2,5-дифенилоксазол и 1,4-бис[2-(5-фенил)-оксазолил]бензол, Тритон Х-100, Serva, Германия.
Реактивы для электрофореза по методу Лэммли: акриламид и бис-акриламид, додецилсульфат натрия, персульфат натрия, тетраметилэтилендиамин, глицин, меркаптоэтанол, приобретённые у фирмы «Sigma», США.
Для тонкослойной хроматографии использовали пластины "Silufol" (широкопористый силикагель по Питри) фирмы Kavalier, Чехословакия, для обращённофазовой - пластины Cig-silica on glass, толщина слоя 250 мкм ("Uniplate", Analtech, США).
Радиоавтографию пластин проводили с использованием плёнки Hyperfilm-3H ("Amersham", США), проявляли и фиксировали в соответствии с инструкцией производителя.
Органические растворители (хлороформ, ацетон, метанол, диэтиловый эфир, этанол, пропанол, диоксан, тетрагидрофуран, диметилформамид, бензол, этилендиамин, толуол), "Реахим" (Россия) были очищены перегонкой в соответствующих условиях. Остальные реактивы (2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол (трис), ч.д.а., глюкоза, ч., тринитробензолсульфокислоту, трихлоруксусігую кислоту, уксусную и др. кислоты и щёлочи, ч.д.а.), "Реахим", Россия, использовали без дополнительной очистки.
Анализ полимеров Молекулярно-массовые характеристики образцов полимеров были определены при содействии к.х.н. Е.С. Гариной методом ГПХ в ТГФ при 35С на жидкостном хроматографе "Waters" с рефрактометрическим детектором и колонками, заполненными ультрастирагелем с размером пор 103 и 105 А, и линейной колонкой. В качестве стандартов использовали узкодисперсные образцы полиэтиленгликолей фирмы "Waters" с молекулярной массой от 270 до 6000 Да. Хроматограммы обрабатывали на интеграторе "Data Module-730".
Массовая доля звеньев этиленоксида была вычислена по данным ИК-спектроскопии путём сравнения полос поглощения на 1372 см"1 (симметричные деформационные колебания группы СН3- пропиленоксида) и 1464 см 1 (деформационные колебания группы СН2-СН2-0 в противофазе) [228] для экспериментального образца и контрольных смесей ПЭО и ППО в заданном соотношении. Спектроскопию проводили совместно с к.х.н. Л.А. Казариным в плёнках, полученных упариванием раствора полимеров в хлороформе, нанесённого на кристалл КВг.
Концентрацию блок-сополимеров этиленоксида и пропиленоксида определяли по модифицированному методу [15], основанному на способности полиалкиленоксидов координировать ионы щелочноземельных металлов и образовывать в присутствии 12 окрашенные коллоидные комплексы. Поскольку полимеры в наших условиях находились в фосфатном солевом буфере, то использование раствора хлорида бария приводило к образованию осадка (К8(Ваз(РО4)2)=6 10"39 [229]). Оказалось, что и в отсутствие солей бария полиалкиленоксиды образуют окрашенные коллоидные комплексы с 12.
В лунки 96-луночного планшета помещали по 100 мкл 0,03-0,003 мг/мл раствора REP в PBS. Затем добавляли по 25 мкл 0,05М раствора 12 в 0,12 М KI. По истечении 1-2 минут измеряли оптическую плотность образцов на планшетном фотометре Titertek MultiScan Plus МКІІ (А,=592 нм). Концентрацию определяли по одновременно построенным калибровочным кривым.
ККМ полимеров была определена по возгоранию в их мицеллах флуоресценции 1,6-дифенилгексатриена (ДФГТ) при 37С (Х зб = 366 нм, ч,сп = 433 нм) [230]. 1 мМ раствор ДФГТ в ТГФ разбавляли водой до концентрации 2-10"5М и титровали растворами полимеров в ячейке флуориметра 650-10 S "Hitachi". ККМ соответствовала концентрации полимера, при которой происходил излом зависимости интенсивности флуоресценции от логарифма концентрации полимера.
Связывание REP с клетками разного типа
Одинаковые количества клеток инкубировали с полимером, добавленным в разной концентрации вплоть до ККМ, и после удаления неприсоединившегося полимера измеряли радиоактивность клеток. Зависимость количества связанного полимера от концентрации добавленного носило линейный характер и не достигала насыщения (рис. 6). Это свидетельствует о большом количестве центров связывания полимера клетками. В то же время доля связанного полимера невелика - десятые доли процента (в расчёте на 1 млн. лимфоцитов в мл), что указывает на низкое сродство полимера к клеточной мембране. Большое количество мест связывания и слабое сродство характерно для неспецифического связывания.
На рис. 6 приведены результаты эксперимента с нормальными клетками -лимфоцитами крови человека. Аналогичные зависимости были получены на 4 линиях опухолевых клеток, чувствительных и устойчивых. Тангенс угла наклона полученных прямых использовали для количественной оценки связывания полимеров с клетками (табл. 6). Оказалось, что суспензионные К562 и прикрепляющиеся MCF7 чувствительные клетки связывают одинаковое количество REP-NH2. Соответствующие им устойчивые линии клеток связывали несколько большие количества полимера, хотя различие между чувствительными и устойчивыми линиями клеток невелико. Интересно, что нормальные лимфоциты крови человека связывали на порядок меньше полимера.
Такие же закономерности ранее были обнаружены при связывании плюроника L61 с клетками разной природы [61]. Авторы этой работы также отмечали повышенный уровень связывания плюроников с опухолевыми клетками по сравнению с нормальными. Сопоставление наших результатов по связыванию REP-NH2 и данных литературы о взаимодействии плюроников с клетками подтверждает ранее сделанный вывод о принципиальном сходстве свойств дву- и трёхблочных полиалкиленоксидов.
Связывание REP-NH2 с клетками зависело от температуры инкубации. При 4С связывание REP-NH2 с клетками К562 и K562iS9 снижалось в два раза, а с MCF7 и MCF7/R - в три-четыре раза по сравнению со связыванием при 37С (табл. 6). Аналогичный эффект наблюдали ранее и для трёхблочных плюроников [61].
Можно было предположить, что большое количество связанного полимера, обнаруживаемое при 37С, может быть обусловлено его накоплением внутри клетки, например, путём эндоцитоза. Этот процесс активно протекает в клетке при 37С, но в значительной степени ослаблен при 4С [247]. Поэтому результаты анализа при 4С отражают связывание полимера только на клеточной поверхности, тогда как при 37С регистрируется суммарное количество полимера внутри и снаружи клеток.
Такое объяснение температурной зависимости правомочно лишь в том случае, если полимер способен проникать внутрь клетки при 37С. Выяснение этого вопроса важно для устойчивость клеток. Строение понимания молекулярного механизма влияния полимеров на множественную лекарственную устойчивость клеток. Строение флуоресцентных групп NBD и FITC. R - остаток модифицируемого соединения.
Локализация REP при связывании с клетками Ранее было показано, что плюроник Р85 проникает внутрь клеток и концентрируется вблизи митохондрий [211]. Однако эти данные были получены с использованием полимера, модифицированного по гидрофильному ПЭО-блоку достаточно объёмной гидрофобной группировкой флуоресцеинизотиоцианата FITC (мол. масса 389), несущей 3 протонодонорные группы (рис. 7). Такая модификация гидрофильного блока могла существенно повлиять на характер взаимодействия плюроника с клетками. Чтобы свести к минимуму влияние метки на свойства полимера, мы присоединили небольшую гидрофобную флуоресцирующую группу NBD (мол. масса 200) к концу гидрофобного ППО-блока REP. Анализ распределения полученного конъюгата REP-NBD между гексаном и водой показал, что если для исходного REP IgPreKcaH/вода был равен -0,95±0,02, то для REP-NBD ІЕРгексан/вода = -0,9±0,3. Эти результаты свидетельствуют о том, что введение флуоресцирующей метки в молекулу REP практически не повлияло на гидрофобность макромолекулы.
Влияние состава липидного бислоя на взаимодействие полиалкиленоксидов с липосомами
Влияние содержания фосфатидной кислоты (ФК) на микровязкость лецитиновых липосом. (Б) Кинетика транспорта доксорубицина в липосомы, содержащие 9% ФК (кривые 1,2) и 25% ФК (кривые 3,4) в присутствии 20 мкМ плюроника L61 (кривые 2,4) и в его отсутствие (кривые 1, 3). Условия соответствуют указанным в подписи к рис.20. Показаны усреднённые данные 2 экспериментов.
Введение фосфатидной кислоты приводило также и к замедлению транспорта доксорубицина в липосомы. При увеличении её содержания в липосомах от 9% до 25% транспорт замедлялся в 4-5 раз (см. масштаб на оси абсцисс на основном рис. 24Б и на вставке), константа скорости транспорта доксорубицина (к0) снижалась от 0,0081 с"1 до 0,0022 с 1. При этом увеличивался конечный уровень флуоресценции (кривые 1 и 3), что означало накопление меньшего количества доксорубицина в липосомах.
Сходное явление наблюдали при введении в состав бислоя других отрицательно заряженных липидов - кардиолипина и ганглиозида GM1. Подобные процессы были описаны и ранее [162, 260]. Предполагается, что он вызван уменьшением эффективной концентрации доксорубицина во внешнем буфере вследствие его электростатического связывания с липидами, отрицательно заряженными при нейтральных значениях рН.
Добавление плюроника к липосомам с 9% фосфатидной кислоты усиливало эти тенденции (рис. 24Б, кривые 2 и 4). Ранее было показано, что увеличение конечного уровня флуоресценции и, иногда, уменьшение наблюдаемой константы скорости в присутствии плюроника имеют своей причиной уменьшение рН-градиента вследствие образования малых пор, проницаемых для компонентов буферных растворов [163]. Такое влияние полимера усиливалось с увеличением содержания фосфатидной кислоты в липосомах: добавление плюроника к липосомам, содержавшим 0,25 мольных доли этого липида, подавляло накопление доксорубицина в липосомах и снижение флуоресценции в системе (рис. 24Б, кривая 4). Эти данные позволяют предположить, что плюроник вызывает дополнительное возмущение в мембранах, уже дестабилизированных фосфатидной кислотой, и тем самым приводит к пермеабилизации липосом, то есть к образованию в них пор. Это явление было обнаружено только при введении фосфатидной кислоты. Его не наблюдали ни в липосомах, построенных только из яичного лецитина, ни на двукомпонентных везикулах, содержавших в качестве второго компонента какой-либо другой липид.
Сфингомиелин и кардиолипин. Ко второй группе были отнесены сфингомиелин и кардиолипин, введение которых в состав липосом не приводило к достоверным изменениям микровязкости (рис. 25). Возможно, это объясняется тем, что молекулы этих липидов имеют цилиндрическую форму и не влияют на кривизну мембраны, построенной из лецитина [261, 262]. Введение сфингомиелина или кардиолипина не отражалось на способности плюроника ускорять транспорт доксорубицина в такие липосомы. Скорость процесса увеличивалась в одинаковой степени (kp/ko=const) независимо от липидного состава везикул, во всём диапазоне концентраций сфингомиелина (А) или кардиолипина (Б). Эти результаты свидетельствуют о том, что введение дополнительных липидов в состав мембраны не отражается на её чувствительности к плюронику, если при этом не меняется её микровязкость.
Введение ганглиозида GM1 лишь слегка увеличивало микровязкость бислоя. При мольной доле этого липида 0,23 микровязкость бислоя возрастала только на 0,2 Пуаза (рис. 26А, кривая 2). Увеличение микровязкости мембраны в присутствии ганглиозида отмечали и ранее [263, 264]. Однако это сравнительно небольшое увеличение микровязкости заметно ослабляло влияние плюроника (рис. 26А, кривая 1). Так, 0,23 мольных доли GM1 уменьшали значение kp/ko на 50%.
Обратную ситуацию наблюдали при использовании фосфатидилэтаноламина. Введение этого липида в состав лецитинового бислоя резко увеличивало микровязкость (рис. 26Б, кривая 2), но довольно слабо влияло на чувствительность мембраны к плюронику (рис. 26Б, кривая 1). В отличие от ганглиозида, внедрение 0,26 мольных доли фосфатидилэтаноламина в лецитиновые липосомы приводило только к 10% снижению величины kp/ko. Количественная несогласованность изменений в микровязкости и чувствительности к плюронику вероятно объясняется тем, что фосфатидилэтаноламин образует вогнутую поверхность в мембране (отрицательная спонтанная кривизна) [265], что приводит к уплотнению только в области полярных головок, тогда как ППО-блок плюроника внедряется в гидрофобную область остатков жирных кислот [173]. Незначительное уменьшение чувствительности липосом к плюронику свидетельствует о том, что фосфатидилэтаноламин вызывает слабые изменения в микровязкости гидрофобного слоя мембран.
Наиболее выраженные и согласованные изменения в свойствах липосом мы наблюдали при введении холестерина. Как известно, холестерин, содержание которого в плазматической мембране животных клеток может достигать 30% [31], локализуется в гидрофобной области бислоя, внедряясь между остатками жирных кислот. При его введении в состав липосом наблюдали резкое снижение чувствительности бислоя к действию плюроника (рис. 27, кривая 1) при одновременном сильном возрастании микровязкости бислоя (рис. 27, кривая 2). Холестерин оказывал наиболее сильное влияние среди всех рассмотренных липидов. При содержании холестерина более 0,45 мольных долей мембрана становилась практически нечувствительной к действию плюроника (рис. 27). Такой выраженный эффект холестерина, возможно, объясняется тем, что плюроники по данным Firestone локализуются в гидрофобной области мембраны, куда внедряется и холестерин [173].
