Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 6
2.1. Основные физико-химические свойства плюроников 6
2.2. Искусственные липидные бислои и взаимодействие плюроников с ними 8
2.3. Влияние синтетических соединений нафлип-флоп липидов 12
2.4. Влияние полимеров на проницаемость мембран 19
2.5. Применение плюроников в медицине 26
2.6. Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток и способы ее преодоления 27
2.6.1. Основные механизмы множественной лекарственной устойчивости 28
2.6.2. Строение и механизм действия Р-гликопротеина 30
2.6.3. Использование плюроников для подавления МЛУ 33
2.7. Синтез и физико-химические свойства полиглицеринов 40
3. Постановка задачи 43
Экспериментальная часть 45
4. Материалы и методы 45
4.1. Определение концентрации полимеров 46
4.2. Определение коэффициента распределения полимеров в системе н-гексан - вода 47
4.3. Кинетика проникновения доксорубицина в липосомы с градиентом рН 47
4.4. Измерение скорости флип-флопа липидов в липосомальных мембранах 49
4.5 Культивирование клеток 52
4.6. Определение белка 53
4.7. Электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблоттинг 53
4.8. Определение цитотоксичности доксорубицина и полимеров 54
4.9. Влияние полимеров на цитотоксичность доксорубицина 55
4.10. Исследование клеток методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) 56
4.11. Изучение выброса доксорубицина из клеток K562/DOX методом спектрофлуорометрии 57
4.12. Связывание 3Н-меченых полимеров с клетками K562/DOX 58
5. Результаты и их обсуждение 59
5.1. Взаимодействие синтетических полимеров с модельными липидными мембранами 59
5.1.1. Влияние синтетических блок-сополимеров на скорость трансбислойной миграции липидов (флип-флоп) 59
5.1.2. Влияние синтетических блок-сополимеров на проницаемость модельной липидной мембраны 75
5.2. Взаимодействие синтетических полимеров с клетками 79
5.2.1. Характеристика клеток 80
5.2.2. Цитотоксичность полимеров 84
5.2.3. Влияние полимеров на токсичность доксорубицина 87
5.2.4. Влияние полимеров на внутриклеточное накопление доксорубицина 93
5.2.5. Влияние полимеров на выброс доксорубицина из клеток 97
Выводы 103
Список сокращений 104
Список цитируемой литературы
- Искусственные липидные бислои и взаимодействие плюроников с ними
- Определение коэффициента распределения полимеров в системе н-гексан - вода
- Изучение выброса доксорубицина из клеток K562/DOX методом спектрофлуорометрии
- Влияние синтетических блок-сополимеров на проницаемость модельной липидной мембраны
Введение к работе
Синтетические амфифильные блок-сополимеры в последние годы находят все более широкое применение в медицине и фармакологии. К числу таких соединений относятся и блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, называемые также плюрониками. Обладая низкой токсичностью по сравнению с другими ПАВ, плюроники входят в состав композиций искусственных заменителей крови, выполняя роль стабилизаторов перфторуглеродных эмульсий [1], применяются в технологиях низкотемпературного консервирования органов и тканей [2], в иммунотерапии в качестве адъювантов [3, 4].
Исследования последних лет показали, что плюроники могут быть полезны для решения актуальной проблемы современной онкологии - преодоления устойчивости раковых клеток к широкому кругу лекарственных препаратов. Это явление, получившее название множественной лекарственной устойчивости, возникает в процессе химиотерапии и представляет собой серьезное препятствие для успешного лечения онкологических больных. Оказалось, что плюроники способны восстанавливать чувствительность таких клеток, устойчивых к противоопухолевым антибиотикам, а иногда даже делают их более чувствительными по сравнению с исходными опухолевыми клетками. Лекарственная форма SP1049C, содержащая плюроники и антибиотик доксорубицин, в настоящее время проходит клинические испытания за рубежом [5].
Молекулярный механизм действия плюроников на опухолевые клетки до сих пор непонятен, хотя в последнее время и в этом направлении достигнуты существенные успехи. Было установлено, что плюроники ингибируют выброс лекарств, осуществляемый белками-транспортерами Р-гликопротеином (P-gp) и MRP (Multidrug Resistance Protein) [6-8], вызывают уменьшение внутриклеточной концентрации АТФ [9, 10] и освобождение антибиотиков из внутриклеточных везикул [11, 12]. Взаимодействуют ли плюроники непосредственно с белками-транспортерами или действие полимеров обусловлено влиянием на структуру клеточных мембран, пока неясно. Показано, что встраивание плюроников в искусственные липидные мембраны вызывает увеличение подвижности липидов и повышение проницаемости бислоя по отношению к лекарству [13]. Причем, активны не мицеллы, а единичные молекулы блок-сополимера, и эффективность их действия зависит от гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) макромолекулы [14]. В то же время до сих пор остается неизвестным, какие именно особенности структуры плюроников и входящих в него мономеров определяют их биологическую активность. Поняв молекулярные причины воздействия плюроников на
структуру мембраны, можно целенаправленно конструировать полимеры, способные воздействовать на определенные процессы в биологических мембранах.
Настоящая работа посвящена исследованию взаимодействия амфифильных блок-сополимеров, различающихся по структуре их гидрофобного и гидрофильного блоков, с модельными липидными мембранами и живыми клетками, обладающими множественной лекарственной устойчивостью. Цель работы состояла в выявлении структурных параметров сополимеров, обусловливающих их способность возмущать структуру мембран и снижать устойчивость опухолевых клеток к действию лекарств.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Искусственные липидные бислои и взаимодействие плюроников с ними
Основной фазовый переход в бислое связан с переходом углеводородных цепей липидных молекул из состояния геля в состояние жидкого кристалла. В гель-фазе (Lp) подвижность молекул и сегментов углеводородной цепи незначительна и ограничена лишь медленным вращением молекул фосфолипидов вокруг своей оси. Углеводородные цепи находятся преимущественно в транс-конфигурации. При этом минимальная площадь сечения молекулы диацильного липида составляет около 38 А2 (меньше полярной головки). Для увеличения поперечного сечения и достижения соответствия размеру полярной головки ацильные цепи дипальмитоилфосфатидилхолина наклоняются по отношению к нормали бислоя (рис.2, фаза Lp). У фосфатидилэтаноламина размер полярной головки меньше, поэтому наклона цепей не происходит.
На границе двух фаз с различной ориентацией липидных молекул в мембране образуются флуктуирующие поры, которые можно представить себе как дефекты упаковки липидов на границе между гелевыми и жидкокристаллическими доменами бислоя [23, 29, 30] Такие дефекты могут возникать даже в однородном жидкокристаллическом бислое, построенном из одинаковых липидных молекул, вследствие их теплового движения. Если бислой состоит из липидов двух или нескольких типов, количество дефектов в мембране увеличивается. Согласно теоретическим представлениям о свободной энергии деформации мембраны, образование дефектов весьма невыгодно. Поэтому система эволюционирует в сторону их устранения. Это может достигаться, например, за счет искажения макроструктуры мембраны, образования в ней выпуклостей или впадин [31]. В том случае, когда в омывающем мембрану растворе содержатся инородные гидрофобные вещества, сопоставимые по размерам с образовавшимся дефектом, то встраивание их в бислой резко облегчается, поскольку приводит к понижению свободной энергии и стабилизации мембраны.
Однако в случае несоответствия геометрии молекул липидов и включенного полимера его внедрение в липидный бислой может приводить к нарушению структуры мембраны, образованию в ней дефектов и, как следствие, изменению ее свойств. Так, например, методом ДСК было показано, что взаимодействие ацеталей, образованных поливиниловым спиртом и низшими альдегидами, с липидным бислоем приводило к изменению термодинамических параметров фазового перехода липидов из гель-фазы в жидкокристаллическое состояние [32].
Изменение свойств мембран под действием синтетических полимеров наблюдали не только на искусственных липидных бислоях, но и на живых клетках. Так, в ряде работ было показано, что плюроники оказывают значительное влияние на механические свойства клеточной мембраны. Например, плюроник F68 более чем в 2 раза повышал модуль упругости мембран клеток гибридомы [33]. Добавление этого полимера к фибробластам линии Swiss ЗТЗ, у которых была повреждена мембрана, ускоряло процесс ее восстановления [34]. Аналогичный эффект плюроник F68 оказывал и на клетки насекомых [35] и инфузории Tetrahymena [36]. Авторы полагают, что влияние плюроника объясняется понижением поверхностного натяжения на границе мембрана-раствор, обусловленным, по-видимому, встраиванием полимера в дефектные области мембраны.
Влияние плюроников на организацию липидов в бислое в разбавленных водных растворах было впервые изучено И.Н. Топчиевой с сотр. [37]. Методами дифференциальной сканирующей калориметрии и малоуглового рентгеновского рассеяния было показано, что полимер встраивается в фосфолипидный бислой, причем блок полипропиленоксида внедряется в бислой, а блок полиэтиленоксида экспонируется в водную фазу. Эти результаты были в дальнейшем подтверждены в работах Kostarelos К. и TadrosT.F. [38] а также Firestone М.А. с сотр. с помощью малоуглового рассеяния синхротронного рентгеновского излучения [39,40].
Анализ изменения размеров липидных везикул методом динамического светорассеяния показал, что при добавлении избытка плюроника к липосомам он встраивается в мембрану в соотношении 1 макромолекула полимера на 10-20 молекул липида [41]. Приведенная количественная оценка связывания плюроников с мембранами проводилась в предположении, что при адсорбции полимера число молекул липида в составе липосомы и форма везикул не меняются. Однако это предположение не вполне справедливо, поскольку, как выяснилось впоследствии, форма мембраны может изменяться при встраивании полимеров [42].
Известно, что в бислое молекулы липидов находятся в постоянном движении. В жидкокристаллической фазе выделяют три основных типа движения липидов: молекулярные колебания с частотой порядка 10"14с, латеральная диффузия и трансбислойная миграция (флип-флоп).
Латеральная диффузия - это тепловое движение липидных молекул в пределах монослоя. Этот процесс изучают, как правило, с помощью внешних зондов -фотореактивных [43], спин-меченых [44], или флюоресцентных [45]. Получаемая при этом информация дает представление о динамике и молекулярной упорядоченности бислоя и позволяет судить о скорости движения липидов в мембране и о сопротивлении их движению - микровязкости мембраны. Коффициенты латеральной диффузии липидов в модельных мембранах варьируют в пределах 10-10 см /с, в клеточных мембранах эта величина в 10-100 раз меньше [46]. Возможно, это связано с присутствием в биологических мембранах белков, препятствующих латеральной диффузии липидов. Подвижность липидных молекул в плоскости бислоя зависит от плотности упаковки углеводородных цепей: относительно быстрая диффузия липидов в жидкокристаллическом состоянии замедляется на несколько порядков при переходе бислоя в состояние геля. Кроме того, латеральная диффузия липидов зависит от длины и насыщенности углеводородных цепей [47], состава липидного бислоя. Скорость латеральной диффузии фосфолипидов с разными полярными головками различается незначительно, однако в реконструированных везикулах ганглиозиды с большой полярной головкой диффундировали медленно [48].
Определение коэффициента распределения полимеров в системе н-гексан - вода
Р-гликопротеин был открыт в 70-х годах [150], и в настоящее время является наиболее важным и хорошо изученным членом семейства АВС-транспортеров. P-gp - интегральный трансмембранный белок с молекулярной массой 170 кДа, образующийся путем гликозилирования npo-P-gp (140 кДа). Этот белок содержит 1280 аминокислот и состоит из двух частей, каждая из которых включает 6 гидрофобных трансмембранных доменов, предположительно а-спиралей, и сайт связывания АТФ, обращенный в цитоплазму (рис. 4). Р-гликопротеин локализуется главньм образом в цитоплазматической мембране, однако в некоторых работах его обнаруживали также в мембранах лизосом и аппарата Гольджи[151, 152].
Третичная структура P-gp - предмет горячих споров [153, 154]. В настоящее время в литературе наиболее распространена точка зрения, согласно которой 12 трансмембранных а-спиралей расположены симметрично, образуя пору.
До сих пор остается непонятным, каким образом этот белок распознает и удаляет из цитоплазмы такое огромное количество соединений разной структуры и механизма действия [125, 126, 155]. В 1992 году М. Gottesman и С. Higgins [156] предложили модель, согласно которой P-gp узнает свой субстрат во внутреннем (цитоплазматическом) монослое липидной мембраны и затем, в результате конформационных превращений, переносит его на внешний монослой (флипазная гипотеза) или во внеклеточное пространство (модель пылесоса). Для удаления одной молекулы субстрата используется энергия гидролиза двух молекул АТФ.
В пользу этой гипотезы свидетельствуют, в частности, результаты исследования взаимодействия Р-гликопротеина с радиоактивно-меченными субстратами, показавшие, что субстрат-связывающий участок взаимодействия белка находится в мембране. Предполагают, однако, что таких участков связывания субстрата у P-gp может быть несколько, и находятся они в трансмембранных доменах [157, 158]. Действительно, эти участки полипептидной цепи P-gp содержат большое количество аминокислот, боковые группы которых - хорошие доноры водородных связей (Ser Tre Tyr Glu) и потенциально могут принимать участие в связывании субстратов P-gp, которые, как будет отмечено ниже, содержат группы - акцепторы водородных связей. Замена, например, серина на фенилаланин в трансмембранном домене P-gp приводит к тому, что узнавание и выброс субстрата происходит значительно хуже [159].
Вещества, транспортируемые P-gp, несмотря на разнообразие, все же имеют некоторые общие характеристики. Большинство субстратов P-gp представляют собой небольшие гидрофобные соединения (Mw 300-2000), положительно заряженные при физиологических условиях. Для оценки возможной принадлежности данного вещества к субстратам P-gp было предложено эмпирическое правило 4-х: соединения, у которых число атомов азота и кислорода равно или больше 8, молекулярный вес более 400 Да и рКа 8, скорее всего могут быть субстратами P-gp. Если (N+0) 8, Mw 400, рКа 8, то такие вещества субстратами не являются [160]. В последние годы появилось много работ, в которых более подробно были проанализированы структурные особенности субстратов Р-гликопротеина: число электроно-донорных групп и их пространственное расположение, наличие гидрофобных заместителей. Так, например, A. Seelig с соавторами, протестировав более сотни соединений, установили, что потенциальные субстаты P-gp должны иметь минимум 2 электроно-донорные группы на расстоянии 2.5+0,3 А или 4.6+0,6 А друг от друга [161, 162]. В аналогичной работе Cianchetta с соавт. так же подчеркивалось значение пространственной структуры молекулы. Однако авторы этой работы пришли к выводу, что элементами узнавания субстрата являются 2 гидрофобные группы, расположенные на расстоянии 16,5 А, и две группы-акцепторы водородной связи, удаленные друг от друга на расстояние 11,5 А [163]. Для ряда соединений была также обнаружена обратная пропорциональность между коэффициентом их распределения в системе липид-вода, KL/W И константой Михаэлиса-Ментен, Км, АТФазной активности Р-gp. При этом установлено, что KL/W KM 1. Это означает, что чем выше гидрофобность субстрата, тем выше его сродство к P-gp [162]. В одной из своих последних работ A. Seelig с соавт. попытались количественно охарактеризовать взаимодействие P-gp с субстратом, определяя свободную энергию связывания соединения из липидной фазы с активным центром белка [164]. Полученные ими данные свидетельствуют о том, что скорость-лимитирующей стадией взаимодействия P-gp с субстратом является проникновение соединения через мембрану, в то время как для эффективного узнавания наибольшее значение имеют наличие групп - доноров электронов или акцепторов водородной связи.
В настоящее время разработано несколько стратегий преодоления МЛУ, обусловленной гиперэкспрессией P-gp и других транспортеров. Все они направлены на то, чтобы увеличить концентрацию лекарства внутри клетки.
Одним их подходов для решения этой задачи является поиск новых лекарственных препаратов, являющихся плохими субстратами для P-gp. Своего рода пионерами в этой области являются В. Прибе и его коллеги, которые получили путем химической модицикации известных противоопухолевых антибиотиков ряд лекарственных соединений, которые сохраняли свои фармакологические свойства, но обладали пониженным сродством к P-gp. Так, например, они обнаружили, что замена аминогруппы на гидроксильную в сахарном остатке доксорубицина приводит к значительному снижению устойчивости клеток по отношению к такому модифицированному препарату [165].
В работах группы Garnier-Suillerot было показано, что обмануть P-gp можно также с помощью лекарств, скорость проникновения которых в клетку значительно выше скорости их выброса. Авторы провели анализ кинетики транспорта антибиотиков в клетки, содержащие P-gp, и показали, что скорость захвата лекарства клеткой обратно пропорциональна уровню ее устойчивости. В то же время, явной корреляции между
уровнем резистентности клеток и кинетикой выброса лекарства отмечено не было [166, 167]. Роль скорости пассивной диффузии соединения подчеркивалась и другими авторами, которые отмечали, что скорость проникновения в клетку соединений, являющихся ингибиторами P-gp, значительно выше, чем лекарств-субстратов [168].
В последние годы появилось большое количество работ, целью которых является подавление экспрессии P-gp в клетках посредством регуляции соответствующего гена. Для решения этой задачи используют антисмысловые олигонуклеотиды [169], которые уменьшают уровень mdrl- м-РНК, а также "hammerhead" (молоткообразные) рибозимы (каталитические РНК), вызывающие деградацию специфической м-РНК или про-мРНК [170, 171]. Недавно появились работы, в которых для расщепления молекул РНК использовали двуцепочечные интерферирующие РНК [172]. Однако, несмотря на то, что результаты, полученные in vitro, свидетельствуют об эффективности этого подхода, применение этих соединений в клинической практике, вероятно, будет ограниченным, по сравнению с более дешевыми и удобными в использовании низкомолекулярными ингибиторами P-gp.
К настоящему времени обнаружено и синтезировано немалое количество таких конкурентных и неконкурентных ингибиторов ABC-транспортеров, в том числе и P-gp [173-175]. Ингибиторы первого поколения (верапамил, циклоспорин А), несмотря на довольно высокую эффективность, не нашли широкого применения в клинике вследствие их довольно высокой токсичности [176] Токсичность модификаторов второго поколения (валсподар, бирикодар) значительно ниже, однако фармакокинетика этих соединений была сложной и непредсказуемой, осложненной их взаимодействием с другими белками-транспортерами, необходимыми для функционирования клеток. Предварительные исследования модификаторов третьего поколения демонстрируют их высокую эффективность и специфичность по отношению к P-gp наряду с хорошей фармакокинетикой, однако клинические испытания многих из этих соединений еще не закончены. В связи с этим поиск новых соединений, ингибирующих активных выброс лекарства, является актуальной задачей.
Изучение выброса доксорубицина из клеток K562/DOX методом спектрофлуорометрии
Влияние полимеров на накопление доксорубицина в клетки, а также его внутриклеточное перераспределение изучали на конфокальном микроскопе фирмы Leica TCS SP2 (Германия), с использованием объектива Olimpus (20-кратное увеличение, NA=0,95).
Мы использовали двухфотонное возбуждение доксорубицина, позволяющее получать наилучшее соотношение сигнал/шум, элиминировать аутофлуоресценцию клеток, исключить выгорание DOX и фототоксичность излучения.
Суспензионные клетки линии К562 сорбировали на поверхности чашки Петри, предварительно покрытой полилизином. В результате электростатического взаимодействия между отрицательно заряженной поверхностью клетки и положительно заряженным полилизином мы получали своеобразный монослой клеток К562, что дало нам возможность в ходе эксперимента в заданной фокальной плоскости сравнивать интенсивность флуоресценции DOX в разных клетках.
Внутримешочное накопление доксорубицина. В чашки Петри диаметром 3 см вносили по 2 мл 0,01 % раствора полилизина и оставляли на 30 мин при 37С. После этого раствор полимера удаляли, 2-3 раза омывали дно чашки раствором PBS и высушивали при 37С.
Суспензию клеток К562 (5 105 клеток/мл) в среде RPMI1640, не содержащей сыворотки, инкубировали в течение часа с доксорубицином (10 мкг/мл) в присутствии или отсутствие исследуемого сополимера в стандартных условиях. Затем клетки осаждали (2 мин, 100g, центрифуга "Eppendorf", США), суспендировали в холодном PBS (4С, рН 7,4) и помещали в чашки Петри, покрытые полилизином. Через 15 мин инкубации при 4С образец омывали свежей порцией холодного PBS для удаления неприкрепившихся клеток и сразу же исследовали с помощью конфокального микроскопа, используя двухфотонное возбуждение (титан-сапфировый лазер, ,6=840 нм) и регистрируя флуоресценцию в интервале 540-610 нм.
Для исследования кинетики накопления DOX клетки, прикрепленные к подложке, как описано выше, помещали в термостатируемую ячейку (37С), аккуратно добавляли к ним 2 мл среды RPMI1640 (без сыворотки), предварительно нагретой до 37С и содержащей 10 мкг/мл DOX и исследуемый полимер (или верапамил). За изменением интенсивности флуоресценции DOX ( ВОТб=840нм, Хис„=540-610 нм) следили в реальном времени, записывая изображения клеток каждые 3-5 мин.
Клетки MCF7 высевали в стерильные чашки Петри в плотности 3-Ю4 клеток/см2 за сутки до эксперимента. Внутриклеточное накопление DOX и влияние полимеров на этот процесс изучали, как описано выше, используя среду DMEM и более высокую концентрацию антибиотика (50 мкг/мл).
Выброс доксорубицина из клеток, обладающих МЛУ Клетки K562/i-S9, K562/DOX и MCF7/DOX инкубировали с 10 мкг/мл (линии К562) или 50 мкг/мл (MCF7/DOX) доксорубицина в течение 6 ч в стандартных условиях. В случае линии К562 суспензию клеток помещали в конце инкубации на 15 мин в чашки Петри, покрытые полилизином. Далее клетки промывали 3 раза холодным PBS, добавляли 2 мл соответствующей среды, предварительно нагретой до 37С и содержащей исследуемый полимер (или верапамил). За изменением интенсивности флуоресценции DOX внутри клеток во времени следили, как описано выше.
Анализ изображений Количественный анализ изображений проводили с помощью программы ImageJ 1.34s. При обработке экспериментов по накоплению DOX в течение часа для каждого образца измеряли интенсивность сигнала в ядрах 50-70 клеток.
Исследуя кинетику накопления антибиотика или его выброса, следили за изменением интенсивности сигнала в ядрах 5-10 выбранных клеток на изображениях, полученных через различные промежутки времени после начала эксперимента.
В каждом эксперименте данные фотометрирования подвергали статистическому анализу. Клетки K562/DOX инкубировали с DOX в больших культуральных флаконах, как описано в п. 4.5. Далее клетки осаждали (5 мин, 100 g), 2 раза промывали холодным PBS и суспендировали в среде RPMI 1640, нагретой до 37С. Суспензию клеток (0,5 мл, 3-4і06клеток/мл) добавляли к равному объему раствора исследуемого соединения (полимера или ингибитора P-gp) в среде RPMI 1640, содержащей 20 тМ HEPES, рН 7,4. Образцы инкубировали при 37С в воздушном термостате, перемешивая оседающие клетки каждые 15 мин. Через различные промежутки времени клетки осаждали (2 мин, 100 g, центрифуга "Eppendorf", США) и определяли в супернатанте количество DOX по интенсивности его флуоресценции на флуориметре Hitachi 65010 S (Япония).
Клетки осаждали, дважды промывали PBS и суспендировали в среде RPMI1640, содержащей 10 мМ HEPES, рН 7,4 (37С). Клетки, 1 мл, 3 106 клеток/мл, инкубировали с радиоактивно меченным полимером (по 3 параллельных пробы) 2 часа в воздушном термостате при 37С, встряхивая каждые 15-20 мин. Для удаления несвязавшегося полимера клетки промывали 5 раз по 1 мл PBS, центрифугируя пробы по 5 мин при 100 g и аккуратно отбирая супернатант шприцом с загнутой иглой. Промытые клетки растворяли в 100 мкл Ш NaOH в течение ночи при комнатной температуре. 25 мкл щелочного раствора использовали для определения белка по Лоури (п. 4.6.). Оставшиеся 75 мкл нейтрализовали 225 мкл 0,4 М НС1, смешивали с 3 мл тритонового сцинтиллятора и на следующий день измеряли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике "Delta-400" (США).
В настоящей работе была поставлена задача выяснить, какие структурные особенности полимеров обусловливают их способность изменять структуру и свойства липидной мембраны. Для ответа на этот вопрос было исследовано влияние различных нейтральных амфифильных блок-сополимеров на скорость трансбислойной миграции липидов (флип-флоп) в липидном бислое и проницаемость липосомальной мембраны по отношению к противоопухолевому антибиотику доксорубицину.
Исследованные полимеры мы условно разделили на 7 групп, в зависимости от химической структуры и степени полимеризации гидрофобного и гидрофильного блоков (Таблица 2).
Первые три группы - плюроники, различающиеся степенью полимеризации полипропиленоксида (ППО). Блок-сополимеры, входящие в каждую из этих групп, имеют одинаковый блок ППО и различаются содержанием ЭО.
Четвертая группа - это сополимеры, у которых гидрофобный блок является статистическим сополимером, содержащим 30 звеньев ПО и 6 звеньев ЭО, а гидрофильный блок - полиглицерин разной степени полимеризации.
В пятую и шестую группы вошли ПАВ, имеющие в качестве гидрофобной части алкильный радикал нормального строения, а в качестве гидрофильной - полиглицерин или ПЭО, соответственно.
В седьмую группу мы выделили гомополимеры глицерина и этиленоксида. Влияние вышеописанных полимеров на трансбислойную миграцию липидов в модельной мембране мы исследовали на липосомах, содержавших на внутреннем монослое фосфатидилэтаноламин (ФЭ), меченный флуорофором - НБД [228]. Такие асимметрично меченные везикулы инкубировали с исследуемым полимером и через определенные промежутки времени определяли долю НБД-меченого липида, F, перешедшего на внешний монослой за время инкубации. Влияние полимера на флип-флоп липидов оценивали, (1) сравнивая скорость трансбислойной миграции НБД-ФЭ в его присутствии со скоростью процесса в отсутствие добавок и/или (2) сравнивая значения F за одинаковый (5-Ю мин) промежуток времени.
Влияние синтетических блок-сополимеров на проницаемость модельной липидной мембраны
В отличие от линейного ПЭО блок полиглицерина имеет разветвленную структуру. С ростом степени полимеризации глицерина количество гидроксильных групп на поверхности полимера быстро увеличивается. Это препятствует его взаимодействию с мембраной, причем в блок-сополимерах с одинаковым блоком ППО «отрицательное» влияние полиглицеринов выражено значительно сильнее, чем аналогичное увеличение количества звеньев ЭО в плюрониках (рис. 15).
Отдельного рассмотрения требует первый представитель группы IV - PG2. Этот блок-сополимер содержит всего 2 мономерных звена глицерина (рис. 21 А). Четыре гидроксильные группы обеспечивают относительно низкую гидрофобность PG2: коэффициент его распределения LgP в системе вода-гексан в 2 раза ниже, чем у плюроника L61 (рис.21 Б), содержащего такое же количество звеньев ПО. Несмотря на это, «флипазная активность» PG2 (ПОзоЭОбГЛг) была почти в 2 раза выше, чем у L61 (Э02ПОзоЭ02) и сопоставима с L81 (ЭОзПО40ЭО3) (табл. 3).
С одной стороны, это можно объяснить более объемным гидрофобным блоком ПОзоЭОбГЛг, который помимо 30 звеньев ПО, содержит 6 звеньев ЭО, распределенных статистически по цепи ППО. Кроме того, эти полярные звенья ЭО, «принудительно» оказавшись в липидной мембране, возможно, вызывают дополнительное возмущение структуры бислоя.
С другой стороны, причина большего ускорения флип-флопа НБД-ФЭ под действием ПОзоЕОбГЛг по сравнению с похожими по строению плюрониками может заключаться в различной структуре гидрофильной части этих сополимеров. Находясь в непосредственной близости от поверхности мембраны, остатки глицерина могут вызывать дополнительное возмущение в области полярных головок липидов, тем самым увеличивая подвижность липидных компонентов в бислое. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что представитель группы V (СібНзз-ГЛю) был почти в 2 раза эффективнее, чем Brij 56 (СібНзз-ЗОіо) с таким же гидрофобным блоком, но линейным ПЭО в качестве гидрофильной части. Взаимодействие этих соединений с мембраной схематично изображено на рис. 22.
Таким образом, на данном этапе работы мы изучили взаимодействие 20 полимеров и ПАВ (табл. 2) с липосомами. Было обнаружено, что исследованные соединения взаимодействуют с липидным бислоем и могут вызывать ускорение флип-флопа липидов, не нарушая при этом целостности мембраны. «Флипазная активность» действующего соединения зависела от его структуры и увеличивалась с ростом общей гидрофобности ПАВ и объема гидрофобного блока. Кроме того, сравнение соединений с одинаковым гидрофобным блоком (ППО или СібНзз- ), но различной гидрофильной частью (полиэтиленоксид или полиглицерин) показало, что ПАВ, содержащие полиглицерин, сильнее ускоряют флип-флоп, что, по-видимому, обусловлено дополнительным возмущением структуры липидного бислоя, вызванного разветвленным блоком ПГЛ.
Возмущение структуры липидного бислоя и ускорение трансбислойной миграции липидов может приводить к увеличению проницаемости мембраны по отношению к низкомолекулярным веществам. Поэтому на следующем этапе исследования мы изучили влияние амфифильных блок-сополимеров и ПАВ на барьерные свойства мембраны.
Влияние исследуемых соединений на проницаемость липидной мебраны было изучено на модельной системе, разработанной ранее в нашей лаборатории. Эта система представляет собой малые моноламеллярные липосомы с градиентом рН между их внутренним содержимым и внешней средой. В качестве транспортируемого низкомолекулярного соединения был выбран доксорубицин - противоопухолевый антибиотик, широко используемый в химиотерапии рака Доксорубицин содержит в своем составе аминогруппу и является слабым основанием (рКа 8,6). При нейтральном значении рН в растворе содержится около 2% незаряженных молекул DOX, которые проникают через мембрану внутрь липосом по механизму растворение-диффузия. Поскольку значение рН внутреннего содержимого липосом значительно ниже (рН4,0), кислотно-основное равновесие внутри везикул практически полностью смещается в сторону протонированной формы DOX, которая не выходит из липосом.
За кинетикой такого рН-индуцированного транспорта антибиотика можно следить, используя его флуоресцентные свойства (Х,Возб-490 нм, Хисп=550, 557 нм). Концентрирование DOX внутри везикул приводит к самотушению его флуоресценции и падению общей интенсивности излучения в системе (Рис. 23, кривая 1). Добавление блок-сополимера на основе пропиленоксида и глицерина ПОзоЭОбГЛг приводило к ускорению аккумуляции DOX в липосомах, причем, как и в случае флип-флопа НБД-ФЭ, влияние блок-сополимера на процесс увеличивалось с ростом его концентрации в растворе (рис 23, кривые 2,3 и 4).
Такая закономерность наблюдалась при тестировании полимеров в концентрациях ниже ККМ. При этом, неизменность конечного уровня флуоресценции DOX (рис. 23) свидетельствовала о том, что полимеры не вызывали повреждения мембраны. В противном случае происходило бы разрушение градиента рН, вытекание DOX во внешнюю среду и, как следствие, возгорание его флуоресценции. Такие процессы наблюдали при добавлении в систему соединений группы V (СібНзз-ГЛю, СібНзз-ГЛм), которые, как и при тестировании влияния на флип-флоп, оказывали слабый эффект на транспорт DOX в липосомы, а в высокой концентрации нарушали их целостность (рис. 24)
