Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМУ. Загрязнение водной среды, бесконтрольный видов рыб, строительство плотин и разрушение нерестилищ сильно уменьшают количество рыб в различных популяциях, приводят к инбридингу, вырождению и даже к гибели многих видов. В Красную книгу МСОП (1973) внесено ІБ8 видов (около I мировой фауны) и 25 подвидов риб, находящихся под угрозой исчезновения. В Красней книге СССР (1984) была 9 видов (3,5 % общего числа пресноводных форм), а в 19Э0 г. этот список вырос уже до 35 видов рыб.
Не лучше обстоят дела и в странах Европа, где значительная часть риб (52,3 %) находятсо под угрозой исчезновения, а 53,5 % популяций всех промысловых рыб полностью истощены и запрещены к вылову (А.В. Яблоков, С.А. Остроумов, IS85).
В связи с этим во многих странах мира ведутся исследования по криоконсервации спермы рыб, и в некоторых странах (ФРГ, США, Канада) уже созданы низкотемпературные банки. Главная цель таких работ - сохранение генома криоконсервировашшх спермиав с последующим их использованием для воспроизведения видов, подвидов и пород и восстановление исчезающих генотипов рыб. Но вопрос о состоянии генетического аппарата спершев, закладываемых на долгосрочное хранение, степени его сохранности, несмотря на его первостепенное значение для данных работ, до сих пор не изучен. Имеется большое количество исследований, посвященных разработке способов криоконсервации спе-'рмы рыб и выяснению механизмов криоповревдений, но практически отсутствуют исследования по изучению состояния генетического аппарата спермиав рыб на разных этапах криоконсервации. В литературе имеются лишь единичные сообщения о массовой гибели эмбрионов, полученных с использованием криоконсарвированной спермы (В.Н. Жукин-СКИЙ и др., 1981; М. Koldrae, K.Bieniark, 1987), а также о суммарном' влиянии факторов криоконсервации на геном рыб (А.А. Найфах и др. 1981). После этих работ однако оставалось неясным, на каком из этапов криоконсервации происходят повреждения генетического аппарата. Гибель эмбрионов на критических стадиях развития может свидетельствовать о.повреждении доминантных генов. Но, вероятно, что при криоконсервации также могут возникать повреждения рецессивных генов, которые будут проявляться в следующих поколениях.
Можно заключить, что выяснение возможности повреждений генетического .'аппарата спермиав рыб на различных этапах криоконсервации является первостепенной задачей исследователей, работающих, в области сохранения генофонда рыб с использованием методов криокон-
сарвации.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Целью работы било изучить возможны ли повравде- нля генетического аппарата спермие-в рыб при воздействии на них криопротакторов и глубокого охлаждения.
-изучить смертность диплоидных и андрогенетических гаплоидных эмбрионов, полученных с использованием нативной спермы:
. а) выдержанной разное время (5, 25, 30 и 60 мин) в средах о различной концентрацией (0; 2,5; 5,0; 10,0 у. г. ) разных криопро-токторов: ЗТИЛ9НГЛИКОЛЯ (ЭГ), диметилсульфокевда (ДМС0), глицерина (Гл) и метилового эфира этиленгликоля (Мц) и при нескольких температурах (О С, 5 С, 15 С и 21 С);
б)и сперли после замораживания-оттаивания!
-определить стадии эмбриогенеза, на которых происходит максимальная гибель эмбрионов ("критические стадии");
-изучить митоткческую активность и наличие хромосомных аберраций в клетках эмбрионов рыб, полученных ігри оплодотворении яйцеклеток сперміями поело разных этапов криоконсервации.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА ГОЛУЧЕЇШХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Впервые установлено, что:
-максимальная гибель эмбрионов осетровых (севрюга) и костистых (карп, вьюн) рыб, полученных с использованием спермиев при разных условиях криоконсервационноЯ предобработки, происходит в период начального фототипического проявления функции генома на ранних стадиях эмбриогенеза мезду поздней бластулой и гаструдой, а на последующих стадиях развития эмбрионов различия в долэ живых зародышей между опытом и контролем сохраняются на постоянном уровне:
-эквилибрация спермиев карпов и вьюнов в средах с Юм криопротакторов ЭГ, даСО, Гд и Мц приводит к увеличению смертности эмбрионов, полученных с использованном этой спермы;
-процессы замораживания и оттаивания спермаэе увеличивают смертность эмбрионов рыб, полученных с использованием этой спермы. Причем, этот показатель существенно зависит от используемого крио-протектора и его концентрации .-
-различия,в выживаемости диплоидных и андрогенетических гаплоидных зародышей увеличиваются, если они получены с помощью крио-консервированной сперш, или эквюшбрированной в средах с 10 /. криопротакторов. Это позволяет заключить, что факторы криоконсервации вызывают поврекденяя как.доминантных, так к рецессивных генов ;
-смертность эмбрионов, зависит от генотипических и физиологических характеристик самки, от которой получены яйцеклетки;
-эквилибрация спермиев с крис-протекторами влияет на количество аберраций и митотичеекий индекс клеток эмбрионов карпов и вьюнов.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Теоретическое значение работы заключается в установлении возможности мутагенного и селективного влияния факторов криоконсэрва-ции на генетический аппарат спермиев рыб. Установленные факты расширяют представления о механизмах криоповреждений и криозащиты клеток, о роли ядврно-цитоплаэматичвских взаимоотношений в обеспечении жизнеспособности клеток и о механизмах реализации функции генов в раннем развитии.
Полученные результаты позволяют при оценке качества материала, закладываемого на долгосрочное хранение, и при оптимизации способов криоконсервации, рекомендовать обязательную оценку состояния генетического аппарата гамет рыб по гибели эмбрионов. Они также позволяют внести коррективы при определении количества образцов, закладываемых на хранение, и, таким образом, предупредить потерю ценного, коллекционного материала из-за вероятности инбридинга и вырождения.
Установление факта влияния факторов криоконсервации на генетический аппарат спермиев рыб позволяет селекционерам ігроводить работы по направленной селекции.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ. Использование для осеменения спермы карпов и вьюнов, эквилиб-рированной или криоконсервированной с высокими концентрациями (10 %) криопротекторов ЗГ, ДМСО, Гл и Мц, вызывает:
в)повшиение гибели диплоидных и андрогенетических гаплоидных эмбрионов начиная со стадии поздней бластулы (начало феноти-пического проявления работы генома) до стадии гаструлы, зависящее от вида криопротектора, а также от генотипических и физиологических характеристик самки, от которой получены яйцеклетки;
б)появлаям8 хромосомных аберраций, что очевидно является следствием повреждения генетического аппарата в спермиях рыб.
АПРОБАЦИЯ РАБОГЫ. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на Международной конференции под эгидой ЮНЕСКО "Достижения и перс-
гіектига развития криобиологии и крюмедищшн" (Харьков, 1988), школе по криобиологии (Харьков, 1990), заседании Координационного совета по программе ПШТ СССР "Криобавк рыб" (Путино, 1990) и на Международном рабочем совещании по криоконсервации и хранению гамет и эморионов водных организмов (Франция, Марли Рой, 1992).
ПЛУМКЛЩТИ. По теме диссертации опубликовано 4 работы.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ПО страницах машинописного текста, включает 33 рисунка и 9 таблиц. В работе использовано 159 источников литературы.
