Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы
1.1. Свободнорадикальное окисление и органическая жизнь 11
1.1.1. Физические основы реакционной способности кислорода и основные виды активных форм кислорода в живой клетке И
1.1.2. Основные источники и механизмы образования АФК в клетке 14
1.2. Свободнорадикальное окисление белков 19
1.2.1. Механизмы физико-химических реакций свободнорадикального окисления белков в живых организмах 19
1.2.2. Окислительная модификация белка и протеолиз 21
1.2.3. Окислительная модификация белка и старение 24
1.2.4. Окислительная модификация белка при патологии 25
1.3. Многообразие антиоксидантных систем в аэробных организмах 28
1.4. Свободнорадикальное окисление в мозге 33
1.4.1. Особенности кислородного метаболизма мозга 33
1.4.2. Роль СРО и белков в головном мозге 34
1.4.3. Антиоксидантные системы мозга 36
1.4.4. Онтогенетические и структурные особенности белкового метаболизма в головном мозге 37
1.5. Пренатальный стресс 39
1.5.1. Изменения в поведении, вызванные пренатальным стрессом 41
1.5.2. Изменения гормонального статуса и медиаторных систем, вызванные пренатальным стрессом 43
2. Экспериментальная часть
2.1. Материалы и методы 47
2.1.1. Определение продуктов окислительной модификации белков 47
2.1.2. Определение активности цитозолыюй Zn-Cu-супероксиддисмутазы 50
2.1.3. Выделение обогащенных фракций нейронов и нейроглии 52
2.1.4. Постановка опыта 54
2.1.5. Статистические методы 55
2.2. Результаты исследования 56
2.2.1. Окислительная модификация белков в некоторых отделах головного мозга контрольных и пренатально стрессированных крыс в разные сроки постнатального онтогенеза 56
2.2.1.1. Спонтанная окислительная модификация белков 56
2.2.1.1.1. Стриатум 56
2.2.1.1.2. Гиппокамп 57
2.2.1.1.3. Гипоталамус 60
2.2.1.2. Стимулированная реактивом Фентона окислительная модификация белков...62
2.2.1.2.1. Стриатум 62
2.2.1.2.2. Гиппокамп 64
2.2.1.2.3. Гипоталамус 66
2.2.2. Окислительная модификация белков в нейронах и нейроглии коры больших полушарий головного мозга контрольных и пренатально стрессированных крыс в разные сроки постнатального онтогенеза 68
2.2.2.1. Спонтанная окислительная модификация белков 68
2.2.2.1.1.Нейроны 68
2.2.2.1.2. Нейроглия 70
2.2.2.2.Стимулированная реактивом Фентона окислительная модификация белков...72
2.2.2.2.1. Нейроны 72
2.2.2.2.2.Нейроглия 74
2.2.3. Окислительная модификация белков в сыворотке крови контрольных и пренатально стрессированных крыс в разные сроки постнатального онтогенеза 76
2.2.3.1 Спонтанная окислительная модификация белков в сыворотке крови 76
2.2.3.2. Стимулированная реактивом Фентона окислительная модификация белков в сыворотке крови 78
2.2.4. Активность цитозолыюй супероксиддисмутазы в некоторых отделах головного мозга, клеточных фракциях коры больших полушарий и в крови контрольных и пренатально стрессированных крыс в разные сроки постнатального онтогенеза 80
2.2.4.1. Стриатум 80
2.2.4.2. Гиппокамп 81
2.2.4.3. Гипоталамус 82
2.2.4.4. Нейроны и нейроглия коры больших полушарий 83
2.2.4.5. Сыворотка крови 86
3. Обсуждение результатов 88
Выводы 100
Список литературы 102
- Свободнорадикальное окисление и органическая жизнь
- Механизмы физико-химических реакций свободнорадикального окисления белков в живых организмах
- Определение активности цитозолыюй Zn-Cu-супероксиддисмутазы
- Активность цитозолыюй супероксиддисмутазы в некоторых отделах головного мозга, клеточных фракциях коры больших полушарий и в крови контрольных и пренатально стрессированных крыс в разные сроки постнатального онтогенеза
Введение к работе
Актуальность темы
Психоэмоциональный стресс является одним из негативных последствий технического прогресса. Особую важность представляет изучение влияния стресса на организм, находящийся в состоянии беременности, в связи с тем, что негативные последствия выявляются у последующих поколений. Обнаружено, что пренатальное стрессирование животных изменяет гормональную индукцию у развивающегося эмбриона в период формирования структур головного мозга, отвечающих за регуляцию адаптивного поведения (Ордян, Пивина, Ракицкая и др., 2000; Шаляпина, Зайченко, Ордян и др., 2001). К таким структурам относят стриатум, гиппокамп и гипоталамус. В результате изменяется приспособительное поведение и снижаются адаптивные способности у взрослых потомков, что свидетельствует о фундаментальной перестройке функций ЦНС.
Как известно, формирование нервной системы у незрелорождающихся животных и человека завершается спустя длительное время после рождения (Дмитриева, 1981). Наиболее ответственный период в постнатальном онтогенезе - это период миелинизации, который завершается совершенствованием ЦНС. Любое изменение этого процесса неблагоприятно скажется на формировании миелиновых оболочек, что отразится на электрофизиологических процессах в мозге, и соответственно, повлечет за собой изменения функциональной активности ЦНС.
Известно, что все процессы, протекающие в ЦНС, связаны с модификацией клеточных мембран (Меньшов, Шишкина, Бурлакова и др., 1996). Окислительная модификация биомолекул мембран является одним из наиболее быстрых путей изменения их физико-химических параметров, что способствует приспособлению их молекулярной организации к изменившимся условиям среды и повышает жизнеспособность клеток (Burdon, 1996).
Исследования клеточных и молекулярных механизмов регуляции функциональной активности головного мозга показали, что в их основе лежат процессы свободнорадикального окисления (Гуляева, Левшина, Обидин, 1989). Реакции свободнорадикалыюго окисления - это реакции взаимодействия органических молекул с продуктами аэробного дыхания - активными формами кислорода, которые очень реакционноспособны. Сведения, относящиеся к процессу свободнорадикалыюго окисления белков крайне малочисленны. В последнее десятилетие установлено, что посттрансляционная модификация белка является начальной реакцией клетки на изменение условий ее функционирования (Дубинина, Шугалей, 1993; Stadtman, 1992). В
7 связи с участием белков нервной ткани в таких специфических процессах, как передача нервного импульса, образование синапсов, участие в процессах обучения и памяти становится очевидным влияние посттрансляционных модификаций белков, связанных с быстрым изменением конформации. Одновременно с этим, модификации белка, облегчающие его протеолитический распад, служат сигналами для изменения метаболизма клетки, что также участвует в срочной адаптации клетки к изменившимся условиям. Таким образом, изучение процессов свободнорадикального окисления белков становится в настоящее время актуальной областью исследований в биологии и практической медицине. Процессы свободнорадикального окисления в организме находятся под строгим контролем антиоксидантной системы (Владимиров, 1998). Особенностью метаболизма мозга являются интенсивные аэробные окислительные процессы и в ЦНС существует точно сбалансированная система «свободнорадикальное окисление - антиоксиданты». Патологическим для ЦНС является не само свободнорадикальное окисление, а нарушение его регуляции антиоксидантной системой.
Нервная ткань является наиболее чувствительной к такому дисбалансу в силу своих биохимических и функциональных особенностей. Несмотря на очевидную значимость посттрансляционной окислительной модификации белков в ЦНС, нами не найдено работ, исследующих роль окислительной модификации белка (ОМБ) в нормальном функционировании ЦНС и влияния пренатального стресса на этот процесс.
Цель и задачи исследования
Целью нашей работы было исследование в онтогенезе ОМБ и активности первичного звена антиоксидантной системы - цитозолыюй супероксиддисмутазы (СОД) в норме и после пренатального стресса в структурах мозга крыс, связанных с регуляцией адаптивного поведения.
Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:
1. Установить возрастную динамику показателей спонтанной и индуцированной
ОМБ у крыс в период постнатальной дифференцировки мозга и во взрослом состоянии в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе.
2. Определить эти же показатели в двух функционально различных клеточных
популяциях коры больших полушарий (нейронах и нейроглие) в онтогенезе.
3. Изучить возрастную динамику активности цитозолыюй СОД в стриатуме,
гиппокампе, гипоталамусе, нейронах и нейроглие коры больших полушарий.
4. Выявить действие пренатального стресса на изменение возрастной динамики
спонтанной и индуцированной ОМБ в указанных структурах.
5. Изучить влияние пренатального стресса на активность цитозольной СОД в
указанных структурах в течение постнаталыюго онтогенеза.
6. Для понимания общеорганизменных закономерностей становления равновесия
системы «оксиданты-антиоксиданты» и влияния на нее пренатального стресса исследовать процессы ОМБ и активность СОД в сыворотке крови в норме и после пренатального стресса
Основные положения, выносимые на защиту
В стриатуме гиппокампе и гипоталамусе интенсивно протекают процессы свободнорадикального окисления белков. Максимальная скорость свободнорадикального окисления белков отмечается на тридцатый день постнатального онтогенеза. Пренатальный стресс изменяет свободнорадикальное окисление белков. Наиболее выражены эти изменения в период интенсивной миелинизации, которые сохраняются во взрослом состоянии.
Максимальный уровень свободнорадикального окисления белков в нейронах и нейроглие коры головного мозга достигается к 30 дням постнатального онтогенеза и снижается во взрослом состоянии. В нейронах и нейроглие пренатально стрессированных животных уровень свободнорадикального окисления белков значительно снижен по сравнению с нормой. Свободнорадикальное окисление белков является важной составляющей системы становления метаболизма и созревания нервной системы.
Активность СОД в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе, а также в нейронах и нейроглие коры головного мозга возрастает к тридцатому дню постнаталыюго развития и снижается во взрослом состоянии в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе. После пренатального стресса происходит увеличение активности СОД во всех исследованных отделах и снижение ее в нейронах коры головного мозга. В клетках нейроглии активность СОД не отличается от нормы.
Изменение уровня свободнорадикального окисления белков и активности СОД в сыворотке крови пренатально стрессированных животных по сравнению с нормой свидетельствует о том, что пренатальный стресс оказывает влияние на развитие всего организма. Данные, полученные в сыворотке крови, могут быть отражением процессов, происходящих в ЦНС после экстремальных воздействий.
9 Научная новизна
Впервые установлено, что в отделах головного мозга, связанных с нейроэндокринной регуляцией адаптивного поведения, интенсивно протекают процессы свободнорадикалыюго окисления белков. При этом динамика накопления продуктов спонтанной ОМБ в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе сходна. Активность цитозольной СОД в процессе постнатального онтогенеза во всех исследованных отделах возрастает к 30 дню и снижается во взрослом состоянии.
Впервые исследовано влияние пренатального стресса на ОМБ в постнатальном онтогенезе. Обнаружено, что после пренатального стресса наблюдаются сходные изменения динамики накопления продуктов спонтанной ОМБ в исследованных отделах. Наиболее выражены эти изменения в период постнатальной дифференцировки нервной системы - в возрасте 10 и 20 дней. В этот период происходит интенсивная миелинизация головного мозга и завершается формирование связей гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы.
Впервые изучены процессы свободнорадикалыюго окисления белков и изменения активности СОД в системе нейрон-нейроглия в процессе постнатального онтогенеза в норме и после пренатального стресса. Динамика процессов свободнорадикалыюго окисления белков в нейронах коры больших полушарий коррелирует с возрастными изменениями свободнорадикалыюго окисления белков в исследованных отделах. Для глиальных клеток характерна более низкая интенсивность свободнорадикального окисления белков по сравнению с нейронами. Пренатальный стресс значительно снижает процессы свободнорадикалыюго окисления белков в нейронах и нейроглие.
Впервые установлено, что система свободнорадикалыюго окисления белков является компонентом метаболической системы ЦНС. Изменение ее активности коррелирует с процессами становления ЦНС и реагирует на такое внешнее воздействие, как пренатальный стресс.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты, представленные в диссертации, являются приоритетными и имеют большое научно-практическое значение, так как дают целостную картину роли процессов ОМБ и компонентов антиоксидантной системы в обеспечение гомеостаза организма. Данные о процессах ОМБ в головном мозге в онтогенезе свидетельствует об участии этой посттрансляционной модификации белков в становлении ЦНС
Полученные данные вносят вклад в понимание патогенетических механизмов пренатального стресса, связанных с дискоординацией в сроках становления функций ЦНС, которые обуславливаются процессами свободнорадикального окисления.
Результаты сопоставления ОМБ в головном мозге и сыворотке крови, продемонстрировавшие корреляцию процессов свободнорадикального окисления в головном мозге и сыворотке крови после пренатального стресса, могут быть использованы при разработке профилактических мероприятий, направленных на нормализацию биохимических процессов в головном мозге после пренатального стресса.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на конференции «Нейроэндокринология» 2003, 2005 (СПб, 2003, 2005), IV Молодежной научной конференции «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2005), Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (СПб, 2005), I Съезде физиологов СНГ(Дагомыс, 2005).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ: 4 статьи и 5 тезисов. Работа
поддержана грантами Правительства Санкт-Петербурга для молодых ученых за 2002,2003 гг.
Структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, включающих 8 рисунков и 17 таблиц. Список литературы включает 245 работ.
Свободнорадикальное окисление и органическая жизнь
Процессы биологического окисления являются одними из наиболее распространенных видов химических реакций, протекающих в жизни аэробных организмов и обеспечивающих их жизнедеятельность. Особенностью таких реакций является их окислительно-восстановительный характер, когда в ходе реакции сопряженно протекает окисление одного из реагирующих агентов и восстановление другого. Сущностью этих реакций является перенос электронов с окисляемого субстрата на восстанавливаемый или от восстановленного вещества к окислителю (Барабой и др., 1992).
В реакциях биологического окисления в качестве окисляемого субстрата выступают сложные органические соединения (углеводы, белки, липиды, нуклеиновые кислоты), а в роли окислителя и акцептора электронов - молекулярный кислород.
Молекулярный кислород появился в земной атмосфере около 2,5 109 лет назад в результате фотосинтетической деятельности сине-зеленых водорослей. Он является основным и незаменимым химическим компонентом для жизни подавляющего большинства организмов на Земле, однако, наряду с этим он обладает явно выраженной токсичностью. Поэтому, жизнь этих организмов возможна только благодаря многоплановым механизмам защиты. При этом избытка противокислородной защиты в клетке не существует, и млекопитающие гибнут при помещении их в атмосферу с концентрацией кислорода всего лишь в 5 или 10 раз выше, чем в обычном воздухе (Пескин, 1998). Вообще в природе нет свободно живущих организмов, которые могут длительное время находится под действием кислорода в концентрации более высокой, чем в воздухе (Фридович, 1979).
В чем причина токсичности кислорода для жизни, и каким образом аэробные организмы решают задачу существования в условиях земной атмосферы? Ответу на этот вопрос посвящена первая часть обзора литературы.
.Физические основы реакционной способности кислорода и основные виды активных форм кислорода в живой клетке.
Молекулярный кислород в основном состоянии содержит два неспаренных электрона, располагающихся на разрыхляющих р - и у - орбиталях. Они имеют параллельные спины, что придает молекуле парамагнитные свойства. Это обстоятельство накладывает энергетический запрет на непосредственное взаимодействие со спаренными электронами. Необычное основное состояние молекулы кислорода объясняет его высокую устойчивость и кинетическую инертность в различных химических реакциях, несмотря на то, что все реакции присоединения кислорода экзотермичны.
Причина кинетической инертности кислорода заключается в том, что большинство органических соединений - как субстраты, так и продукты окисления - являются по своей электронной структуре диамагнитными синглетными соединениями, т.е. содержащими на своих орбиталях только спаренные электроны. Условием для вступления триплетного кислорода в реакцию с синглетным соединением и образованием в результате синглетных продуктов является обращение спина электрона. Инверсия спина электрона - процесс медленный по сравнению со временем жизни комплексов, образующихся в момент соударения реагирующих частиц. Поэтому не существует прямых реакций между триплетными и синглетными соединениями.
Для того чтобы кислород из химически инертного триплетного состояния перешел в реакционно-способное, необходимо его активировать. Превращение триплетного кислорода в синглетный вследствие перехода одного из электронов, локализованного на разрыхляющей орбитали, на другую орбиталь, т.е. формированием диамагнитного кислорода с выраженными электрондонорными свойствами происходит в живых клетках в фотохимических реакциях, связанных с возбуждением пигментов (хлорофиллов, порфиринов, ретиналя, флавинов(Арчаков, 1989).
Как побочный продукт, синглетный кислород обнаружен в ряде процессов: в самопризвольной, некатализируемой реакции дисмутации супероксидных ионов, реакции разложения перекиси, перекисного окисления липидов в микросомах, биосинтезе простагландинов (Фридович, 1979). Но основным путем активации кислорода в клетке является его восстановление в активных центрах ферментов - оксидаз и оксигеназ.
При оксидазном четырехэлектронном восстановлении кислорода в молекуле Ог (0=0) разрываются обе связи, присоединения кислорода к окисляемому субстрату не происходит, а каждый из атомов кислорода восстанавливается до воды. При оксигеназном окислении происходит образование связи между кислородом и субстратом. При монооксигеназном окислении происходит присоединение одного атома кислорода. По такому пути функционируют системы микросомалыюго окисления ксенобиотиков. При диоксигеназном окислении происходит присоединение двух атомов кислорода с разрывом одной связи (-0-0-S) с образованием пероксидных соединений. (Хавинсон, 2003, Владимиров, 1998). На рис.1 представлена схема электронного строения р-орбитали молекулы кислорода и ее изменения при превращении в активные метаболиты. Электронный Уровень Т I
Характерным признаком свободных радикалов является наличие одного или более неспаренных электронов на молекулярной или внешней (валентной) атомной орбите. Наличие неспаренного электрона определяет высокую химическую активность свободного радикала, который, стремясь приобрести недостающий электрон, вступает в различные химические реакции. Перенос одного электрона на молекулу кислорода сопровождается образованием супероксидного радикала, который является по редокс-потенциалу в водном окружении (О2/О2" = -ЗбЗмВ) восстановителем. В неводной гидрофобной среде или в координационой сфере металла редокс-потенциал этой пары резко возрастает, превращая супероксидный ион в сильный окислитель.
Образование супероксида происходит при работе митохондриальной и точную химическую природу АФК не представляется возможным в силу их нестабильности и легкости перехода одной формы в другую. Только синглетный кислород может прямым, некатализируемым путем самопроизвольно превращаться в химически инертный триплетный, причем эта реакция сопровождается люминесценцией. Супероксидный радикал в реакции дисмутации превращается в Н2О2 и синглетный кислород в случае спонтанной реакции или триплетный в случае, если процесс был ферментативным. Реакция, получившая название реакции Габера-Вейса описывает процессы образования ЮН из супероксидного иона в присутствии металлов переменной валентности: 02- + Н202 - 02 + -ОН + ОН Н2О2 в реакции Феитона распадается в присутствии ионов металлов переменной валентности в восстановленном состоянии также с образованием ЮН: Н202 +Fe2+ - Fe3+ +ОН + ОН
В целом, в нормальных условиях около 5% поглощаемого организмом кислорода превращается в активные формы(Кулинский, Колесниченко,1993), которые различаются по времени их жизни. Перекись водорода (время полужизни 10-100 с) и супероксидный ион (время полужизни - менее 1 10 ) являются относительно стабильными и могут диффундировать на значительные расстояния и проходить через клеточные и внутриклеточные мембраны. Синглетный кислород имеет время полужизни t=2 10"6 с, ОН -7 10 10 с. Таким образом, ОН является самым реакционноспособным и вступает в окислительные реакции в месте своего образования.
Наряду с перечисленными, в клетке также происходят ферментативные и неферментативные реакции, в результате которых образуются такие свободно-радикальные продукты как гипохлорит, оксид азота и пероксинитрит.
Механизмы физико-химических реакций свободнорадикального окисления белков в живых организмах
Начало исследований СРО белков было положено радиобиологами (Окада, 1974, Хенриксен и др., 1979, Кузин, 1986.). В результате исследований влияния ионизирующего излучения на белковые молекулы было установлено, что свободные радикалы воздействуют как на аминокислотные остатки, так и на углеродную цепь полипептидной молекулы. При воздействии на белок, находящийся в водном растворе, с ним преимущественно реагируют продукты радиолиза воды - ОН, атомарный водород, гидратированный электрон. Изменение физического состояния белковой молекулы вследствие поглощения энергии радикалов приводят к локализации свободного радикала белка у наиболее электрон-донорной группы -б-углеродного атома пептидной связи и/или атома серы. Также наблюдается делокализация электронов у ароматических аминокислотных остатков. Дальнейшие события приводят к разрыву пептидной связи и окислению сульфгидрильных групп.
Исследования с помощью химических реактивов, инициирующих образование АФК, выявили сходство процессов, индуцируемых в белках ионизирующим излучением и АФК. Установлено, что АФК вызывают окислительную деградацию очищенных и интактных белков, специфика которой определяется в первую очередь аминокислотным составом и, следовательно, структурной организацией (Davis, 1987, Chevion et al.,2000). Одновременно с этим было обнаружено, что ОН вызывает агрегацию белковых молекул, а супероксидный ион - фрагментацию (Davis, 1987, Miura N. et al., 1993). При этом наблюдается снижение устойчивости белковой молекулы к действию протеаз (Davies, 1986, 1987, Арчаков, Мохосеев, 1989). Большая группа работ была выполнена на клеточных оксидазах, в процессе функционирования которых в активном центре образуются АФК, как промежуточный или побочный продукт реакции, (Арчаков, 1995,1998, Stadtman, 1991). В результате была сформулирована гипотеза об участии АФК в регуляции распада ферментов (Thomalley P.J.,1996). Фермент, подвергшийся окислительной модификации АФК, приводящей к потере его активности, относительно легко расщепляется клеточными протеазами. Окислительная модификация ферментов происходит только в присутствии Ог , ионов металлов с переменной валентностью, доноров электронов и комплексообразователей, способных связьшать ионы переходных металлов. В качестве доноров электронов могут выступать восстанавливающие соединения (аскорбат, тиолы), а источниками связанных ионов железа и меди могут являться самые различные биомолекулы, в том числе альбумин, ДНК и сами ферменты, часто содержащие такие ионы в качестве простетических групп. Субстраты, как правило, защищают ферменты от окислительной модификации. В отличие от обычного ингибирования продуктами реакции, инактивация АФК включает в себя и модификацию аминокислотных остатков (Арчаков и др., 1998). Причем модификации подвергаются строго определенные остатки аминокислот, наиболее часто гистидина и лизина, также довольно часто окислительной модификации подвергаются аргинин, пролин, серии (Davies, 1987a). Триптофан под действием АФК разрушается, серосодержащие аминокислоты и тирозин образуют ковалентные связи между радикалами серы или тирозина. Кроме того, участок модификации может располагаться в месте локализации простетической группы с ионом переходного металла, что вызывает процессы, известные как металл-катализируемое окисление (Stadtman, 1991). Таким образом, ферменты, образующие в процессе работы АФК, способны к специфичной самоинактивации.
Образование карбонильных производных белка может быть также формой регуляции активности ферментов в зависимости от содержания в окружающей среде кислорода, т.е. служить сигналом для перехода на аэробный/анаэробный путь метаболизма (Stadtman, 1991). В ходе исследований ферментных модификаций под влиянием АФК обнаружили, что существует высокоспецифичная окислительная модификация других ферментов, для которых АФК не являются ни субстратом, ни продуктом реакции (Дубинина, 1993). Так, обнаружены ферменты, инактивация которых служит сигналом о повреждении клетки (Арчаков и др., 1998). При исследовании влияния Н2О2 на состояние ферментных систем эритроцитов было показано, что из всего спектра ферментов окислительной модификации была подвержена только гексокиназа. Скорость инактивации гексокиназы коррелировала со скоростью разрушения эритроцитов. Этот фермент, отвечая за энергетическое состояние эритроцита, является ключевым для его жизнедеятельности. Учитывая, что эритроциты не способны синтезировать этот белок, и при отсутствии в данном эксперименте повреждений мембраны, можно сделать выводы о том, что именно окислительная модификация ключевых для клетки ферментов служит сигналом для запуска программы самоуничтожения.
При сравнительном анализе СРО белков и липидов (Reinheckel, 1998) обнаружено, что в отличие от липидов белки реагируют на радикальную атаку первыми без предварительной лаг-фазы. Таким образом, ОМБ можно рассматривать как первый сигнал изменения условий. В качестве такого сигнала ОМБ связана с целым рядом физиологически важных клеточных процессов. Наиболее исследована в настоящее время роль ОМБ в протеолизе, в старении организмов и при патологических состояниях.
Определение активности цитозолыюй Zn-Cu-супероксиддисмутазы
Данные по содержанию продуктов ФОМБ в стриатуме контрольных и пренатально стрессированных крыс разного возраста представлены в таблице 4. В возрасте 10 дней у контрольньк крыс уровень начальных продуктов ФОМБ, составляет 0,054 Е/мг, уровень вторичных продуктов, определяемьк при 363 нм и при 370 нм, соответственно 0,081 и 0,086 Е/мг. К 20 дневному возрасту у контрольньк крыс количество всех продуктов ФОМБ значительно увеличивается (в 5-6 раз). В возрасте 30 дней количество начальных продуктов ФОМБ у контрольньк крыс остаются на уровне, характерном для 20 дней, содержание конечньк продуктов или достоверно уменьшается (при 363 нм - более чем в 2 раза) или имеет тенденцию к уменьшению (370нм). Содержание продуктов ФОМБ у взрослых животных не меняется по сравнению с 30-дневными.
Пренатальный стресс вызывает повышение уровня ФОМБ в стриатуме 10-дневных крысят. Содержание начальных продуктов ФОМБ увеличивается по сравнению с контролем в 7,7 раза, вторичных продуктов, определяемьк при 363 нм и при 370 нм, в 2,9 и 2,7 раза, соответственно. К 20 дням постнатальной жизни количество всех продуктов снижается до уровня, характерного для контрольньк животных 10-дневного возраста. К 30 дню постнатального развития уровень ФОМБ возвращается к значениям, характерным для пренатально стрессированных 10-дневных животных, и при этом не отличается от уровня ФОМБ у контрольных 30-дневных крысят. У взрослых пренатально стрессированных крыс количество продуктов ФОМБ несколько снижается, но достоверное снижение отмечается только для продуктов, определяемых при 370 нм (в 3,5 раза). Тем не менее, содержание всех продуктов ФОМБ у взрослых животных в стриатуме оказывается ниже, чем у контрольных. Сильнее всего снижается содержание продуктов, определяемых при 370 нм (в 4 раза); количество продуктов, определенных при 363 нм снижается по сравнению с контролем в 2,4 раза, а первичных -всего в 1,8 раза.
В итоге следует отметить различную динамику изменения процессов ФОМБ стриатума в онтогенезе контрольных и ПС крыс. Количество начальных продуктов ФОМБ у контрольных животных возрастают до 100 дней постнатального онтогенеза. Уровень конечных продуктов ФОМБ имеет максимальное значение в возрасте 20 дней, к 30 дням жизни он снижается и затем не изменяется. Количество продуктов ФОМБ у ПС крыс велико уже у 10-дневных крысят и этот уровень сохраняется, снижаясь к моменту полового созревания. Однако в возрасте 20 дней для пренатально стрессированных животных характерно резкое снижение уровня ФОМБ, которое мы отмечали и при исследовании спонтанного ПОБ. У взрослых пренатально стрессированных животных все показатели ФОМБ в стриатуме оказываются ниже по сравнению с контролем.
Результаты исследования содержания продуктов стимулированного перекисного окисления белков в гиппокампе представлены в таблице 5. Полученные данные показывают, что в возрасте 10 дней у контрольных крыс содержание начальных продуктов ФОМБ равно 0,077 Е/мг. Содержание конечных продуктов, определяемых при 363 нм и при 370 нм - соответственно 0,124 и 0,115 Е/мг. В возрасте 20 дней в гиппокампе содержание как начальных, так и конечных продуктов ФОМБ существенно возрастает: первичных продуктов - в 5 раз, а продуктов, определяемых при 363 нм и 370 нм - в 3,2 и 2,8 раз, соответственно. К 30-дневному возрасту количество начальных продуктов ФОМБ снижаются в 2,5 раза по сравнению с 20-дневными. Отмечается снижение и количества конечных продуктов ФОМБ, но оно не достоверно. У 100 дневных контрольных животных уровень начальных продуктов ФПОБ возрастает по сравнению с 30-дневными более чем в 3 раза и становится даже выше, чем у 20-дневных животных. Содержание конечных продуктов стимулированной ОМБ в гиппокампе увеличивается в 1,5 раза, но остается ниже уровня, характерного для 20-дневных животных.
Как и в стриатуме, пренатальный стресс вызывает в гиппокампе существенное (в 2-Зраза) увеличение количества всех продуктов стимулированной ОМБ у 10-дневных крысят. В возрасте 20 дней уровень продуктов ФОМБ у пренатально стрессированных животньк снижается и достигает уровня, характерного для 10-дневных контрольных крысят. На 30-й день постнатального развития количество продуктов ФОМБ нарастает по сравнению со значениями, характерными для двадцатидневного возраста в 2-3 раза и, фактически, достигает уровня, отмеченного у 10-дневных пренатально стрессированных крысят. У взрослых пренатально стрессированных животных количество всех продуктов опять снижается, но очень не равномерно. Так, содержание первичных продуктов ФОМБ снижается всего в 1,8 раза, продуктов, определяемых при 363 нм - в 3,7 раза, а количество определяемых при 370 нм продуктов падает в 14 раз по сравнению с 30-дневными животными. В результате у взрослых пренатально стрессированных животных уровень ФОМБ оказывается существенно ниже, чем в контроле. Содержание первичных продуктов было снижено по сравнению с контролем в 4,7 раза, продуктов, определяемых при 363 нм - в 6,7 раза, а количество продуктов, определяемых при 370 нм, понизилось более чем в 15 раз по сравнению с контрольными взрослыми животными.
Таким образом, в гиппокампе динамика изменения процессов ФОМБ в онтогенезе контрольных и ПС крыс различна и несколько отличается от таковой в стриатуме. Как и в стриатуме количество начальных продуктов ФОМБ у контрольных животных возрастают к 20 дням, а к 30 - снижаются, но к 100 дням постнатального онтогенеза, в отличие стриатума, оно опять возрастает. Такая же картина характерна и для конечных продуктов ФОМБ у контрольных животных. У ПС крыс содержание продуктов ФОМБ отличается от контроля во все исследованные сроки, но в возрасте 10 и 30 дней оно превышает уровень контроля (за исключением показателей, определяемых при 363 нм, у 30-дневных), а у 20-дневных и взрослых животных - снижается относительно контроля и относительно пренатально стрессированных крыс 10- и 30-дневного возраста. 2.2.1.23. Гипоталамус
Результаты исследования содержания продуктов ФОМБ в гипоталамусе контрольных и пренатально премированных крыс разного возраста представлены в таблице 6. В возрасте 10 дней у контрольных крыс уровень начальных продуктов ФОМБ составляет 0,058 Е/мг, уровень вторичных продуктов - 0,078 и 0,080 Е/мг, что фактически не отличается от результатов, полученных для стриатума и гиппокампа. К 20-дневному возрасту количество всех продуктов ФОМБ в гипоталамусе увеличивается в 4-6 раз. В следующие десять дней увеличение замедляется, и хотя у 30-дневных животных наблюдается лишь тенденция к увеличению всех показателей ФОМБ по сравнению с 20-дневными (достоверность изменений отмечается только для начальных продуктов ФОМБ), можно сказать, что максимальная интенсивность ФПОБ в гипоталамусе отмечается в возрасте 30 дней. У 100-дневных половозрелых крыс количество начальных и конечных продуктов ФОМБ снижаются по сравнению с 30-дневными, однако достоверные изменения отмечены только для показателей, определяемых при 370нм.
Активность цитозолыюй супероксиддисмутазы в некоторых отделах головного мозга, клеточных фракциях коры больших полушарий и в крови контрольных и пренатально стрессированных крыс в разные сроки постнатального онтогенеза
Результаты исследования активности цитозольной СОД в стриатуме контрольных и пренатально стрессированных крыс разного возраста представлены в таблице 13. В возрасте 10 дней у контрольных крыс активность СОД в контрольной группе равна 25,03 у.е./мг белка и не изменяется в последующие 10 дней. К 30-дневному возрасту активность этого фермента возрастает более чем в 2 раза. Однако у взрослых половозрелых крыс наблюдается снижение активности фермента в 13 раз по сравнению с 30-дневными.
Пренатальный стресс вызывает увеличение активности СОД в стриатуме 10-дневных крысят в 3,7 раза по сравнению с контролем. В возрасте 20 дней активность фермента уменьшается и устанавливается на уровне, характерном для контрольных животных этого возраста. Как и у контрольных крыс, у пренатально стрессированных активность фермента увеличивается в 30 дней постнатального развития в 2 раза по сравнению с 20-дневными животными и снижается в период взросления в 5 раз по сравнению с 30-дневными животными. Эти изменения приводят к тому, что активность фермента в стриатуме 30-дневных животных не отличается от контроля, а у взрослых пренатально стрессированных крыс оказывается более чем в 2 раза выше, чем у контрольных животных.
Результаты исследования активности СОД в гиппокампе контрольных и пренатально стрессированных крыс разного возраста представлены в таблице 14. В возрасте 10 дней у контрольных крыс активность СОД равна 25,75 ед./мг белка. К 20-му дню постнатального развития активность фермента снижается по сравнению со значениями этого показателя в возрасте 10 дней в 1,8 раза, а затем снова увеличивается к 30-дневному возрасту в 3,8 раза. Как и в стриатуме, активность фермента очень сильно уменьшается у взрослых половозрелых крыс - в 23 раза по сравнению с 30-дневными. Пренатальний стресе вызывает увеличение активности фермента в гиппокампе 10-, 20- и 100-дневных животных в среднем в 2 раза по сравнению с контролем. Возрастная динамика изменения активности фермента при этом сохраняется, хотя у пренатально стрессированных крыс увеличение активности фермента в 30-дневном возрасте не значительно (в 1,7 раза по сравнению с 20-дневными). В связи с этим уровень активности фермента у крыс этого возраста не различается у контрольных и пренатально стрессированных животных.
Результаты исследования активности СОД в гипоталамусе крыс разного возраста представлены в таблице 15. В возрасте 10 дней у контрольных крыс активность СОД в контрольной группе равна 15,46 ед./мг белка, что несколько ниже, чем в стриатуме и гиппокампе. В возрасте 20 дней активность фермента не изменяется по сравнению со значениями этого показателя в возрасте 10 дней, а в 30 дней она возрастает почти в 3 раза. Как и в других исследованных отделах мозга, активность СОД в гипоталамусе взрослых половозрелых крыс снижается почти в 10 раз по сравнению с 30-дневными животными. Пренатальный стресс увеличивает активность СОД в гипоталамусе 10-, 20- и 100-дневных животных в среднем в 2 раза по сравнению с контролем. Как и в гиппокампе, возрастная динамика изменения активности фермента сохраняется у пренатально стрессированных крыс, хотя увеличение активности фермента в 30-дневном возрасте еще менее значительно, чем в гиппокампе (в 1,4 раза по сравнению с 20-дневными животными). В результате уровень активности СОД у крыс этого возраста не различается у контрольных и пренатально стрессированных животных.
Активность СОД в нейронах и нейроглии исследовали в возрасте 20-ти, 30-ти и 100 дней. Полученные результаты представлены в таблице 16. В возрасте 20 дней активность СОД в нейронах коры больших полушарий контрольных животных составляет 62,83 у.е./мг белка. В течение следующих десяти дней она фактически не изменяется, но у 100 дневных половозрелых крыс наблюдается увеличение активности фермента более чем в 2 раза.
Пренатальный стресс вызывает снижение активности СОД у 20-дневных крысят в 3,8 раза по сравнению с контролем. Очень существенно отличается у пренатально стрессированных животных и динамика возрастных изменений активности СОД. Так, активность СОД в нейронах 30-дневных пренатально стрессированных животных возрастает в 7 раз по сравнению с 20-дневными. При этом она почти в 2 раза превышает активность фермента у контрольных крыс этого возраста. У взрослых крыс активность СОД опять снижается (в 1,7 раза) и становится более чем в 2 раза ниже по сравнению с активностью СОД контрольных крыс.
