Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 8
1.1. Фитополисахариды 8
1.2. Арабиногалактан древесины лиственницы 11
1.2.1. Получение арабиногалактана лиственницы 11
1.2.2. Структура арабино - 3,6 - галактана лиственницы 15
1.2.3. Состав арабиногалактана сибирской лиственницы 17
1.2.4. Свойства арабиногалактана лиственницы 18
1.2.5. Модификация арабиногалактана лиственницы 20
1.2.5.1. Сульфопроизводные арабиногалактана лиственницы 20
1.2.5.2. Взаимодействие арабиногалактана лиственницы с ионами металлов 21
1.2.6. Применение арабиногалактана лиственницы 22
1.2.6.1. Биологическая активность арабиногалактана лиственницы 23
1.2.6.2. Арабиногалактан - полимерная матрица для иммобилизации лекарственных средств 26
1.3. Деструкция полисахаридов 27
1.3.1. Химическая деструкция полисахаридов 27
1.3.2. Окислительная деструкция полисахаридов 31
1.3.2.1. Деструкция полисахаридов под действием пероксида водорода 31
1.3.2.2. Деструкция полисахаридов под действием озона 38
1.3.2.3. Окисление полисахаридов под действием персульфатов 42
Глава 2. Методическая часть 47
2.1. Характеристика исходных веществ и реагентов 47
2.2. Методика эксперимента 49
2.2.1. Деструкция арабиногалактана под действием пероксида водорода 49
2.2.2. Определение скорости поглощения кислорода на манометрической установке 49
2.2.3. Описание циркуляционной установки 51
2.3. Методы анализа 54
2.3.1. Определение кинематической вязкости растворов арабиногалактана 54
2.3.2. Определение характеристической вязкости растворов арабиногалактана 54
2.3.3. Определение содержания С, Н 54
2.3.4. Определение концентрации пероксида водорода 54
2.3.5. Алкалиметрическое определение кислоты 55
2.3.6. Спектральное определение продуктов деструкции 56
2.3.7. Определение содержания уроновых кислот по реакции Дише 56
2.3.8. Определение содержания галактозы 57
2.3.9. Определение содержания белка 58
2.3.10. Определение удельного угла вращения 59
Глава 3.Обсуждение результатов 60
3.1. Кинетика окисления и окислительной деструкции арабиногалактана 60
3.1.1. Окисление арабиногалактана под действием пероксида водорода 60
3.1.2. Окислительная деструкция арабиногалактана 92
3.1.3. Продукты окислительной деструкции арабиногалактана 96
3.1.4. Окисление арабиногалактана в присутствии персульфата калия 112
3.1.5. Изучение биологической активности продуктов окислительной деструкции арабиногалактана 122
Заключение 125
Выводы 127
Список литературы 128
- Сульфопроизводные арабиногалактана лиственницы
- Деструкция полисахаридов под действием пероксида водорода
- Определение скорости поглощения кислорода на манометрической установке
- Окисление арабиногалактана под действием пероксида водорода
Введение к работе
Актуальность. Природный полисахарид арабиногалактан (АГ), выделяемый водной экстракцией из древесины сибирской лиственницы (Larix sibirica), является объектом фундаментальных и прикладных исследований благодаря таким свойствам, как хорошая растворимость в воде, биологическая активность (арабиногалактан проявляет антикомплементарную, имму-номодуляторную, гастропротекторную и противоопухолевую активности) и экологическая чистота. Биологическая активность АГ напрямую связана с его структурой, которая в свою очередь зависит от природы растительного сырья, используемого для выделения полисахарида. В связи с этим основное внимание исследователи уделяют изучению взаимосвязи "структура - свойства" и поиску растительного сырья, позволяющему выделить биополимер с заданными свойствами. Перспективным направлением исследований химии углеводов является химическая модификация полисахаридов (в том числе окислительная), с целью придания им новых свойств и расширения областей использования.
Водорастворимые олигомеры природных полисахаридов (арабинога-лактаны, хитозан) рассматриваются в настоящее время в качестве перспективного экологически чистого сырья для изготовления лекарственных препаратов пролонгированного действия, а также в качестве добавок в пищевой и косметической промышленностях. В связи с этим, задача получения водорастворимых окисленных макромолекул и олигомеров арабиногалактана с использованием нетоксичных и легко удаляемых окислителей является актуальной.
Научно-обоснованный выбор оптимальных условий получения продуктов с заданными свойствами требует исследования кинетических закономерностей окисления биополимера в водной среде.
Исследование выполнено в соответствии с планом научно-исследовательских работ по теме "Дизайн полимеров с заданными молекулярными характеристиками путем каталитической полимеризации диенов и модификации природных полисахаридов" (Государственный регистрационный номер № 01.20.0013592), Фонда поддержки ведущих научных школ (гранты № 00-15-97322 и НШ - 728. 2003. 03), а также проекта УР 05.01.024 по научной программе "Фундаментальные исследования высшей школы в области естественных и гуманитарных наук. Университеты России".
Цель работы. Исследование закономерностей окислительной деструкции и окислительной функционализации арабиногалактана, изучение состава образующихся продуктов в зависимости от условий проведения процесса окисления АГ, определение биологической активности продуктов окисления АГ.
Научная новизна. Изучено влияние добавок комплексона (Трилона Б) и сульфата железа (II) на кинетические закономерности стадии инициирования, а также ингибирующее действие фенола на стадии обрыва радикального процесса окисления арабиногалактана под действием пероксида водорода и молекулярного кислорода. Определены порядки реакций по компонентам реакционной системы и активационные параметры разложения пероксисоеди-нений и образования кислот. Впервые показано, что состав образующихся продуктов зависит от стехиометрии соотношения реагентов. Методами ЯМР 13С, ]Н, ИК-спектроскопии проведена идентификация низкомолекулярных продуктов и функциональных групп, образующихся в макромолекулах и оли-гомерах окисленного арабиногалактана.
Впервые показано, что окисление арабиногалактана в водной среде в присутствии персульфата калия протекает по радикально-цепному механизму с квадратичным обрывом цепей
Показано, что окисленные полимерная и олигомерная фракции арабиногалактана проявляют более высокую биологическую (противоязвенную и
7 противовоспалительную) активность по сравнению с исходным полисахаридом.
Практическая значимость работы. Использованный в настоящей работе метод окислительной деструкции и функционализации арабиногалактана под действием экологически чистой окислительной системы (Н2О2 + Ог) позволяет получать биологически активные продукты, которые могут быть рекомендованы при создании лекарственных препаратов пролонгированного действия.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Школе -семинаре «Химическая экология». (Уфа, Баш ГУ. 2001г.), конференции «Молодые ученые Волго - Уральского региона на рубеже веков». (Уфа, 2001 г.), научно-практической конференции, посвященной 40-летию химического факультета БГУ " Химия и химическая технология. ". (Уфа, 2002 г.), IV Всероссийском научном семинаре и Молодежной научной школе "Химия и медицина" (Уфа, 2003 г.), I Всероссийской научной INTERNET-конференции "Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем". (Уфа, 2002 г.), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии. (Казань, 2003 г.), 2nd Workshop on polymer and biopolymer analysis, degradation and stabilisation (Alicante, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 5 статей.
Структура и объем работы. Работа изложена на 140 стр. машинописного текста, включает 41 рисунок, 26 таблиц и состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы (125 наименований).
Сульфопроизводные арабиногалактана лиственницы
Макромолекула арабиногалактана лиственницы сибирской полифункциональна. Каждое галактозное звено ее основной цепи содержит две, а концевые звенья и звенья боковых цепей - три незамещенные гидроксильные группы, причем последние являются вицинальными. Все они потенциально способны участвовать в химических реакциях, характерных для алифатической гидроксильной группы, и их активность будет определяться стереохи-мической доступностью.
Интерес к сульфопроизводным полисахаридов в значительной степени связан с поиском природных лекарственных препаратов антикоагулянтно-го действия - аналогов мукополисахарида гепарина. Так, синтезированы сульфопроизводные ксилана, хитозана, ксилоглюкана, которые проявляют антикоагулянтные свойства [37]. Так как антикоагулянтные свойства связывают с присутствием и количеством сульфогрупп, то задача получения максимального гепариноподобного эффекта связана с максимальной этерифика-цией гидроксильных групп полисахарида.
С целью введения сульфогрупп в макромолекулу арабиногалактана и сохранения целостности полимерной цепи сульфатирование осуществляли под действием систем: триоксид серы - пиридин [37], триоксид серы - хлор-сульфоновая кислота в безводной среде [38]. В последнем случае в зависимости от условий проведения реакции удалось ввести в макромолекулу арабиногалактана от 1,3 до 4,8 % серы, практически сохранив его молекулярную массу. Сульфоэфир арабиногалактана, содержащий 4,8 % серы, проявляет выраженное антикоагулянтное действие.
Серьезное внимание в настоящее время стали уделять лечебным и профилактическим препаратам, содержащим биогенные металлы и микроэлементы, поскольку было выявлено, что наличие того или иного металла в клетке имеет важное значение для ее жизнедеятельности. Арабиногалактан является привлекательным реагентом, поскольку не только допускает получение водорастворимых форм металлопроизводных, но и в силу своих мем-бранотропных свойств предполагает адресную их доставку.
Способность арабиногалактана к комплексообразованию с металлами проследили, исследуя реакцию его взаимодействия с солями меди и кобальта [39]. Образование комплексных соединений происходит в широком интервале рН 5,0 - 12,5. В случае реакции с ионами меди в зависимости от рН раствора образуется два вида комплексов. Согласно расчетам, процесс комплек-сообразования сопровождается выделением 2-х ионов водорода. Средняя ве-личина константы равновесия составила 2,7 10 [39]. В настоящее время разработаны методы получения железосодержащих производных некоторых полисахаридов, например хитина, биогелей, декстранов [40-42]. Они основаны на получении из солей железа в щелочной среде оксидов железа в присутствии полисахаридов.
Арабиногалактан в реакциях с солями железа (II и III) и никеля (II) проявляет свойства стабилизатора в отношении образующихся коллоидных частиц гидратированных оксидов, обеспечивая им водорастворимость [43, 44]. Рентгенодифракционным методом доказано, что ферроарабиногалактаны имеют аморфно-кристаллическую структуру. Их арабиногалактановая матрица остается в аморфном состоянии, а кристаллическая часть формируется микросфероидами (наночастицами) оксидов железа. Содержание железа в ферроарабиногалактанах варьирует в пределах 3,5 - 5,7 %.
Таким образом, химические свойства арабиногалактана в реакциях с солями металлов многогранны: арабиногалактан, с одной стороны, способен участвовать в процессах комплексообразования, проявляя свойства лиганда, с другой стороны, может выполнять функции стабилизатора коллоидных систем.
Синтезированный ферроарабиногалактан проявляет антианемическую активность. В опытах in vivo (на белых крысах), у которых была моделирована железодифицитная анемия, было показано, что лечение ферроарабино-галактаном приводит к нормализации количественных и качественных показателей системы эритроцитов и восполнению железа в организме [44]. Ферроарабиногалактан сохранил не только мембранотропную активность арабиногалактана, но и его иммуномодуляторные свойства. По иммуномодели-рующему воздействию ферроарабиногалактан в отдельных случаях превосходил арабиногалактан [44].
Деструкция полисахаридов под действием пероксида водорода
Пероксид водорода рассматривается в настоящее время как перспективный экологически чистый реагент для деструкции полисахаридов, отбелки и делигнификации целлюлозы. Пероксид водорода является компонентом окислительно-восстановительных систем, являющихся источниками свободных радикалов при инициировании свободнорадикальных процессов [97]. Разложение пероксида водорода в водной среде в зависимости от условий проведения реакции может протекать по радикально-цепному или ион-молекулярному механизмам. Инициирование пероксидом водорода радикально-цепного окисления кислородсодержащих органических веществ в отсутствие ионов металлов переменной валентности может протекать вследствие гомолиза Н2О2 по реакции (1.1) либо путем непосредственного взаимодействия пероксида водорода с органическим соединением [97]. Энергия активации гомолиза Н2О2 по реакции (1.1) близка к энергии разрыва связи О - О в пероксиде водорода (202 кДж/моль). В водной среде при достаточно низкой температуре она значительно ниже - порядка 84 кДж/моль. Снижение энергии активации может быть обусловлено образованием комплекса пероксида водорода с водой. При этом молекула Н2О2 участвует в образовании водородных связей как донор протона, в ней ослабляются связи Н - О и О - О, как это отмечено для гидропероксидов [97]. Инициирование окисления гидроксилсодержащих соединений пероксидом водорода, может включать реакции: Реакция (1.4) энергетически более выгодна, чем реакция (1.2), поэтому образование радикалов, скорее всего, происходит только по бимолекулярной реакции (1.4) [97]. Таким образом, энергия активации разложения пероксида водорода в присутствии воды и гидроксилсодержащих органических соединений может быть значительно ниже энергии разрыва О - О-связи в пероксиде водорода вследствие образования комплекса между Н202 и гидроксил-содержащими соединениями.
В присутствии ионов металлов переменной валентности образование гидроксильных радикалов происходит по реакции: Энергия активации этой реакции составляет 30 кДж/моль, что значительно меньше, чем энергия активации взаимодействия пероксида водорода с гидроксилсодержащими соединениями [98]. Поэтому в присутствии ионов металлов переменной валентности реакция (1.5) является доминирующей. Изучение кинетики процессов окисления органических соединений перокси-дом водорода показало, что наряду с образованием радикалов органических веществ при их взаимодействии с гидроксорадикалами и рекомбинацией радикалов при определенных условиях наблюдается индуцированный распад пероксида водорода под действием радикалов органических соединений. Перекись водорода не относится к специфическим окислителям и при достаточно жестких условиях окисления может привести к расщеплению углерод - углеродной связи и полному распаду молекулы полисахарида в целом, в частности целлюлозы [94]. В элементарном звене целлюлозы содержатся первичные и вторичные спиртовые группы, гликозидные связи и конечные альдегидные группы. Так как окисление целлюлозы перекисью водорода происходит в гетерогенной среде, то факторами, направляющими ход реакции, являются не только химическое строение молекул, но и пространственная конфигурация макромолекул в целом и их взаимное расположение, определяющее доступность отдельных участков цепи для проникновения окислителя. Общепринято считать, что пероксид водорода действует на целлюлозу только в сильно щелочных средах (8% NaOH) [94]. При этом происходит снижение вязкости медно-аммиачных растворов окисляемой целлюлозы. В [94] была проведена идентификация карбоксильных групп в оксицеллюлозах перекисного окисления в щелочной среде и установлено возрастание содержания СООН -групп. Механизм действия пероксида водорода полностью еще не выяснен.
Наибольшим признанием пользуется теория, согласно которой окисление органических веществ перекисью водорода в кислой среде инициируется реакцией между ионом Fe2+ и Н2О2 с образованием свободного гидроксильного радикала [94] по реакции (1.5). Далее реакция окисления развивается по цепному механизму с участием С-Н связей при гидроксильных группах целлюлозы. В нейтральной среде пероксид водорода обладает наименьшей окисляющей способностью. В щелочной среде пероксидом водорода окисляются такие соединения, которые почти не подвергаются ее действию в кислой среде, как бензоилмуравьиная кислота-СбН5 -СОСООН. Пероксид водорода в щелочной среде может взаимодействовать с органическими соединениями различным образом. В щелочной среде преобладает распад пероксида водорода по радикальному механизму с образованием кислорода [99,100]
Определение скорости поглощения кислорода на манометрической установке
Кинетический эксперимент проводили с помощью установки манометрической дифференциальной (УМД), позволяющей с высокой точностью измерять скорость поглощения/выделения кислорода. Измерительная часть УМД выполнена в виде двух идентичных половин, одна из которых служит эталоном для рабочей половины, что способствует снижению физических шумов. Динамика измерения давления фиксируется в виде аналогового сигнала на ленте самописца. Формула для расчета скорости поглощения кислорода. где: а - калибровочный коэффициент, равный 0,19 мм. рт. ст./мм смещения пера Ah - отклонение пера самописца, мм R=62,36 мм. рт. ст.»л/моль»К Т - температура эксперимента, К j - коэффициент Генри, равный 0,22 Vr- объем газовой фазы Уж - объем жидкой фазы At - время, с Кинетику выделения углекислого газа изучали на циркуляционной установке. Циркуляционная установка представляет собой замкнутую систему, в которой осуществляется циркуляция газообразных продуктов.
Установка позволяет идентифицировать и изучать кинетические закономерности образования летучих продуктов при окислении сложных эфиров и кетонов. Схема установки приведена на рисунке 2.3. 1 - реактор с холодильником и капилляром, вставленным через холодильник в реактор; 2 - U-образная трубка ловушка, заполненная осушителем; 3 - два газоотборника, соединенных последовательно с линией газоносителя; 4 - циркуляционный насос; 5 - ротаметр для контроля за скоростью циркуляции газов; 6 - четыреходовой кран для заполнения системы необходимым газом; 7 - высокотемпературный термостат, теплоноситель - силиконовое масло; 8 - терморегулятор; Кинематическую вязкость 6% водных растворов АГ определяли в капиллярных визкозиметрах с висячим уровнем при температуре 30 С: V=t-K, где К - постоянная вискозиметра, t - время истечения жидкости (сек.), V -кинематическая вязкость жидкости (мм /с). Характеристическую вязкость водных растворов АГ и его окисленных фракций измеряли при 30±1 С в вискозиметре Уббелоде с висячим уровнем. Для измерения характеристической вязкости использовали водные растворы АГ + 0,30 М NaCl. Значения характеристической вязкости рассчитывали методом двойной экстраполяции зависимостей гуд/с. к нулевой концентрации [112]. Элементный состав продуктов реакции определяли в лаборатории микроанализа по общепринятым методикам. В расчет брали средний результат из двух параллельных анализов. Ошибка эксперимента составляет Концентрацию пероксида водорода определяли йодометрически, согласно схеме
Окисление арабиногалактана под действием пероксида водорода
При нагревании водно-пероксидных растворов арабиногалактана в температурном интервале 60 - 95 С наблюдается расходование пероксида водорода и накопление карбоксильных групп (рис. 3.1). В качестве количественных параметров для исследования кинетических закономерностей окислительных превращений арабиногалактана мы использовали эффективную константу скорости расходования пероксисоединений и максимальную скорость накопления карбоксильных групп.
Изменение суммарной концентрации пероксида водорода и пероксид-ных продуктов окисления АГ во времени описывается уравнением реакции первого порядка: эффективная константа скорости расходования пероксисоединений; [-0-0-]о и [-0-0-]t - начальная и текущая суммарные концентрации пероксисоединений (Н2О2 + пероксидные продукты окисления АГ). Эффективную константу скорости расходования пероксисоединений (кЭф) находили путем трансформации кинетических кривых (рис. 3.1) в координатах уравнения (I). Как видно из рис. 3.1, в ходе окисления арабиногалактана накапливаются карбоксильные группы. Скорость накопления карбоксильных групп (VCOOH) изменяется во времени: после периода индукции наблюдается максимальное значение VCOOH, а затем скорость накопления -СООН падает (рис. 3.1). Для нахождения максимальной скорости VCOOH на начальной стадии процесса кинетические кривые накопления карбоксильных групп (которые отражают брутто-содержание кислот) подвергали полиномиальному анализу. При нагревании реакционной смеси с низкой концентрацией пероксида водорода ([НгОгІо = 0,01 моль/л) в интервале температур 70 - 90 С изменение концентрации пероксисоединений во времени (рис. 3.2) описывается уравнением реакции первого порядка.
Эффективную константу скорости расходования пероксисоединении в этих условиях также находили путем трансформации кинетических кривых в координатах уравнения (I). Эффективные константы скорости расходования пероксисоединении, вычисленные по данным рис. 3.2 с использованием уравнения (I), линейно зависят от температуры в аррениусовых координатах (рис. 3.3): При увеличении начальной концентрации пероксида водорода в 10 раз ([НгОгЬ = 0,1 моль/л) возрастает и скорость расходования пероксида (рис.3.4). Эффективные константы скорости расходования пероксисоединений, вычисленные по данным рис. 3.4 с использованием уравнения (I), линейно зависят от температуры в аррениусовых координатах (рис. 3.5): In кЭФ = (43+4,6) - (129,6±13,3) 103 /RT, (III) (R = 8,31 Дж/моль град; коэффициент корреляции 0,998) При дальнейшем увеличении концентрации пероксида водорода до 1,1 моль/л в системе "АГ + Н2О2 + НгО" существенно изменяются кинетические закономерности расходования пероксидов, что отражается на виде кинетических кривых (рис. 3.6). Так, при 85 - 95 С кинетические кривые линеаризуются в координатах уравнения (I) реакции первого порядка. При более низких температурах на начальной стадии реакции наблюдается возрастание концентрации пероксисоединений, а затем их расходование (рис. 3.6). Скорость накопления карбоксильных групп на начальной стадии также зависит от температуры (рис. 3.7). Как видно из рис. 3.7, период индукции накопления карбоксильных групп возрастает с понижением температуры эксперимента. Значения максимальных VCOOH, найденные из рис. 3.7, линейно зависят от температуры в аррениусовых координатах (рис. 3.8): Брутто-содержание кислот, найденное при практически полном расходе пероксисоединений (более 95 %) в системе "AT + Н2О + Н2О2 + CV, возрастает с увеличением начальной концентрации введенного пероксида водорода (табл. 3.1).
