Содержание к диссертации
Введение
Глава I Обзор литературы 9
1.1. Сепсис - общемедицинская проблема 9
1.2. Современное состояние проблемы в области изучения эндотоксинового шока 11
1.2.1. Структура бактериальных ЛПС 11
1.2.2. Этиология эндотоксинового шока 13
1.2.3. Рецепторы ЛПС 15
1.2.4. Медиаторы эндотоксинового шока 18
1.2.5. Влияние ЛПС на сердечно-сосудистую систему 20
1.2.6. Влияние ЛПС на систему гемостаза 27
1.2.7. Влияние ЛПС на биохимические параметры крови 28
1.3. Белки теплового шока 31
1.3.1 Структура, функции, протективная роль 31
1.3.2. Современное состояние проблемы изучения протективной функции белков теплового шока 34
1.3.3. БТШ и сердечно-сосудистая система 38
1.3.4. БТШиапоптоз 42
1.3.5. Перспективы использования системы БТШ в медицине 42
1.4. Антагонисты бактериальных эндотоксинов и их роль в защите от
сепсиса 43
Глава II Материалы и методы исследования 47
II. 1. Объект исследования 47
II.2. Методы исследования 47
П.2.1. Катетерная технология регистрации артериального давления и внутривенной инъекции препаратов 47
11.2.2.Хирургические процедуры: имплантация артериальных и венозных катетеров 48
И.2.3.Исследование параметров гемостаза 51
11.2А. Биохимические исследования 52
II.3. Протоколы исследований 52
П.4. Статистическая обработка результатов 56
Глава III Результаты и обсуждение 57
III. 1. Влияние экзогенного БТШ70 при его предварительном и последующем введении на физиологические эффекты эндотоксина из Esherichia coli 57
III. 1.1. Влияние на выживаемость животных 57
III. 1.2. Влияние на параметры гемостаза 58
III. 1.3. Влияние на параметры гемодинамики 61
III. 1.4. Влияние на биохимические параметры 64
111.2. Влияние экзогенного БТШ70 при его предварительном и последующем введении на физиологические эффекты эндотоксина из Salmonella typhimurium 68
Ш.2.1. Влияние на выживаемость животных 68
111.2.2. Влияние на параметры гемостаза 68
111.2.3. Влияние на параметры гемодинамики 70
111.2.4. Влияние на биохимические параметры 73
111.3. Превентивные эффекты ЛПС из Rhodobacter capsulatus на
физиологические эффекты эндотоксина из Salmonella typhimurium 76
111.3.1. Влияние на выживаемость животных 76
111.3.2. Влияние на параметры гемостаза 76
111.3.3. Влияние на параметры гемодинамики 79
111.3.4. Влияние на биохимические параметры 82
Заключение 85
Выводы 97
Список литературы 98
- Сепсис - общемедицинская проблема
- Современное состояние проблемы изучения протективной функции белков теплового шока
- Катетерная технология регистрации артериального давления и внутривенной инъекции препаратов
- Влияние экзогенного БТШ70 при его предварительном и последующем введении на физиологические эффекты эндотоксина из Esherichia coli
Введение к работе
Актуальность проблемы
В течение длительного времени сепсис остается проблемой медицинского, демографического и экономического значения, поскольку летальность по данным разных авторов может варьировать от 20% до 40%, а в случае развития инфекционно-токсического шока может достигать 80% (Martin et al., 2003; Белобородое, 1997). Согласно недавним литературным данным, в США и в странах Европы сепсис ежегодно развивается у 700000 пациентов, причем количество подтвержденных случаев увеличивается на 1,5 % в год (Angus, Wax, 2001; Riedermann et al., 2003).
Среди причин смертности населения США септицемия, осложненная эндотоксиновым шоком, стоит на 13-ом месте. Особо важное значение приобретают грамотрицательные инфекции в структуре внутрибольничных инфекций у детей и лиц пожилого возраста, а также у пациентов с соматическими заболеваниями. Экстремальные ситуации, стресс, физическое перенапряжение приводят к срыву адаптационных возможностей организма. Эти и другие причины в ослабленном организме приводят к генерализации процесса, крайним проявлением которого является эндотоксиновый шок. Установлено, что у 50% пациентов с сепсисом развивается септический шок, и половина из них погибает, несмотря на адекватное лечение антибиотиками и неотложную терапию (Dal Nogare, 1991).
Эндотоксин грамотрицательных бактерий способен убить человека и животных при очень низкой концентрации в крови - 1 нг/мл (Mayeux, 1997), действуя на разные клетки организма как непосредственно, так и опосредованно, через индукцию синтеза в клетках-мишенях биологически активных веществ. Специфические антитела к эндотоксину применяли в лечении септического шока в двойном слепом исследовании при внутримышечном введении антител новорожденным. Разницы между контрольной и группой новорожденных, получавших антитела, выявлено не
было (Румянцев и др., 1988). В связи с изложенным, поиск средств и методов защиты от эндотоксинового шока остается чрезвычайно актуальным.
Исследования действий эндотоксинов нашли отражение в эволюции патогенетической терапии бактериальных инфекций, начиная с применения сорбентов, связывающих эндотоксины, антител к эндотоксинам, ингибиторов синтеза простагландинов и других производных арахидоновой кислоты, блокирования медиаторов воспаления до вмешательства в механизмы нарушения гемостаза (Пак и др., 2003). Однако недавние клинические исследования, направленные на анализ снижения смертности пациентов от сепсиса в зависимости от применяемой терапии, показали практически отсутствие прогресса в лечении этого заболевания (Riedermann et al., 2003).
В последние годы после получения препаратов экзогенного белка теплового шока 70 кДа (БТШ70) - природного и рекомбинантного - возрос интерес к разработке новых лекарственных средств на основе БТШ70 для лечения различных заболеваний. Экспрессия белков теплового шока или стресс-белков является одним из ответов организма на воспаление (Маргулис, Гужова, 2000). В литературе имеются указания на то, что уровни экспрессии БТШ хорошо коррелируют с выживаемостью грызунов в модели эндотоксинового шока (Hotchkiss et al., 1993; Lappas et al., 1994). Эти наблюдения очень важны в клиническом отношении, поскольку могут быть использованы для создания препаратов предотвращающих развитие септического шока при грам-отрицательном сепсисе. В последнее десятилетие большое значение отводится изучению защитных свойств БТШ70. Однако эти исследования проведены в основном на клеточных культурах (Маргулис, Гужова, 2000; Guzhova et al., 1998; Guzhova et al., 2001). На сегодняшний день не вызывает сомнений тот факт, что исследование защитных свойств экзогенного БТШ70 против эндотоксинового шока in vivo представляют собой важный инструмент в оценке ответа целого организма на септическое воздействие и способствует развитию новых подходов к терапии сепсиса.
Еще одним из перспективных направлений в защите от грамотрицательной инфекции становятся природные антагонисты эндотоксинов или аналогичные им вещества, синтезированные химическим путем. В этой связи поиск исходно низкотоксичных липополисахаридов (ЛПС), обладающих свойствами антагонистов эндотоксинов имеет первостепенную значимость (Gangloff et al., 1999). Работы в этом направлении начались в 80-е годы, когда были выделены из фотосинтезирующих бактерий низкотоксичные липополисахариды (Qureshi et al., 1988, Krauss et al., 1989) и в экспериментах in vitro показана их способность конкурировать с эндотоксинами за рецепторы клеток-мишеней (Rietschel et al., 1994). К числу таких низкотоксичных липополисахаридов относится ЛПС из фотосинтезирующей бактерии Rhodobacter capsulatus (Rb. capsulatus). Проведенные ранее исследования на клеточных культурах показали способность защитного действия ЛПС из Rb. capsulatus от некоторых эффектов эндотоксинов (Грачев и др., 1998; Винокуров и др., 2003). Однако, исследования этого препарата in vivo на выявление его защитных свойств, ранее не проводились.
Цель работы
Целью данной работы являлось изучение влияния БТШ70 и ЛПС из Rb. capsulatus на физиологические эффекты эндотоксинов из Esherichia coli (Е. coli) и Salmonella typhimurium (S. typhimurium).
Задачи исследования
Исследовать влияние экзогенного БТШ70, в зависимости от способа его применения, на гибель животных, вызванную эндотоксинами из Е. coli и S. typhimurium.
Изучить действие экзогенного БТШ70 на вызванные эндотоксинами из Е. coli и S. typhimurium изменения параметров гемостаза.
3. Исследовать влияние экзогенного БТШ70 на вызванные
эндотоксинами из Е. coli и S. typhimurium изменения биохимических
параметров крови.
4. Изучить влияние ЛПС из Rb. capsulatus на физиологические эффекты
эндотоксина из S. typhimurium.
Научная новизна работы
Значительная часть результатов, представленных в данной работе, носит приоритетный характер. Впервые проведено исследование эффектов БТШ70 на животных in vivo. Показано, что БТШ70 при предварительном введении снижает смертность животных от шока, индуцированного разными эндотоксинами, отменяет эндотоксин-индуцибельное увеличение параметров гемостаза. В экспериментах in vivo на крысах впервые проведено исследование защитного действия антагониста эндотоксина низкотоксичного ЛПС из Rb. capsulatus. Показано, что предварительное введение низкотоксичного ЛПС из Rb. capsulatus снижает смертность животных от эндотоксинового шока, снижая его эффекты на организм.
Научно-практическое значение
Полученные результаты показывают, что БТШ70 и ЛПС из Rb. capsulatus могут быть рекомендованы для создания новых фармакологических препаратов для профилактики от эндотоксинов. Создание таких препаратов имеет важное социально-экономическое значение, поскольку они могут быть использованы не только как лечебное средство при эндотоксемии, но и в профилактических целях для предупреждения возникновения подобных осложнений.
Сепсис - общемедицинская проблема
Эндотоксины, или липополисахариды (ЛПС) являются главной структурной составляющей клеточной стенки грамотрицательных бактерий. При их делении или гибели ЛПС высвобождаются в виде свободных молекул или связанных с белками комплексов. Только в свободном состоянии они проявляют различные виды биологической активности и включаются в патогенез эндотоксинового шока. ЛПС индуцируют воспалительный ответ, который сопровождается набором патофизиологических изменений.
Кор (сравнительно большой олигосахарид - до 11 моносахаридных остатков) оказывает существенное влияние на проявление биологических свойств липида А. Благодаря присутствию в "коре" и липиде А отрицательно заряженных групп, ЛПС связывают на поверхности клетки катионы двухвалентных металлов, необходимых для стабилизации мембраны (Варбанец, 1994).
Токсической составляющей ЛПС является его гликолипидная часть, обозначаемая "липид А". Эта амфипатичная структура является главной компонентой внешнего лепестка липидного бислоя клеточной стенки. Липидный участок выполняет роль "якоря", связывающего ЛПС с клеточной оболочкой и является носителем его токсических свойств. Кроме того, липид А обладает адъювантной, митогенной активностью, стимулирует секрецию иммуноглобулинов и усиливает фагоцитоз, активируя комплемент и макрофаги. (Kuhn et al., 1988). Он содержит несколько длинных цепочек жирных кислот, соединенных амидными и эфирными связями с двумя глюкозаминными остатками. Эти глюкозаминные остатки соединены 3-1-6 связью и формируют костяк молекулы липида А. Заряженные фосфатные группы, привязанные к этому глюкозаминному костяку, вместе с гидрофобными группами жирных кислот вносят вклад в амфипатическую природу липида А. Именно липид А играет ключевую роль в патогенезе системной воспалительной реакции, являясь наиболее активным из всех известных стимуляторов продукции провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, фактора некроза опухолей).
В настоящее время лучше всего изучены патогенетические механизмы эндотоксинового шока, сопровождающие эндотоксемию (Bachetti et al., 2003; Lush et al., 2000; Laubach, 1998). Установлено, что эндотоксин грамотрицательных бактерий, который освобождается из клеточной стенки бактерий в процессе их деления или после гибели, выступает в качестве одного из основных инициаторов эндотоксинового шока. Действие эндотоксинов на организм человека носит сложный характер. Наибольший клинический интерес связан с влиянием эндотоксина на основные защитные системы организма, представленные иммунной системой, системой неспецифической резистентности и каскадом ферментов комплемента.
Упрощенная схема развития эндотоксинового шока представлена на рисунке 1.2.2.1.
Эндотоксиновый шок характеризуется рядом клинических симптомов, в том числе повреждением многих органов, включая ЦНС, сердце, ЖКТ, легкие и печень, снижением ответов на вазоконстрикторное действие различных агентов, нарушением кровоснабжения различных органов, приводящим к их недостаточности и генерализированным повреждениям разных тканей (Nasraway, 2003).
Вероятно, сердечно-сосудистые и метаболические нарушения в организме, наблюдаемые при септическом шоке, в значительной степени обусловлены влиянием на клетки этих органов и систем разнообразных цитокинов, образующихся при действии эндотоксина на клетки-мишени.
Введение низких доз эндотоксина (4 нг/кг) добровольцам сопровождалось увеличением в плазме содержания свободных молекул ФНО-а и возникновением различных симптомов, характерных для грамотрицательных инфекций (Pleiner et al, 2000). Описан случай терапевтического введения высоких доз эндотоксина Salmonella (1 мг) больному раком. При этом наблюдались все признаки септического шока, а также нарушения функций различных органов, в том числе сердечно-сосудистой системы (падение давления), диссеминированным внутрисосудистым свертыванием крови (ДВС-синдром), отеком легких (Николаев А. Ю., Милованов Ю.С., 1999).
Подавление образования N0 после введения эндотоксина сопровождается увеличением частоты клубочкового тромбоза, а также усилением повреждения кишечника и возрастанием сосудистой проницаемости. Очевидно, что для выяснения роли N0 в эндотоксическом шоке необходимо более детально знать тип N0 синтазы, участвующей в ответе клеток данного вида на эндотоксин, поскольку различные типы клеток могут обладать конститутивной или индуцибельной формой NOS.
Современное состояние проблемы изучения протективной функции белков теплового шока
Согласно современным представлениям повышенные уровни антител против БТШ можно обнаружить при большинстве воспалительных заболеваний (Van Eden, Young, 1996).
Эксперименты на животных показывают, что независимо от триггера, приводящего к воспалению, предварительная стимуляция иммунитета к собственному БТШ60, используя бактериальный БТШ60 или его консервативные пептиды, повышает резистентность к последующей индукции заболевания. Эти данные свидетельствуют о том, что Т-клеточное узнавание БТШ60, а также БТШ70 в области воспаления относится к контролю естественного ответа на воспаление, и стимуляция таких ответов обладает высоким терапевтическим потенциалом. Поэтому регуляция синтеза БТШ в организме рассматривается современной медициной одним из инструментов неспецифической стимуляции иммунитета при воспалительных процессах.
Наиболее исследованными являются представители семейства белков теплового шока, которые рассматриваются как молекулярные шапероны. Один из них - белок теплового шока (БТШ70), имеющий молекулярный вес 70 кДа, появляется в клетках после воздействия на них высокой температуры и является продуктом мультигенного семейства. Отдельные члены этого семейства (HSC70 и БТШ70) выявляются в цитоплазме. В настоящее время все большее внимание привлекает защитная функция БТШ70 при его экзогенном введении. Показано, например, что применение экзогенного БТШ70 увеличивает толерантность культуры нервных клеток к тепловому стрессу и стауроспорин-вызванному апоптозу (Guzhova et al., 2001). Полагают, что при нормальных условиях БТШ70 "работают" в клетках как молекулярные шапероны, функция которых заключается в фолдинге, формировании ансамблей белков или их разрушении, а также транслокации цитоплазматических белков. При стрессорных условиях БТШ70 способствует удалению из клетки денатурированных белков, что облегчает нормальное функционирование клеток. Протективное действие БТШ70 может быть обусловлено их способностью модифицировать активность кальций-зависимых калиевых каналов, как это наблюдалось при их экзогенном применении (Negulyaev et al., 1996).
За исключением нескольких попыток в изучении протективной функции БТШ70, защитные эффекты экзогенного БТШ70 не изучены. В экспериментах на переживающих срезах обонятельного участка коры головного мозга крыс впервые был обнаружен выход БТШ70 в экстраклеточное пространство из нервных клеткок при их электрической активации, индуцирующей развитие в них функциональных пластических процессов (долговременной посттетанической потенциации и депрессии) (Mokrushin, Plekhanov, 1997; Мокрушин, 2001). Появление БТШ70 во внеклеточном пространстве свидетельствует о том, что он может оказывать защитное действие не только на клетки-источники, но и на соседние нейроны в популяциях, подтверждением чему могут служить данные о секреции этих белков из глиальных клеток нейробластомы в экстраклеточное пространство (Guzhovaetal.,2001).
Будучи внутриклеточными белками, белки семейства БТШ70 осуществляют цитопротекторную функцию. Однако, в определенных условиях БТШ70 покидает клетки, например, в сыворотке крови практически здоровых людей содержание БТШ70 составляет 0-5 мкг/мл. При этом, судя по данным экспериментов на клеточных культурах, его защитные свойства сохраняются. Были, например, использованы различные способы введения препарата БТШ70 крысам, мышам, голубям. Введение экзогенного БТШ70 в cistema magna и интраназально оказало действие, приводящее к изменениям поведенческих реакций, напоминающим таковые при стрессе. Наоборот, в условиях психоэмоционального или физического стресса интраназальное введение БТШ70 уменьшало проявление стресс-реакции, судя по оценке поведенческих реакций и биохимическим показателям. Впервые установлено, что введение препарата БТШ70 в 3 желудочек мозга крысам и голубям увеличивает длительность сна и ускоряет восстановление сомато-вегетативных функций после стресса (Пастухов и др., 2005).
Массивная экспрессия белков теплового шока семейства 70 кДа в ответ на действие неблагоприятных факторов делает их основными участниками неспецифической защитной реакции клетки. Показано, что увеличение содержания в клетке БТШ70 является достаточным условием, чтобы повысить ее жизнеспособность при стрессе. Внутри клетки основной функцией БТШ70 является шаперонная. Однако наблюдение, что гипертермия приводит к уменьшению воспаления, позволило предположить В. Polla с соавторами существование связи БТШ70 с ограничением лихорадочной реакции (Polla et al., 1996). Впоследствии было показано, что между уровнем внутриклеточного БТШ70 и продукцией провоспалительных цитокинов существует обратная связь. Недавно было показано, в частности, что при адаптации человека к гипертермии наряду с увеличением содержания в мононуклеарах крови БТШ70, продукция IL-1 уменьшается. В последнее время уделяется внимание БТШ70, освобождаемому из клеток во внеклеточную среду. Так, в сыворотке крови практически здоровых лиц может обнаруживаться от 0 до 5 мкг/мл БТШ70. Попадая во внеклеточную среду, БТШ70 может поглощаться клетками в культуре и увеличивать их жизнеспособность, например, клетками нейробластомы, U935 (Гужова и др., 2001). Помимо цитопротекторного действия, была обнаружена способность внеклеточного БТШ70 взаимодействовать с Toll-like рецепторами на макрофагах, дендритных клетках, что приводит к активации продукции воспалительных цитокинов (Asea et al., 2000), то есть БТШ70 участвует в регуляции воспалительного ответа. Кроме того, внеклеточный БТШ70 может быть адъювантом для пептидов, участвовать в представлении антигена и, тем самым, способствовать формированию специфического иммунного ответа. Таким образом, БТШ70 является непременным участником формирования гуморального и клеточного иммунитета, а внутри- и внеклеточный БТШ70 выступает в двойственной роли регулятора (ограничителя или усилителя) воспалительного процесса.
Противовоспалительные эффекты БТШ70 в ЛПС-индуцированной активации Купферовых клеток исследовались в работе Sun с соавторами (Sun et al., 2005), которые изучали эффекты БТШ70 на ЛПС-индуцированную активацию Купферовых клеток и продукцию цитокинов. Показано, что БТШ-предобработка значительно ингибировала ЛПС-индуцированную продукцию цитокинов ФНО-а, IL-6 и экспрессию mRNA. ЛПС-индуцированная активация NF-kB и деградация IkBa ослаблялись БТШ. Увеличенная IkBa стабильность и повышенная регуляция экспрессии гена IkBa может быть одним из механизмов ингибирования ЛПС-индуцированной активации Купферовых клеток белками теплового шока (Sun et аі., 2005).
Исследования Chen с соавторами (Chen et аі., 2005), проведенные in vivo, показали защитные эффекты БТШ (индуцированного введением арсенита натрия) на повреждение печени, активацию NF-kB в клетках печени и экспрессию провоспалительных цитокинов, индуцированных эндотоксином. Предварительная индукция БТШ70 значительно ослабляла ЛПС-индуцибельные изменения в печени (гистологические), ингибировала активацию NF-kB в печени, деградацию IkBa, и снижала смертность. Экспрессия mRNA, кодирующей ФНО-a и IL-6 в печени, была значительно ниже у животных, предварительно обработанных арсенитом. Авторы этой работы полагают, что снижение эндотоксин-индуцибельной активации NF-kB в печени и последующей продукции провоспалительных цитокинов может быть одним из механизмов защитных эффектов БТШ70 (Chen et аі., 2005).
Катетерная технология регистрации артериального давления и внутривенной инъекции препаратов
Регистрацию АД и ЧСС осуществляли электроманометром «СР-01» (СТС, США) через катетер, имплантированный в брюшную аорту через бедренную артерию. Обработка сигнала производилась с помощью многоканальной системы «Beat» (Medvedev et al., 1990). При цифровой обработке сигнала АД получали параметры среднего артериального давления (СрАД) и ЧСС.
Изотонические растворы препаратов в экспериментах вводили через катетер, имплантированный в бедренную вену. Объем вводимых препаратов составлял 10 мкл/100 г массы тела для физиологического раствора и БТШ70, и 100 мкл/100 г массы тела для эндотоксинов и ЛПС из Rb. capsulatus. В работе использовали БТШ70, выделенный из мышцы быка. Раствор БТШ70 для введения животным готовили на физиологическом растворе.
Для изготовления катетеров использовали полиэтиленовые трубки разного диаметра, маркированные как РЕ-10 (наружный диаметр - 0,6 мм, внутренний - 0,3 мм) и РЕ-50 (наружный диаметр - 0,9 мм, внутренний - 0,6 мм). В отрезки трубок вставляли металлическую проволоку соответствующего диаметра для сохранения просвета трубок при их спайке горячим воздухом. Длина отрезков трубок определялась размерами животного. Артериальный катетер делался из отрезка трубки РЕ-50 длиной около 20 см, спаянного с более коротким (7 см) отрезком тонкой трубки, имеющим амортизационное кольцо. Катетер для внутривенных инъекций делался из отрезка тонкой трубки (РЕ-10) с амортизационным кольцом. После соединения трубок проверяли место спайки на герметичность. Для этого большую по диаметру трубку соединяли со шприцем, заполняли водой (спиртом), меньшую по диаметру трубку пережимали зажимом, на бранши которого были надеты резиновые трубки для предотвращения повреждения полиэтиленовых трубок; шприцем создавали в трубках давление: если из места спайки вода не вытекала, то приступали к изготовлению амортизационного кольца. Для этого участок трубки с меньшим диаметром, примыкающий к месту сварки, накручивали на металлическую (стеклянную) палочку диаметром 3-4 мм (один оборот) и помещали в кипящую воду на 10-15 сек, затем быстро охлаждали в стакане с холодной водой, после чего катетер был готов. Чтобы снизить возможность образования тромбов, поверхность катетеров обрабатывали раствором «SIGMACOTE» (Sigma, США) и сушили на воздухе (Мурашев и др., 1992).
Предоперационные процедуры. Все инструменты, используемые при операции, стерилизовали автоклавированием в течение 30 минут. Операционный стол обрабатывали 70% раствором этанола. В дальнейшем все процедуры проводили с соблюдением правил асептики. Перед операцией производили взвешивание животного. Затем проводили анестезию животного, используя хлоралгидрат (400 мг/кг) внутрибрюшинно. Внутрибрюшинные инъекции осуществляли инсулиновым шприцем с параметрами иглы 0,33/13 мм. Объем введения раствора наркоза составлял 200 мкл/100 г веса крысы.
После взвешивания животного рассчитывали объем введения в соответствии с необходимой дозой вещества (готовили раствор 20%-ной концентрации), учитывая максимальные объемы введений животным:
В шприц набирали необходимый объем раствора для введения. Животное фиксировали в левой руке за холку под углом 45 градусов головой вниз. Для проверки правильности попадания в брюшную полость проводили аспирацию - для этого тянули на себя поршень шприца. В случае правильного попадания в шприц при аспирации забирается воздух. В случае забора в шприц биологической жидкости (кровь, содержимое кишечника) брали новый шприц, заполняли раствором вещества и повторяли прокол заново. Раствор вводили равномерным нажатием на поршень шприца.
Операционная процедура по имплантации катетеров крысам в бедренную артерию и бедренную вену. После наркотизации животного подготавливали операционное поле. Сначала удаляли шерсть в межлопаточной области, поскольку в дальнейшем катетеры выводили в межлопаточную область. Затем подготавливали операционное поле в паховой области: удаляли шерсть, кожу обрабатывали 70%-ым раствором этанола. Делали разрез кожи и осторожно, не повреждая нерва, выделяли бедренную артерию и бедренную вену. Катетеры соединяли со шприцами с физиологическим раствором, заполняли катетеры раствором, следя за тем, чтобы в катетерах отсутствовали воздушные пузыри. Под вену подводили 2 лигатуры. На дистальной лигатуре делали свободную петлю и брали её в зажим, пережимая сосуд. Проксимальную лигатуру плотно завязывали и брали в зажим. В процессе работы избегали пересушивания операционного поля, периодически обрабатывая его физиологическим раствором. В участке сосуда между лигатурами, заполненном кровью, делали надрез в стенке сосуда. В образовавшееся отверстие вставляли бранши сосудистого пинцета, раздвигали их и между ними вставляли кончик катетера. Отпускали дистальную лигатуру, проталкивали катетер дальше по сосуду до амортизационного кольца, не прилагая при этом усилий. Крепко завязывали дистальную лигатуру. Концы всех лигатур отрезали. Катетер промывали физиологическим раствором в шприце, пережимали зажимом, на бранши которого надеты резиновые трубки, шприц отсоединяли, кончик катетера закрывали пробкой. Сняв зажим с катетера, пробку проталкивали ещё на 1-2 мм, чтобы во внутреннем конце катетера не оставалось крови, и весь катетер был заполнен физиологическим раствором. Катетер в бедренную артерию вставляли аналогично, с тем лишь отличием, что сначала перевязывали проксимальную лигатуру и натягивали её зажимом, а потом брали в зажим дистальную. Между последними помещали страховочную лигатуру, на которой делали свободную петлю. Катетеры фиксировали лигатурами к мышцам брюшной стенки. Катетеры выводили под кожей в межлопаточную область
Влияние экзогенного БТШ70 при его предварительном и последующем введении на физиологические эффекты эндотоксина из Esherichia coli
Эндотоксиновый шок остается одной из главных проблем, связанных с лечением инфекционных заболеваний (Martin et al., 2003). В настоящее время разрабатывается огромное количество фармакологических препаратов -потенциальных лекарств для лечения эндотоксинового шока, некоторые из которых уже есть на рынке. Действие многих из препаратов было направлено на специфические провоспалительные медиаторы и поэтому в целом оказалось неэффективным, так как процесс развития эндотоксинового шока включает широкое разнообразие медиаторов. Более успешная стратегия лечения направлена на конечную стадию сепсиса, а именно на изменённую коагуляцию. Однако клинические испытания подобных препаратов (Xigris) показали, что препарат не может применяться в клинике.
Весьма перспективной представляется альтернативная терапия, которая направлена на предотвращение связывания ЛПС с рецепторами клеток хозяина. Такая терапия может включать вещества, нейтрализующие ЛПС или антагонисты к рецепторам эндотоксинов.
Одним из этапов нашей работы было изучить протективные эффекты экзогенного белка теплового шока БТШ70, выделенного из мышцы быка, на эффекты эндотоксина на модели крыс.
Проведенные ранее исследования показали, что БТШ70 способен проявлять защитные свойства от эндотоксинов (Koh et al 1999; Meldrum et al.,1999; Ding et al 2001). Эффекты экзогенного БТШ70 на введение эндотоксина изучались в основном либо индукцией БТШ70 путем предварительной тепловой обработкой, либо другими стимулами или использованием ингибиторов и индукторов определенных БТШ (Ding et al., 2001; Paidas et al., 2002; Vega and De Maio 2003; Nakada et al., 2005). Кроме того, основные исследования в этом направлении проведены в основном на клеточных культурах (Маргулис, Гужова, 2000; Guzhova et al., 1998; Guzhova etal.,2001).
Наши исследования, проведенные на бодрствующих животных, показали, что предварительное введение БТШ70, выделенного из мышцы быка, за 10 минут до эндотоксинов из Е. coli и S. typhimurium может снижать их физиологические эффекты.
Так, в наших экспериментах предварительное введение БТШ70 снижало смертность животных от эндотоксинов. Характерно, что последующее введение БТШ70 после эндотоксинов было эффективным в снижении смертности только в случае применения эндотоксина из S. typhimurium, тогда как применение БТШ70 после ЛПС Е. coli даже немного увеличивало этот параметр. Подобные эффекты можно объяснить тем, что БТШ70 вероятно блокирует механизмы, которые впоследствии приводят к развитию воспалительного сигнала, на ранних этапах. Из литературных данных известно, что БТШ70 способен подавлять развитие воспаления путем блокирования передачи сигнала от ЛПС в ядро (Shi et al., 2006). БТШ70, введенный экзогенно, способен препятствовать реакции фосфорилирования фактора NFkB, что в итоге приводит к торможению передачи сигнала. В результате не начинает нарабатываться основной цитокин ФНО-а, и в итоге воспалительный процесс не развивается в полном объеме. Кроме того, в литературе имеются доказательства того, что БТШ70 имеет ингибиторный эффект на высвобождение цитокинов (Ding et al., 2001; Suganuma et al., 2002; Nakada et al., 2005).
Известно, что введение эндотоксина животным вызывает каскад событий, инициированных секрецией известных цитокинов, которые изменяют экспрессию генов и индуцируют лихорадку, вызывает увеличение сердечного выброса, изменения в работе сердечно-сосудистой системы, нарушения в работе печени и почек (Pajkrt et al 1997; Karima et al., 1999). Согласно литературным данным, БТШ70 модулирует фибринолитическую и свёртывающую системы во время эндотоксемии (Ding et al., 2001; Suganuma et al., 2002; Nakada et al., 2005). В некотором отношении наши данные подтвердили это предположение, поскольку предварительное введение БТШ70 значимо изменяло наблюдаемое увеличение всех параметров гемостаза (Рис III. 1.2.1.).
При эндотоксиновом шоке происходят нарушения в работе свертывающей, фибринолитической и противосвертывающей систем. В результате чего развивается синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС) - дисбаланс в работе этих трех систем. В наших экспериментах при введении эндотоксина Е. coli наблюдалось увеличение изучаемых параметров гемостаза. Увеличение времени свертывания как тромбопластинового, так и протромбинового свидетельствует о наступлении эндотоксин-индуцибельной фазы гипокоагуляции (или переходной) стадии ДВС-синдрома, когда на фоне гиперколичеств циркулирующего в крови тромбопластина активируется и противосвертывающая система - активность факторов как внешнего, так и внутреннего пути свертывания крови замедляется, время свертывания удлиняется. Вследствие гипокоагуляции фибриноген не трансформируется в фибрин, концентрация его в крови увеличивается, кроме того, фибриноген как белок острой фазы начинает активно синтезироваться в печени (Сидоркина и др., 2003). При эндотоксиновом шоке в патогенезе тяжелых нарушений коагуляции играет роль ещё один механизм - увеличение ингибитора активации фибринолитической системы (в частности, ингибитора активации плазминогена), что способствует неадекватному удалению сгустков фибрина из сосудистого русла (Грачев и др., 2003). В результате время лизиса сгустка (время фибринолиза) удлиняется. Известно, что ключевым активатором нарушений при ДВС-синдроме является IL-6, а TNF-a опосредованно влияет на этот процесс за счет воздействия на IL-6 (Esmon,2001).
