Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1. Характеристика сил, действующих на биосистемы при криоконсервации 10
2. Критерии выбора защитных веществ-криопротекторов 22
3. Молекулярные аспекты крпопротекцпи биосистем . 29
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 37
4. Материалы и методы 37
5. Влияние концентрации и молекулярной массы на диэлектрические и гпдратацпонные свойства растворов крпопротекторов 47
6. Влияние крпопротекторов на структурное состояние сывороточного альбумина и иммуноглобулинов . 68
7. Влияние факторов криоконсерващш на структуру и свойства нативных иммуноглобулинов 80
Заключение 90
Выводы 96
Внедрение результатов исследований в практику . 97
Список литературы 98
Список сокращений 124
ПРИЯШЕНИЕ 125
1. Определение диэлектрических констант и резонаторным методом 125
2. Предельные ошибки измерения и tq$ . 129
3. Определение гидратации белков на основе диэлектрической проницаемости матричных систем 133
4. Определение размеров агрегатов белков по данным светорассеяния 137
- Характеристика сил, действующих на биосистемы при криоконсервации
- Критерии выбора защитных веществ-криопротекторов
- Влияние концентрации и молекулярной массы на диэлектрические и гпдратацпонные свойства растворов крпопротекторов
Введение к работе
В настоящее время уровень молекулярных основ крпо-бпологпп - наукп, изучащей проблег.ш сохранения жпзнеспс-собных бпосистегл под действием низких тегшератур, ~ еще недостаточен для объяснения совокупности процессов, приводящих как к повреждениям,, так и крпозащпте, и требует более детального анализа с позиций физико-химической биологии.
Успехи в области хранения биообъектов при температуре -196С позволили по-новому подойти к вопросу о роли воды в живых системах и предложить методы повышения выживаемости /1,219/. Общепринято /8,61/, что выливание крпокон-сервированных биообъектов обычно зависит от двух факторов: температурного - возможности контролировать скорости замораживания - отогрева и от специфической обработки биообъектов, по крайней мере, одним химическим агентом - крпопро-тектором.
Традиционный подход к вопросу крпоконсервацпи биообъектов - снижение повреждающего действия кристаллов льда и обусловленный этим фактором выбор антифризов и скоростей замораживания - отогрева /179,30/ - в настоящее время претерпевает значительный поворот в сторону количественных фпзпко-хпмпческпх параметров, характеризующих процессы крпоконсервацип. Основная заслуга в этом направлении принадлежит крпобиохимпп - наукп, изучающей влияние низких температур на реакционную способность биосистем при условии компенсации физико-химических параметров среды к их значениям в нормальных условиях /24/. Исследования в этом направленпп дают криобиологии очень вапную информацию о прямом действии низкой температуры на кинетические параметры ферментативных процессов в бпоспстеглах /47,73/.
Существующая на сегодняшпії день практика крпокон-сервацпи биообъектов базируется не на точных количественных фпзпко-хпмпческпх параметрах среды консервации как до, так и после охлагдения - отогрева, а на эмпирически подобранных концентрациях крпопротекторов и скоростей заморагл-вания - отогрева.
В общих чертах, физико-химический анализ процессов, происходящих при крпокопсервацнп доляен включать: а) явления, обусловленные взаимодействием бпоспстемы с водным раствором крпопротектора, в общем плане это касается поведения бпоструктур в смешанном растворителе; б) поведение биоспстем, обусловленное сшшенпем температуры до образования льда; в) механо-фпзпческпе Еффэкты, обусловленные кристаллообразованием среды.
Как показывает анализ литературных данных, большинство авторов /94,88,185/, обсугдая возмопные механизмы крпозащпты и крпоповрегденля бпоструктур различного уровня организации, не рассматривают исходное состояние этих структур перед охлаждением, обусловленное контактами со средой с измененными параметрами. К таким параметрам среды, имеющим первостепенное значение в поддержании структурной целостности и функциональной активности биоспстем, следует отнести: диэлектрическую проницаемость среды, дсфильность молекул крпопротекторов (наличие гидрофобных и гидрофильных групп), растворимость молекул крпопротекторов, соотношение свободной и связанной воды в іфпопротектирующей ере- де, активность понов в растворах криопротекторов, кислотно-основной баланс п рН-зависимость в среде.
Биофизический подход к анализу процессов взаимодействии бпоснстем в среде с измененными параметраі.ш основы-вается на привлечении таких вакнейшпх физико-химических характеристиках, как водородные, электростатические и гидрофобные взаимодействия /48,110/.
Учитывая большой прогресс в понимании поведения изолированных белковых структур в смешанных растворителях /13, 52,63,34/, мы поставили перед собой цель провести исследование стабильности подобных систем для некоторых криопротекторов с учетом измененных параметров среды.
Известно /90/, что стабильное состояние белковой глобулы зависит от сил меплолекулярных электростатических взаимодействий в растворе. Исследования диэлектрических свойств среды в микроволновом диапазоне позволяют получать информацию о характере сил, действующих на включения среды, о гидратации ионов и макромолекул. Так как вещества, применяемые в криобиологии (криопротекторы), изменяют диэлектрическую проницаемость среды, то, очевидно, что бпоспстемы, находящиеся в контакте с ними, будут изменять своп физико-химические свойства. Пошшешіе тегшературы, в свою очередь, таїше изменяет шпзпко-хшлпческпе параметры среды, что, по-видимому, долзшо сказываться на структурно-шуітщіональїшх свойствах биообъектов.
Влияние криопротекторов на молекулярном уровне биообъектов во многом остается неисследованной областью криобиологии /213,220/. Предполагая, что криопротекторы могут влиять на структуру бпомакромолекул путем непосредственно- _ 6 - го взаимодействия плп в результате изменения свойств растворителя /33/, мы модем по изучению такого интегрального параметра, как количество связанной воды биополимером, оценить возможность этих взаимодействий.
Определение корреляции мепду изменением как осповных параметров среды, так и уровня структурно-функциональных свойств бпосистем является для криобиологии основной проблемой в развитии теоретических представлений о молекулярных механизмах крпозащпты.
В связи с вышесказанным, целью настоящей работы явилось изучение структурных изменений глобулярных белков под действием крпопротекторов и заморашгванпя - отогрева.
В работе были поставлены задачи исследовать: диэлектрические и гпдратационные свойства крпопротекторов в зависимости от молекулярной массы и концентрации; влияние глубокого заморашванпя на спектроскопические свойства глобулярных белісов; влияние крпопротекторов на мпкроокрупенпе и гидратацию изолированных белков; влияние факторов крпокон-сервацпи на гидратацию и специфическую активность натпвных иммуноглобулинов.
В качестве объекта исследования были выбраны такие глобулярные белки, как альбумин и иммуноглобулины, которые обладают не только специфической структурой, но и функциональными особенностями в организме.
Сывороточный альбумин - крупный мономерный белок, состоящий из трех функциональных доменов в одной полппеп-тпдной цепи, - выполняет вашше транспортные функции, является "универсальным" комплексообразователем /55/. иммуноглобулин ( 3c$G ) ~ олпгомерный белок. Четыре полппеп- _ 7 - тндные цепп молекулы располояены такпм образом, что обра-зуіот трп большие области: две идентичные Fa8 - области, кадая из которых содержит антигеневязыващнй центр и одна Fc - область, участки которой ответственны за связывание комплемента, проникновение через мембраны и другие ванные функции.
Для определения диэлектрических параметров растворов крпопротекторов п биополимеров был использован метод диэлектрической радиоспектроскопии, являщпйся одним из наиболее чувствительных методов физико-химического исследования веществ /38,151,192/. Для характеристики структурного состояния и изменения в блпхайшеи окружении исследуемых глобулярных белков были использованы методы дифа»эренциаль-ной спектрофотометрпп, сольвентной пертурбационной дифференциальной спектроюотометрип и собственной флуоресценции белков /23,56,12/.
Экспериментальные исследования позволили охарактеризовать молекулярные взаимодействия как в криопротектпвных средах, так и в растворах белка под влиянием факторов крпо-консервацпп.
Впервые изучены диэлектрические свойства криопротектпвных растворов в микроволновом диапазоне, широком интервале концентраций п молекулярных весов, что позволило выявить процессы взаимодействия растворенных молекул крпопротекторов и воды, оценить степень гидратации крпопротекторов.
Показано, что меплолекулярные взаимодействия глобулярных белков претерпевают изменения после глубокого заморагл-ванпя до -196С.
Установлено, что добавление криопротекторов к натпв-ным растворагл глобулярных белков (сывороточный альбумин лошади, противостолбнячный Щ& -глобулин) вызывает изменение в количестве воды, входящей в гидратапионный слой этих белков.
Показано, что замораглванпе штатных противостолбнячных растворов /д -глобулинов до -196С приводит к потери некоторого количества связанной воды этими белками, а такие к снижению специфической активности.
Крпоконсервацпя и длительное хранение растворов натив-ных ЩЄ -глобулинов (сроком до 9лет) под защитой криопро-тектора полпэтпленглпколя не приводила к потере специфической активности и сольватацпонных свойств исследованных белков.
Практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные о влиянии криопротекторов на ближайшее окружение белков найдут применение в разработке теории крпозащиты биологических объектов. Определяемый диапазон изменения диэлектрических параметров (статическая диэлектрическая проницаемость) в пшрокой области концентраций крпопротекто-ров может слуглть в качестве критерия устойчивости биоструктур при изменении состава растворителя.
Основные положения, подлежащие защите.
Изменения диэлектрической прошщаемостп среды, обусловленные добавлением криопротекторов пли снижением температуры, влияют на межмолекулярные взаимодействия, стабилизирующие натпвную структуру глобулярных белков.
Крпопротекторы - полимеры модшщпруют ближайшее окружение белков и образуют солъватный комплекс, защищающий белковые системы от крподенатуращш и потерп специфической актпвностп.
Характеристика сил, действующих на биосистемы при криоконсервации
Исходя из физико-химических свойств крпопротекторов (дпфпльностп, наличии реакционных групп, поляризуемости, декремента диэлектрической проницаемости), а также процессов, наблюдаемых при охлаждении (обезвоживание, гпперкон-центрирование электролитов, изменение рН), следует выделить такие взаимодействия: водородные связи, гидрофобные и связывание воды которые имеют одно из основных значений в существовании стабильного состояния патпвной структуры био-маїфомолекул /49, 91,157/.
Водородные связи являются одним из факторов, стабилизирующих натпвную структуру биополимеров и определяющих пх пространственное строение. Вместе с тем вклад водородных связей в стабилизацию нативной пространственной структуры биополимера, по мнению /130/, невелик, поскольку выигрыш в свободной энергии переноса групп, образующих водородную связь, из растворителя - воды в интерьер макромолекулы мал. Это утверждение основывается, в частности, на экспериментальных результатах, полученных Кпотцем /175/ при измерении констант образования дилеров /И- метплацетампда в различных растворителях. Там же было показано методом ИКС, что в водном растворе димеров мочевины не образуется, хотя ранее считалось, что комплексы мочевины в водном окружении существуют, и этот факт использовался в качестве подтверждения возможности термодинамической выгодности образования пептидной водородной связи. Аналогичные отрицательные выводы о стабилизирующем характере пептидных водородных связей были получены при теоретическом рассмотрении переходов спираль-клубок в полпампнокпслотах.
В то яе время ряд авторов осторопно подходит к выводам, сделанным на основе модельных систем. Ламрн /41/ полагает, что система водородных связей в белке монет качественно отличаться от таковой в полипептиде. В работе /14/ авторы обращают вншланпе на то, что внутрп глобулы диэлектрическая проницаемость понижена. Проведенная шли оценка позволяет исключить влияние поляризации растворителя, обладающего высокой диэлектрической проницаемостью, на потенциал водородной связи, если она находится на расстоянии более 6,5 А от поверхности белковой глобулы. При этом перенос реагирующих групп из растворителя будет сопровождаться усилием электростатических взаимодействий в в2/-\ раз, где ,2. п / диэлектрические постоянные белка и раствора соответственно (для водного раствора примерно в 40 раз), в этом случае вклад водородных связей в стабилизацию пространственной структуры биополимера был бы значительным.
Критерии выбора защитных веществ-криопротекторов
Защитное действие крпопротекторов весьма тривиально с точки зрения эмпирического подхода к проблеме крпокон-сервацип п обусловлено эффектом снижения тег.гаературы замерзания бноспстемы под влиянием этих веществ.
Довольно схематично механизм крпоповреждения модно качественно представить следующим образом /64,70/: образование кристаллов льда вызывает механическое повреждение биоспстем и их обезвоживание. Обезвоживание в свою очередь является причиной увеличения ионной силы, т.е. увеличения концентрации электролитов в микроокруженпн бпоструктур, что приводит к диссоциации липопротеидных комплексов мембран клеток /44,129/ и, как следствие, к разрушению этих структур, изменению рН, повышению концентрации таких растворенных веществ как мочевина, газы, соли, вплоть до уровня токсичности. Вымерзание больших количеств воды может приводить к физическому контакту биоструктур и образованию между ними межмолекулярных связей /150,88/. Трудно объяснить, почему эти явления не происходят при замораживании среды, содержащей кршшротекторы /172,185/. Еще труднее, по-нашему мнению, объяснить биологическую инертность крпопротекторов в отношении их влияния на бноспстемы различного уровня организации на различных этапах крпоконсервированпя.
В то де время в криобиологии учитывается токсичность применяемого криопротектора для данной бноспстемы. Как было отмечено /8,97/, эффективность и токсичность различных веществ колеблется в зависимости от вида объекта. Считается, что существует два типа токсичных явлении: собственная токсичность соединения п неспецифпческая, связанная с криопро - 23 -текторогд вообще /131,1/.
Неспецпфпческая токсичность крпопротекторов связана с их концентрацией, температурой в момент воздействия и с продолжительноетыо действия. Как и следует ожидать, при увеличении концентрации крпопротекторов, увеличиваются и токсические воздействия. Увеличение времени действия крпопротекторов перед замораштанпем, а также, по-видимому, после оттаивания увеличивает вероятность токсической реакции при данной концентрации крпопротектора. Токсичность крпопротектора любой концентрации уменьшается при его применении при более низкой температуре /214/.
Неоднократно предприншлалпсь попытки объяснить, каким образом химические вещества могут действовать как криопро-текторы /8,172,185/. Такие теории предлагались для объяснения специфичности крпопротекторов - т.е., почему одни вещества оказывают защитное действие, а другие, им подобные, не оказывают такого действия.
По общепринятому мнению /219,98,214/, в криобиологических исследованиях используют два типа криопротективных веществ.
Влияние концентрации и молекулярной массы на диэлектрические и гпдратацпонные свойства растворов крпопротекторов
Изучена диэлектрическая проницаемость ( ) для водных растворов таких крпопротекторов: метанол, этиленгликоль, І-2-пропаднол, глицерин, дшлетплсульфоксид, сахароза, полпэтиленгликоль, полішинилпирролидон - нашедших широкое применение в крпоконсервацпп /97,103,202/.
В зависимости от степени окспэтшшровання, т.е. молекулярной массы, были исследованы диэлектрические параметры таких веществ, как окспэтилированного глицерина и оксиэти-лированного пентаэритрита. Диапазон изменения концентрации крпопротекторов в растворе выбирался с учетом их использования в практике крпоконсерващш /98/.
С целью облегчения интерпретации результатов диэлектрических измерений сгруппируем исследуемые крпопротекторы по такому параметру как молекулярная масса.
В первую группу отнесем крпопротекторы с молекулярной массой до 100. К этой группе относятся такие вещества: метанол, 1,2-пропандиол, этиленглпколь, дшлетплсульфоксид и глицерин (таблица 2).
Ко второй группе отнесем криопротекторы-полимеры: сахароза, ПЭГ, ОЭГ, ОЭПЭ и ПВЇЇ. Физико-химические свойства водных растворов этих полимеров наименее изучены, несмотря на то, что их использование в криопротекцпп биосистем нашло широкое применение /94,1,8/.
