Введение к работе
Актуальность проблемы. Разработка эффективных методов хранения тромбоцитов при низких и сверхнизких температурах (-196''С) остается до настоящего времени актуальной задачей в области трансфуэиологии и практической криобиологии.
Значительный интерес к проблеме консервирования тромбоцитов объясняется участием кровяных пластинок в механизмах гемостаза, а также необходимостью их клинического применения в лечении тромбоци-топенических геморрагии различного происхождения. Однако, принимая во внимание нестабильность кровяных пластинок при переживании их вне организма, а также учитывая возрастающую потребность клиники в тромбоцитах/Witzig Т., 1986; Sibinga, 1987/,представляется очевидным, что систематическая заместительная трансфузионная терапия тромбоцитами возможна лишь при наличии эффективного и доступного широкой лечебной практике метода их долгосрочного хранения. Вместе с тем, результаты исследований, выполненных в этом направлении отечественными и зарубежными учеными /Аграненко В. А., Компанией А. М., 1980; Rowe А. , 1978; Armitaghe W. , 1986; Arnaud F. , 1990/, свидетельствуют о том, что решение данной проблемы, остается сложной задачей, что во многом обусловлено специфическими свойствами кровяных пластинок, их чрезвычайной чувствительностью к различного рода воздействиям. При разработке способа низкотемпературного консервирования тромбоцитов одним из важных этапов, по мнению большинства исследователей, является выбор малотоксичного, но достаточно эффективного криопротектора. Показано, что используемые в настоящее время в качестве криопротекторов для тромбоцитов диметилсульфоксид (ДОСО), диметилацетамид (ДМАШ, глицерин имеют ряд существенных недостатков. Так, ДМСО, помимо специфического угнетающего действия на гемостатическую функцию /Jacob S., 1985,1986 /, оказывает неблагоприятное воздействие на организм реципиента, а обязательная процедура удаления криопротектора от кровяных пластинок приводит к дополнительной потере и травматизации клеток на этапе деконсервации /Murphy S. , 1974; Spector J. , 1979; Kotelba-Witkowska В. , 1985/. В ряде работ /Компаниец А. М. ,1980; Vezon Q., 1982/ отмечается неблагоприятное влияние ДМАЦ на структурные компоненты мембран, проявляющееся усилением перикисного окисления липидов еше на этапе зкви-
либрации, что существенно сказывается на эффективности последующего замораживании тромбоцитов. Основным недостатком глицерина является частое образование стойких, спонтанно образующихся агрегатов при отогреве /Day і an S. , Pert J. , 1979; Messon S. , 1986/.
Таким образом, поиск веществ, обладающих низкой токсичностью и достаточной криозащитной эффективностью в отношении тромбоцитов является актуальным. В решении данной проблемы может быть использован комплексный подход, включающий направленный синтез новых веществ посредством химической модификации традиционных криопротекто-ров, изучение их физико-химических и крколротекторных свойств, а также характера и особенностей влияния на биологический обьект /Шраго М.И., 1981; Луговой В. И., 1990/. В этом отношении наибольший интерес представляют вещества ряда полиолов, представителями которых являются классический криопротектор глицерин и 1,2-пропандиол, зарекомендовавший себя эффективным криопротектором при замораживании эритроцитов /Воротилин А. М., 1981/.
Целью настоящей работы явилось исследование криопротекторных свойств полиолов и их производных в отношении тромбоцитов и экспериментальное обоснование условий их криоконсервирования при использовании наиболее эффективных из изученных криозащйтных веществ.
Задачи исследования. . 1. Изучить влияние полиолов: глицерина, 1,2-пропандиола (1.2-ПГО, 1-монометилового эфира глицерина (1-ММЭГ), 1,2-'Диметило-вого эфира глицерина (1,2-ДМЭГ), . 1,3-диметилового эфипа глицерина (1,3-ДМЭГ), 1-моноэтилового эфира глицерина (1-МЭЭГ), 1,3- и 1, 2-диэтилового эфира глицерина (1,3-ДЭЭГ и 1,2-ДЭЭГ), оксиэтилиро-ванного глицерина (ОЗГ п-5) - на морфофункциональные свойства тромбоцитов на этапе эквилибрации в зависимости от концентрации веществ и длительности экспозиции.
-
Оценить криозащитные свойства полиолов и их производных при замораживании тромбоцитов по различным программам.
-
Определить условия криоконсервирования (вид криопротектора, программа замораживания, роль переохлаждения), обеспечивающие высокую сохранность тромбоцитов.
Научная новизна. Впервые исследованы криопротекторные свойства полиолов: 1,2-ПД, алкоксизамещенных эфиров глицерина и ОЭГ (п=5) при замораживании тромбоцитов. Исследование влияния этих веществ на
специфические функции кровяных пластинок позволило установить взаимосвязь структуры веществ, степени их гидрофобности с циготоксич-ностью и криопротекторной активностью полиолов. Установлен различный уровень изменения морфофункциональных свойств тромбоцитов на этапах криоконсервирования.
Получены новые данные о сохранности функциональной полноценности тромбоцитов, криоконсервированных под защитой полиолов. Установлен диапазон скоростей замораживания и концентрации криопротек-торов, создающее наиболее оптимальные условия для сохранности тромбоцитов при их низкотемпературном консервировании с поляолами.
Впервые на тромбоцитах было исследовано влияние, переохлаждения, снятие которого позволило повысить сохранность тромбоцитов и получить более стабильные результаты.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Цитотоксичноеть изученных соединений ряда полиолов в отношении тромбоцитов возрастает с увеличением длины и числа алькильных радикалов-, что коррелирует со степенью гидрофобности их молекул.
-
В ряду полиолов из числа исследованых веществ 1,2-пропандиол 1-монометиловый эфир глицерина и оксиэтилирозанный глицерин (п-5) характеризуется наиболее выраженными криозащитными свойствами в условиях низкотемпературного консервирования тромбоцитов и, в отличие от глицерина, их криозащитный эффект достигается при более низких концентрациях и не сопровождается агрегацией кровяных пластинок.
-
Переохлаждение является одним из факторов, вызывающих снижение морфофункциональных свойств тромбоцитов при медленных режимах замораживания, а его устранение путем инициирования льдообразования в криозащитном растворе способствует повышению сохранности кровяных
пластинок.
Практическая значимость работы.. На основании проведенных исследований определены эффективные криопротекторы при замораживании тромбоцитов: 1,2-ПД, 1-ММЭГ и ОЭГ (п-5) /А. С. N 1298203 /, а также условия криоконсервирования, обеспечивающие высокий уровень сохранности кровяных пластинок, что является основой для разработки метода низкотемпературного консервирования тромбоцитов для клинической практики.
Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на II Всесоюзной конференции "механизмы криоповреждения и криозащиты
биологических объектов" (Харьков, 1984), ежегодной конференции молодых ученых ИПК и К АН УССР (1987, 1988), заседании Харьковского отделения Украинского научного общества гематологов (Харьков,1988).
Публикация материалов исследования. Основные положения диссертации опубликованы в 8 печатных работах.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и иллюстрирована 25 таблицами и 5 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований и их обсуждения, выводов и указателя литературы, который включает 178 источников.
![Консервирование тромбоцитов замораживанием по экспоненциальной программе при - 80[О]С (экспериментальное исследование) [Электронный ресурс]](/i/i/4408/184042.png "Консервирование тромбоцитов замораживанием по экспоненциальной программе при - 80[О]С (экспериментальное исследование) [Электронный ресурс] Кузнецов Константин Васильевич")
