Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор
1.1. Общие положения
1.2. Полиэлектролитные комплексы хитозана
1.2.1. Структура и свойства хитозана
1.2.2. Полиэлектролитные комплексы хитозана с биополиэлектролитами и модифицированными природными полианионами
1.2.2.1. Полиэлектролитные комплексы хитозана с полисахаридами
1.2.2.2. Полиэлектролитные комплексы хитозана с ДНК
1.2.2.3. Полиэлектролитные комплексы хитозана с белками
1.2.3. Полиэлектролитные комплексы хитозана с синтетическими полианионами
1.3. Заключение
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть
2.1. Характеристика исходных соединений
2.2. Физико-химические методы исследования
2.2.1. Исследование процесса комплексообразования с использованием спектрофотометрических методов анализа
2.2.1.1. Колориметрическое титрование комплекса метиленового голубого с сополимером малеиновой кислоты раствором хитозана
2.2.1.2. Исследование комплексообразования хитозана с сополимерами малеиновой кислоты методом турбидиметрического титрования
2.2.2. Потенциометрия
2.3. Получение полиэлектролитных комплексов
2.4. Получение аффинных сорбентов лектина зародышей пшеницы
2.4.1. Ионно сшитые сорбенты на основе полиэлектролитных комплексов хитозана
2.4.2. Ковалентно сшитые сорбенты на основе полиэлектролитных комплексов хитозана
2.5. Получение нитроанилида сополимера Л/-винилпирролидона с малеиновой кислотой
2.6. Определение состава полиэлектролитных комплексов 55
2.7. Исследование биоспецифических свойств аффинных сорбентов на основе полиэлектролитных комплексов хитозана 55
2.8. Синтез аффинных полимеров со специфическим лигандом к плазминогену. 55
2.8.1. Иммобилизация незащищенного лизина (метод I) 56
2.8.2. Иммобилизация Л/---ґе/т-ВОС-лизина с последующим удалением N-E-защитной группы (метод II) 56
2.9. Определение содержания лизина в аффинных полимерах 57
2.9.1. Модификация флюоренилметилоксикарбонил хлоридом аффинных полимеров 57
2.9.2. Количественная тонкослойная хроматография 57
2.9.3. ПМР-спектроскопия 58
2.10. Модификация поверхности различных материалов бислойными и мультислойными полиэлектролитными покрытиями 58
2.11. Анализ свойств модифицированных поверхностей 59
2.12. Биохимические, гематологические и биомедицинские исследования аффинных покрытий 60
2.12.1. Исследование адсорбции плазминогена на модифицированных поверхностях 60
2.12.2. Гематологические исследования влияния модифицированных поверхностей на показатели крови in vitro (в статических условиях) 61
2.12.3. Экспресс-метод оценки in vitro и ex vivo степени тромбогенности модифицированных материалов 61
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение
3.1. Условия образования и свойства полиэлектролитных комплексов хитозана с сополимерами малеиновой кислоты 63
3.1.1. Теоретические предпосылки образования полиэлектролитных комплексов... 63
3.1.2. Физико-химические аспекты комплексообразования хитозана с сополимерами малеиновой кислоты 66
3.1.2.1. Изучение процесса взаимодействия и определение констант связывания хитозана с сополимерами малеиновой кислоты 66
3.1.2.2. Изучение влияния температуры на размер частиц полиэлектролитов методом АСМ 73
3.1.2.3. Изучение методом турбидиметрии влияния условий комплексообразования на процесс взаимодействия полиэлектролитов... 74
3.2. Нерастворимые полиэлектролитные комплексы хитозана и сополимеров малеиновой кислоты 85
3.2.1. Получение и характеристика состава нерастворимых полиэлектролитных комплексов 85
3.2.2. ИК-спектроскопия нерастворимых полиэлектролитных комплексов 88
3.2.3. Исследование процесса набухания нерастворимых полиэлектролитных комплексов 89
3.2.4. Потенциометрическое титрование полиэлектролитных комплексов 90
3.3. Получение сорбентов на основе полиэлектролитных комплексов 92
3.3.1. Сорбенты для ионообменной хроматографии 92
3.3.2. Аффинные сорбенты лектина зародышей пшеницы 93
3.3.2.1. Получение и исследование свойств аффинных сорбентов лектина зародышей пшеницы 93
3.3.2.2. Исследование биоспецифических свойств аффинных сорбентов лектина зародышей пшеницы 96
3.3.3. Аффинные сорбенты плазминогена 98
3.3.3.1. Проблема тромборезистентности медицинских изделий и пути ее решения 98
3.3.3.2. Синтез аффинных полимеров I0I
3.3.3.3. Исследование структуры аффинных полимеров методом ЯМР-спектроскопии 104
3.3.3.4. Анализ аффинных полимеров методом количественной тонкослойной хроматографии 106
3.3.4. Модификация поверхности различных материалов би- и мультислойными покрытиями 109
3.3.5. Исследование модифицированных биоспецифическими покрытиями поверхностей материалов с помощью физических методов анализа 112
3.3.5.1. Характеристика поверхности с помощью ИК-МНПВО 113
3.3.5.2. Оценка степени гидрофильности поверхностей 116
3.3.5.3. Морфология поверхностей 117
3.3.5.4. Элементный состав поверхностей 118
3.3.6. Адсорбция плазминогена на модифицированных поверхностях 122
3.3.7. Исследование влияния материалов, модифицированных биоспецифическими покрытиями, на состояние системы гемостаза и оценка их тромборезистентных свойств 127
3.3.7.1. Гематологические исследования in vitro (в статических условиях) влияния биоспецифических покрытий на гемостаз 128
3.3.7.2. Исследование тромборезистентных свойств материалов, модифицированных биоспецифическими покрытиями, в экспериментах in vitro и ex vivo в динамических условиях 130
Выводы 135
Список литературы 138
- Полиэлектролитные комплексы хитозана с биополиэлектролитами и модифицированными природными полианионами
- Получение аффинных сорбентов лектина зародышей пшеницы
- Модификация поверхности различных материалов бислойными и мультислойными полиэлектролитными покрытиями
- Получение сорбентов на основе полиэлектролитных комплексов
Введение к работе
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Общие положения
Полиэлектролитные комплексы хитозана
Структура и свойства хитозана
Полиэлектролитные комплексы хитозана с биополиэлектролитами и модифицированными природными полианионами
Полиэлектролитные комплексы хитозана с полисахаридами
Полиэлектролитные комплексы хитозана с ДНК
Полиэлектролитные комплексы хитозана с белками
1.2.3. Полиэлектролитные комплексы хитозана с синтетическими полианионами
1.3. Заключение
Полиэлектролитные комплексы хитозана с биополиэлектролитами и модифицированными природными полианионами
Полисахариды представляют собой высокомолекулярные углеводы - продукты поликонденсации моносахаридов, в которых моносахаридные остатки связаны гликозидными связями [36]. Полисахариды условно подразделяют на четыре группы: фитополисахариды, зоополисахариды, полисахариды микроорганизмов и синтетические полисахариды Типичные представители фитополисахаридов - целлюлоза, гемицеллюлозы, кснланы, глкжоманнаны, галакганы, пектины, крахмал, полисахариды водорослей (агар, каррагинан, фукан, галактаны и т.д); зоополисахариды - хитин, гликоген, гликозаминогликаны соединительной ткани (гепарин, гиалуроновая кислота, хондроитинсульфаты, керагансульфаты); наиболее известные полисахариды микроорганизмов - декстраны и маннаны, гиалуроновая кислота из стрептококков Л и С, и т.д. Как известно, полисахариды проявляют высокую биологическую активность, при этом они являются низкотоксичными, биосовместимыми и биодеградируемыми веществами Уникальный комплекс свойств полисахаридов привлекает большое внимание исследователей и позволяет использовать их в различных научных и практических целях, в частности, для конструирования различного рода биоматериалов, к примеру, путем комплексообразования с противоположнозаряженными биомолекулами. В этом аспекте, наиболее изученными ПЭК хигозана являются его поликомплексы с зоополисахаридами, в частности, с гликозаминогликанами (ГАГ). Как известно, ГАГ играют важную роль в живых организмах К примеру, мукополисахарид кератансульфат входит в состав протеогликанового комплекса, могущего образовывать комплексы с гиалуроновой кислотой, участвует в конструировании стенок кровеносных сосудов [37, 38]. Гепарин может ускорять размножение одних клеток и ингибировать рост других, стабилизировать ростовой фактор, кроме того, гепарин обладает антикоагулянтными, антисклеротическими, противовоспалительными свойствами и относится к наиболее часто применяемым в медицине препаратам для лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний. В свою очередь, хитозан является биосовместимым, биорезорбируемым полимером, в частности, он цитосовместим с кератиноцитами, фибробластамп, адгезия и пролиферация которых на ХЗ зависит от СД: чем выше СД, тем лучше адгезия клеток.
При этом, фибробласты адгезируют лучше, чем кератиноциты, однако, пролиферация последних быстрее, чем выше СД [39]. В живом организме ХЗ может связываться с ГАГ, в частности, с хондроитинсульфатом, гиалуроновой кислотой [37] с образованием устойчивых ПЭК. В работах [40-43] описаны ПЭК ХЗ с гиалуроновой кислотой, хондроитин-4-сульфатом, хондроитин-6-сульфатом, гепарином, сульфированной целлюлозой. Было установлено, что стехиометрический ПЭК хитозана (гликольхитозана) с гиалуроновой кислотой [40] может быть получен при рН 6.0. Так как в структуре ХЗ на одно пиранозное кольцо приходится одна аминогруппа, обладающая свойствами слабого основания, а в структуре гиалуроновой кислоты - на два пиранозных кольца приходится одна карбоксигруппа со свойствами слабой кислоты (число аминогрупп не эквивалентно числу карбоксильных групп), вследствие сгерических затруднений пиранозных колец, в условиях более низких значений рН, возможно отклонение системы от стехиометрии [40]. В отличие от гиалуроновой кислоты, в молекуле гепарина на два пиранозных кольца приходится две группы -SO3H с сильнокислотными свойствами и одна слабокислотная группа -СООН, вследствие чего, при взаимодействии с ХЗ при низких рН, наблюдали соответствие расчетных и экспериментальных данных образующихся систем [41]. Следует отметить работу [44], рассматривающую образование ПЭК между гепарином, хондроитинсульфатом А, хондроитинсульфатом С с "N-ацилированными производными ХЗ с различной степенью замещения - N-бензоилхитозаном, N-миристоилхитозаном, N-пропаноилхитозаном и т.д. Процесс комплексообразования исследовали турбидиметрическим методом. Было замечено, что с ростом степени ацилирования ХЗ увеличивалось значение максимальной мутности системы, которое, после выдерживания системы в течение 24 ч, снижалось до минимума, вследствие выпадения ПЭК в осадок. Было показано, что при рН 2.8 и 4 5 возможно образование стехиометрических ПЭК между хондроитинсульфатами (А и С) с ХЗ и N-бензоилхитозаном. В работах французских авторов [42, 43] рассматриваются физико-химические аспекты взаимодействия высоко дезацетшшрованных образцов ХЗ (СД 98%) с хондроитин-4- и 6-сульфатами (55 и 70% сульфогрупп, 45.5 Ша и 90% сульфогрупп, 59 kDa, соответственно) и гиалуроновой кислотой. Как и ожидалось, полнота электростатического взаимодействия зависела от степени ионизации комплексующихся полимеров, природы ионогенных групп, плотности зарядов. В случае формирования ПЭК ХЗ с хондроитин-4- и 6-сульфатом, наблюдали независимость результатов от положения сульфогруппы в звеньях полисахарида. При смешивании солевой (натриевой) формы хондроитинсульфата с ХЗ, максимум преципитации наблюдали при молярном соотношении (р) остатков глюкозамина к остаткам сульфо- и карбоксильных групп р=1. Полученные данные согласовывались с ранее опубликованными работами [40, 41]. В случае использования кислой формы хондроитинсульфата, точку эквивалентности наблюдали при р=0.75 - в данной области все аммонийные сайты ХЗ образовывали ионную связь со всеми сульфогруппами хондроитинсульфата, находящимися в полностью диссоциированном состоянии, и, только с половиной карбоксильных групп Комплексообразование ХЗ с солевой и кислой формами гиалуроновой кислоты, характеризовалось формированием ПЭК состава 1/1 в обоих случаях [42].
Изучение влияния СД ХЗ на устойчивость получаемых комплексов с гиалуронатом показало, что с ростом СД (плотности заряда) стабильность ПЭК увеличивалась, и возрастала кооперативность электростатического взаимодействия [43]. В процессе образования ПЭК ХЗ с кислыми формами ГАГ индуцировалась депротонизация карбоксильных остатков полиэлектролитов, в зависимости от их рКа - частично, в случае хондроитинсульфата и полностью, в случае гиалуроновой кислоты, имеющей более низкое значение рКл.[42]. Порядок добавления полиэлектролитов не оказывал влияния на образующиеся поликомплексы. Прочные и стабильные в широком диапазоне рН и ионных сил ПЭК были получены при взаимодействии ХЗ с ГАГ как в кислой, так и в солевой формах. Авторы отмечали неравновесный характер комплексообразования полисахаридов, протекающего исключительно по механизму электростатического связывания. Биоматериалы на основе таких биодеградируемых полимеров, как хитозан и ГАГ, обладают интересными биологическими свойствами: они цитосовместимы, могут стимулировать процессы ранозаживления, индуцировать пролиферацию клеток для восстановления хрящевой, кожной ткани и т.д. В частности, в работах [37, 45] были изучены гидролиз комплексов специфическими ферментами (хондроитиназой, гиалуронидазой), цитосовместимость биоматериалов на основе ХЗ и ГАГ по отношению к кератиноцитам и хондроцитам. Было показано, что ХЗ в ПЭК оказывает протекторное действие против гидролитического расщепления ГАГ. Однако авторы отмечают, что ХЗ показал лучшие результаты в экспериментах по исследованию клеточной адгезии и пролиферации, а также в серии экспериментов in vivo, где была продемонстрирована его большая, по сравнению с ПЭК ХЗ-ГАГ, эффективность в процессах ранозаживления Ученые из Кореи показали, чго пленки ПЭК ХЗ/гиалуроновая кислота в растворах NaCl могли обратимо изменять свою форму под влиянием электрического поля [46], при этом угол
Получение аффинных сорбентов лектина зародышей пшеницы
К 20 мл 2%-ого раствора хитозана (20 г/л) в 2%-ной уксусной кислоте добавляли при перемешивании эквимольное количество водного раствора сополимеров малеиновой кислоты при рН 4.0-5.0. Выпавший в ходе перемешивания ПЭК отделяли от раствора центрифугированием в течение 20 мин при 15000 об/мин, а затем промывали на фильтре Шотга сначала водой, а затем ацетоном. Далее осадок сушили в вакууме водоструйным насосом до постоянного веса. Полученные ПЭК измельчали до размера частиц O.l-l.O мм. С целью улучшения эксплутационных характеристик сорбентов получали сферически гранулированную форму сорбента ВПМК-ХЗгріШ. с размером частиц 0.03-0. Ю мм. Для этого 0.5 мл 2.2 М водного раствора ВПМК встряхивали с 11.3 мл 2.5%-ного водного раствора хлоргидрата хитозана (рН 1) в течение 0.5 мин с последующим приливанием смеси при перемешивании к полиэтилсилоксановой жидкости (ПЭС-5).
Суспензию перемешивали 2 ч при 50С, затем охлаждали до комнатной температуры, после чего нейтрализовали реакционную смесь добавлением при перемешивании 1.1 мл 1М раствора NaHCCb. и оставляли на 12 ч без перемешивания. Далее декантировали надосадочную жидкость. К остатку прибавляли 100 мл ацетона, перемешивали, полученные светло-желтые сферические гранулы отфильтровывали, промывали водой до нейтрального рЫ, затем ацетоном и высушивали. Выход сорбента ВПМК-ХЗгран составил 0.375 г. (70.5 %мас.) С целью предотвращения возможности деструкции сорбентов при рН 10 и рН 2, ионно сшитые ПЭК переводили в полностью нерастворимую форму, высушивая в течение 3 часов при 110С в присутствии водоотнимающего агента (Р2О5) в вакууме водоструйного насоса-таким образом, получали ковалентно сшитые сорбенты хитозана (КСХ). Ковалентно сшитые аффинные сорбенты на основе хитина (XT) (сшитый хитин, КСХТ) получали ацетилированием ПЭК хитозана, синтезированных по п. 2.4.1. Для получения, например, сорбента СМК-ХТ 0.121 г ПЭК СМК-ХЗ помещали в 3 мл смеси уксусный ангидрид : 3 %-ная уксусная кислота : метанол (1:5:10 об./об.) и перемешивали 24 ч при комнатной температуре. Затем полимер отфильтровывали, промывали 3%-ной уксусной кислотой, водой (до нейтральной реакции промывных вод), ацетоном. Далее сорбент высушивали в вакууме с помощью водоструйного насоса (20-30 мм рт. ст.) при 110С над Р2О5 в течение 3 ч. Выход сорбента составил 0.119 г (98 3 % мае). К раствору 4 г ВПМА в 8 мл ДМФА при перемешивании добавляли раствор 2.64 г п-нитроанилина в смеси 2 мл ДМФА и 2.7 мл триэтлламина. Реакционную смесь перемешивали Зч при 100—110С; после охлаждения реакционной системы добавляли 5-ти кратный избыток ацетона, выпавший продукт отфильтровывали, непрореагировавший п-нитроанилин отмывали многократной экстракцией ацетоном.
Полученный осадок растворяли в воде, диализовали против воды, а затем лиофильно высушивали. Получали нитроанилид сополимера ./V-винилпирролидона с малеиновой кислотой (НАВПМК, сополимер /V-винилпирролидона-[7У-(4-нитрофенил)]-моноамида малеиновой кислоты, рис. 3) с выходом: 4.7 г (70.8%). Степень замещения - 26.6% мол. Гомогенность нитроанилида ВПМК и степень замещения полимера нитроанилином оценивали с помощью метода количественной тонкослойной хроматографии (КТСХ) на пластинках «Sorbfil» (Россия) и «Merck» (Германия) с использованием сканирующей приставки к спектрофотометру Hitachi-557 (Япония) или денситометра «Sorbfil» (ООО «Машиностроитель», Россия). В качестве элюента использовали систему ацетон/толуол/уксусная киелота/гексан= 1/1/0.1/0.1 об./об. По данным КТСХ продукт реакции имел показатель RfM).34. Состав ПЭК определяли при помощи нескольких методов: A) элементного анализа. ПЭК; Б) анализа содержания аминогрупп ХЗ в ПЭК методом обратного титрования с использованием рН-метра фирмы «Fisher Scientific» (США); B) анализа содержания в растворимой фракции ПЭК меченого нитроанилином сополимера Лг-винилпирролидона с малеиновой кислотой (НАВПМК). Кроме того, для определения состава ПЭК проводили гидролиз образцов (2-3 мг) 4н. раствором НС1 (2 мл) в стеклянных ампулах, заполненных инертным газом (азотом), в течение 8ч при 120С с последующим упариванием в вакууме. Глюкозамип (продукт гидролиза хитозана, входящего в состав ПЭК) определяли с применением трех методов: Г) метода определения гексозаминов Эльсона-Моргана [149]; Д) метода количественной тонкослойной хроматографии на стеклянных пластинах «Merck» (Германия) с использованием сканирующей приставки к спектрофотометру Hitachi-557 (Япония) или денситометра «Sorbfil» (ООО «Машиностроитель», Россия) восходящим способом в системах элюентов изопропанол : аммиак = 7 3 или бутанол : уксусная кислота : вода = 4 : 1 : 1 с последующим проявлением нингидрином. В качестве свидетеля использовали глюкозамин (Fluka, Швейцария). Хроматограммы количественно оценивали с применением программного пакета ЗАО «Сорбполимер», прилагающегося к денситометру «Sorbfil»; Е) проводили анализ гпдролизатов на углеводном анализаторе «Biotronik» (Германия)
Модификация поверхности различных материалов бислойными и мультислойными полиэлектролитными покрытиями
Для иммобилизации бислойных покрытий использовали полиэтилен и полистирол (ПЭ/ПС), а также металлические пластины из нержавеющей стали марки 12Х18Н9 (ГОСТ 5632-72). Пленки (ЗОх Ю0 мм, толщиной 0.1 мм) и трубки (d = 2.6 мм, L = 70 мм) из ПЭ/ПС и 96-луночные полистирольные планшеты, а также металлические пластины (10x10 мм) модифицировали: I) хитозаном; II) амфифилыгым хитозаном (АХЗ); III) человеческим сывороточным альбумином (ЧСА) (материалы, модифицированные ЧСА, были предоставлены лабораторией химии и технологии материалов для сердечно-сосудистой хирургии (рук. Новикова СП.) Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН). Для I варианта перед размещением защитных слоев проводили предмодификацию подложки окислением [152], таким образом, получая гидрофильный полиэтилен (ГПЭ) или полистирол (ГПС). По II варианту модифицировали исходные поверхности материалов АХЗ с содержанием додецинилсукциноильных групп 5% мол. Бислойное покрытие (БП) представляло собой полиэлектролитный комплекс, состоящий из внутреннего слоя - ХЗ, АХЗ или ЧСА, и наружного слоя - аффинного полимера (АП) или немодифицированного сополимера ВПМК, используемого в качестве модели наружного слоя в БП для рутинных исследований. Для I, II вариантов модификации образцы пленок/трубок помещали в 0.2 %растворы ХЗ или АХЗ в СНзСООН (0.2%) на 30 мин. После высушивания, материалы промывали дистиллированной водой и высушивали при комнатной температуре.
Для иммобилизации внешнего биоспецифического слоя (І-Ш) материалы инкубировали в 0.1 или 0.01М растворах аффинных полимеров или ВПМК (при значениях рН 5, 7, 11) в течение 3 ч при комнатной температуре. Адсорбцию полимеров оценивали гравиметрически и спектрофотометрически. После инкубации модифицированные поверхности высушивали, десорбировали несвязанный полимер в дистиллированной воде, и снова высушивали. Кинетику десорбции полимерных слоев изучали спектрофотометрически (210 пм). Мультислойное покрытие (МП) получали трехкратным чередованием внутреннего и наружного слоев. Для сравнения, модифицировали ГПЭ/ГПС только аффинными полимерами (без промежуточных слоев полимеров) Свойства поверхностей ПЭ пленок, нативных и модифицированных хитозаном, амфифильным хитозаном, альбумином, ВПМК (в качестве модели аффинного (наружного) слоя би- и мультислойных полимерных покрытий), а также их комплексами, изучали методами ИК-спектроскопип многократного нарушенного полного внутреннего отражения (МНПВО), атомной силовой микроскопии (АСМ), рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС), а также гониометрии. ИК-спектры МНПВО получали на Фурье-спектрометре "Nicolet Magna" IR-720 (США). Краевые углы смачивания исследуемых поверхностей определяли при помощи гониометра Rame-Hart-100 (USA) при 25С через 15 с после нанесения капли депонизованной воды (3 мкл) на поверхность пленок. Дпя каждого образца было проведено 10 параллельных измерений. Достоверность экспериментальных данных оценивали с использованием t-распределения Стыодента (Р=0.05). Элементный состав покрытия пленок и энергию связи электронов исследовали методом РФЭС на РФЭ спектрометре XSAM-800 ("Kratos Analytical Ltd.", UK) in vacuo 10"7 - 10"8 Па. В качестве возбуждающего излучения использовали характеристическую линию MgKa (энергия фотонов hu=l253.6 эВ). Мощность рентгеновской пушки не превышала 90 Вт (15 кВ, 6 мА). Анализировали поверхностный слой толщиной до 50А, углы анализа составляли 35 и 90. Калибровка шкалы энергии связи производилась относительно линии Cls (285.0 eV). Морфологию поверхности образцов исследовали с помощью атомно-силового микроскопа "Фемтоскан-онлайн" (Центр перспективных технологий, Москва); полученные данные обрабатывали при помощи специализированного программного пакета "Фемтоскан-онлайн". Измерения проводили в режиме прерывистого контакта, так как предварительные измерения в контактном режиме давали изображения значительно худшего качества, происходило разрушение образца. В качестве зондов использовали коммерческие кремниевые кантилеверы: модель NSG11S, типичная жесткость микроконсоли 11.5 Н/м. Изображения 512x512 пикселей были получены при скорости сканирования 0.5-1.0 Гц. Эксперимент проводили на однократно и многократно (МП) модифицированных бислойными покрытиями (БП) полистирольных плашках с использованием раствора плазминогена-стапдарта (для БП) и цитратной донорской плазмы (для МП). Количество адсорбированных (иммобилизованных) полимеров АП-І и АП-П, несущих специфический лиганд, было одинаковым при одинаковых условиях сорбции. АП-І и АП-П различались по содержанию специфического лиганда. Результаты измерений активности плазмина для исследуемых материалов были соотнесены с контролем и представлены в табл. 13. По приведенной выше методике (см. п. 2.10.) модифицировали поверхность лунок полистирольных микропланшет (за исключением контрольных) бислойными или многослойными покрытиями (площадь модифицированной поверхности лунки составляла 0.28 см2).
В каждую лунку добавляли по 250 мкл 0,1 М Трис-HCl буфера (0.15 М NaCl, рН 7.4) и инкубировали в течение суток при 4 С Затем буфер удаляли и наносили в лунки по 200 мкл раствора 2 мкМ плазминогена в буфере или цитратную плазму. После 3-х часов инкубации при комнатной температуре раствор плазминогена (или плазму) удаляли и лунки трижды промывали 0.05 М Трис-HCl буфером, содержащим 0.15 М NaCl (рН 8.3) для удаления не связанного белка. Далее в каждую лунку помещали по 200 мкл раствора 50 IU/ml урокиназы (UK) и выдерживали 30 мин при комнатной температуре (для полного превращения плазминогена в плазмин). После удаления раствора UK лунки трижды промывали 0.05 М Трис-НС! буфером (0.15 М NaCl рН 8.3). Затем в лунки добавляли по 200 мкл 0.6 мМ раствора субстрата плазмина H,D-Val-Leu-Lys-pNA (S-2251) в том же буфере и регистрировали увеличение оптической плотности при 405 нм через каждые 60 сек в течение часа при комнатной температуре. Из тангенсов углов наклона кривых А405 - t вычисляли скорости гидролиза субстрата плазмином. Концентрацию сорбированного плазмина определяли по калибровочной зависимости скорости гидролиза субстрата от концентрации
Получение сорбентов на основе полиэлектролитных комплексов
Выявление основных закономерное гей образования ПЭК и изучение их свойств, позволили нам разработать ряд методических подходов для их практической реализации. На основе НПЭК, в частности, были получены сорбенты для ионообменной и аффинной хроматографии, а также биоспецифические сорбенты плазминогена. Для получения сорбентов-анионитов нерастворимые ПЭК с некомпенсированным положительным зарядом (обогащенные хитозаном), представляющие собой фактически нековалентно (ионно сшитый) хитозан, переводили в ковалентно сшитые "жестким" высушиванием в вакууме в присутствии водоотннмающего агента (Р2О5). При этом в ИК-спектрах возрастала интенсивность амидных полос 1669-1639 (амид I) и 1570-1557 (амид II). Обработанный таким образом сорбент представлял собой слабоосновный анионит, устойчивый и, в отличие от хитозана, набухающий в водных средах в широком диапазоне рН.
В табл. 7 приведены значения равновесной набухаемости таких сорбентов в бессолевых системах. Предложенная схема синтеза ионнтов позволяет получать помимо анионообменных, и амфотерные материалы в цвиттерионной форме, путем изменения концентрации и соотношения исходных компонентов в ПЭК. Такие ионообменники обладают достаточно высокой обменной емкостью и могут быть использованы, в частности, для анализа и очистки пищевых продуктов и фармакологических препаратов, так как их получают в отсутствии органических растворителей и конденсирующих агентов. Выделенные НПЭК, обогащенные хитозаном (представляющие собой ионно сшитый цепями СП хитозан, ИСХ), содержащие некоторое количество остатков УУ-ацетил-С-глюкозамина, могут быть использованы в качестве аффинных сорбентов для выделения и очистки лектина зародышей пшеницы (Wheat Germ Agglutinin, WGA), как сами по себе, так и после несложной модификации, направленной на улучшение свойств сорбентов. Лектин зародышей пшеницы - не содержащий углеводов белок, состоит из двух идентичных несвязанных ковалентно полипептидных цепей (протомеров), с молекулярной массой в интервале 17.5—24.0 kDa В молекуле WGA имеется четыре активных центра: два центра первого порядка, связывающих олигомеры ЛГ-ацетил--глюкозамина (2-ацетамидо-2-дезокси-)-глюкозы, D-GlcNAc) и терминальный остаток а-ацетилнейраминовой кислоты, и два центра второго порядка, имеющих меньшее сродство и только к олигомерам -GlcNAc [163, 164]. Агглютинин, в основном, извлекают из отходов мукомольной промышленности и применяют для выделения и идентификации олигосахаридов, фракционирования полисахаридов, гликопротеинов, некоторых типов клеток и т.д. [165-167]. Традиционно применяемые в аффинной хроматографии сорбенты (силикагель, сефароза, сферой) требуют химической модификации для использования в сорбции WGA. Кроме того, силикагель нестабилен в щелочных средах, а сефароза подвержена микробной деструкции; недостатком сферона является его значительная гидрофобность [168]. Для выделения и очистки WGA, специфическими лигандами для которого являются олигомеры D-GlcNAc, можно использовать, например, хитин (поли-Л -ацетил- -глюкозамин) или хитозан.
Однако жесткая кристаллическая структура полисахаридов препятствует эффективной сорбции WGA. Для улучшения их эксплуатационных свойств предпринимались, в частности, попытки получения сшитого хитина путем модификации хитозана глутаровым диальдегидом, дивинилсульфоном или сополимерами малеинового ангидрида с последующим ацетилированием аминогрупп звеньев глюкозамина [16, 147]. Полученные в данной работе нестехиометрические НПЭК, обогащенные хитозаном, подвергали дальнейшей модификации, направленной, в частности, на увеличение содержания в сорбенте специфических лигандов WGA - остатков -GlcNAc. Избирательное ацетилирование аминогрупп (как указывалось в экспериментальной части), которое приводило к превращению остатков D-глюкозамина хитозана в остатки .D-GlcNAc хитина (рис. 19), проводили после стадии термической обработки НПЭК и перехода ионной сшивки в ковалентную, вследствие образования межцепных амидных связей [145]. По данным ИК-спектроскопии в исследуемых образцах возрастала интенсивность полос ацетамидных групп 1669-1639 см"1 (амид I), 1570-1557 см"1 (амид II). Таким образом, в результате несложной модификации (рис. 19), из НПЭК получали сначала ковалентно сшитый хитозан (КСХ), а затем ковалентно сшитый хитин (КСХТ) — аффинный сорбент WGA. В результате такой модификации, сорбенты КСХТ теряли способность к деградации во всем диапазоне рН, при этом, как будет показано далее, улучшались биоспецифичеекпе свойства сорбентов. На основе ИСХ и КСХТ нами были получены сорбенты с размером частиц 0.1—1.0 мм (измельчением). При формировании ПЭК в системе вода-масло было возможно придание частицам сорбента сферической формы, таким образом, синтезировали сферически гранулированную форму сорбентов ВПМК-ХЗ, рам и ВПМК-ХТгран с размером частиц 0.03-0.10 мм. В отличие от хитозана и хитина, полученные аффинные сорбенты были более проницаемы для молекул белка, так как могли значительно набухать в водных средах при нейтральных рН, что отражалось на величине сорбции WGA (табл. 8). Они не растворялись в органических растворителях и были устойчивы в водной среде в широком диапазоне рН.
