Введение к работе
Актуальность проблемы. Фосфолшазная А<>_ активностьбыла об
наружена~пряктнческн~в1)~всех клетках организма. Внутриклеточные фосфолипази играют важную роль в метаболизме фосфолшшдов. В норие основная их функция заключается в обновлении кирно-кнслот-ного состава фосфолипидов, в соответствии с требованиями клетки в тех или иных физиологических условиях. При патологических состояниях эти ферменты активно вовлекаются как в компенсаторные, так и в деструктивные процессы, протекающие в клетке в ответ на повреждающие факторы.
В работа исследованы фоефолипазше Ag активности в шггохонд-риях печени крысы и в тромбоцитах крови человека. Интерес к этим ферментам обусловлен тем, что функционирование митохонпрнального фермента отражается на работе важнейшей энергетической системы клетки. Имеющиеся в литературе данные показывают, что в митохондриях при определенных патологических состояниях, приводящих к истощении запасов АТФ, увеличивается поток ионов Са . Повышение уровня свободного Са вызывает активацио фосфолипази Ар, которая гидрояизует эндогенные фосфолипиды, что в свое очередь приводит к увеличению протонной проницаемости внутренней мембраны митохондрий и к потере окислительно-фосфорилирупцих свойств митохондрий.
В тромбоцитах крови человека этот фермент регулирует выделение арахидоновой кислоты и биосинтез эйкозаноидов, участвуя тем самым в процессах тромбогенеза. Установлено, что при патологических ситуациях, таких как ишемическая болезнь сердца, атеросклероз и других заболеваниях, увеличивается уровень эндоперок-сидов и тромбоксанов, предшественником которых является арахицо-нозая кислота.
Несмотря на.актуальность проблемы, имеется немногочисленные сведения в этой области, что связано прежде всего с трудностью выделения и очистки данных ферментов, а также с нестабильностьв очищенного ферментного препарата. В связи с этим, необходимым этапом работы была разработка условий очистки и стабилизации ферментов.
Экспериментальные данные по определенно молекулярной массы ферментов, pll-оптимума, чувствительности к ионам Са и другий катионам, субстратной специфичности отличается не только п завн-
2 !
симости от степени чистоты ферментного препарата, но также от условий инкубации, методов тестирования фосфолипаэной активности, от использованных субстратов и других добавок, влияющих на протекание реакций. Подобные исследования является научной основой для выяснения механизмов развития патологических процессов, позволяет выявить коррегируощее действие различных активаторов и ингибито -ров данных реакций с целью профилактики и лечения сердечно-сосу -дистых и других заболеваний.
Тематика диссертационной работы определялась планами важней -ших работ Института и вьтолнялась в рамках Общесоюзной научно-технической программы: 0.69,01.02.04.Н."Исследование механизмов взаимодействия липосом с форменными элементами крови с целью профилактики внутрисосудистых осложнений атеросклероза и ИБО'.' JP Гос. регистрации 0.86.0009537.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методов выделения и очистки фосфолипаз Ао из митохондрий и тромбоцитов, исследование свойств ферментов как в интактном, иммобилизованном виде, так и в очищенной (свободной) форме.
В соответствии с .поставленной целью были определены следующие основные задачи:
-
Разработать-способы выделения и очистки фосфолипаз А^ из митохондрий печени крысы и тромбоцитов крови человека.
-
Исследовать свойства иммобилизованных и очищенных ферментов.
-
Изучить функциональную роль фосфолипаз в метаболизме клетки.
-
Разработать способы диагностики ИБС на основании полученных результатов. '
' Научная новизна работы. Впервые разработаны способы получения
высоноочищенных препаратов фосфолипаз А<> из митохондрий и тромбо
цитов на основе использованного биоспецифического адсорбента, где
лнгандом служил один из оптимальных субстратов фосфолипаз- фосфа-
тидилэтаноламин. . .
В результате этих экспериментов получены высокоочищенные ферменты, обладающие высокой удельной активностью и отличающиеся специфичностью к отдельным субстратам.
Исследованы свойства Очищенных ферментов. Очищенные фосфолипа-зы Ао обладали низкой стабильностью. В связи с этим разработаны
условия стабилизации ферментов путем их иммобилизации на биоспе-
цифичееком сорбенте. ,
Изучен механизм Са - регуляции ферментов. При использовании
селективных ингибиторов кальмоцулина показано, что эффекты ионов Са опосредуется кальмодулином. При этом было обнаружено, чтог ферменты взаимодействует с кальмодулином в отсутствии ионов Са +. Таким образом, первой стадией в механизме Са - регуляции' является образование комплекса кальмодулин-фермент, последующее присоединение ионов Са приводит к образованно активной формы фермента.
Установлено, что фосфолипазы Ао проявляют избирательность не только к классу фосфолипида, но и к жирнокислотному составу молекулы гидролизуемого субстрата.
В результате исследования свойств очищенного митохондриаль-ного фермента выявлено, что этот препарат обладает трансацилазной активностью. Только очищенный фермент с высокой удельной активностью катализировал реакции обмена ацильных радикалов. Несмотря на то, что эти реакции были энергонезависимы, СоА-производные жирных кислот также служили хорошим субстратом как и свободные жирные кислоты. Исследованы условия протекания этих реакций.
Впервые при исследовании субстратной специфичности тромбоци-тарной фосфолипазы в норме и при ишемической болезни сердца было обнаружено,изменение пула свободного арахицоната. При ИБС усиливается гидролиз фосфатидилхолина.
На основании результатов исследования активности фосфолипазы Ао в интактных тромбоцитах крови человека в норме и у больных ИБО разработан способ диагностики сердечно-сосудистых заболеваний, который может быть внедрен в_ клиническую практику.
Результаты проведенного исследования могут являться основой для развития перспективного научного направления - исследования регуляции фосфолипазной активности в клетках, с целью предотвращения и коррекции патологических процессов, приводящих к деструкции мембран и клетки в целом.
Основные положения, выносимые на защиту .
Среди основних результатов, выносящихся на защиту, следует выделить:
I. Метода выделения и очистки фосфолипаз А^ из митохондрий печени крысы..и тромбоцитов человека.
-
Разработка способа стабилизации ферментов.
-
Исследование механизма Са - регуляции очищенных фосфолипаз
-
Изучение специфичности ферментов к классу фосфолипида.
-
Выявление чувствительности фосфолипаз Ар к ацильному радикалу субстрата.
-
Экспериментальное исследование реакций трансацилнрования.
-
Разработка способа диагностики ИБО.
Теоретическая и практическая ценность. Основные результаты настоящей работы позволяют выявить новые стороны в механизме Са - регуляции фосфолипазной А^ активности, оказывающей влияние на физиологические процессы, происходящие в клетке. Использованные в работе подходы к выделение и очистке фосфолипаз Ао из митохондрий и тромбоцитов могут служить в научно-исследовательской практике для последующих разработок методов очистки мембраносвя-занных фосфолипаз из других источников к других белковых компонентов биологических мембран.
Разработанные способы стабилизации фосфолипаз могут быть использованы для стабилизации различных ассоциированных с мембраной ферментов и белков, для стабилизации которых необходимо гидрофобное окружение. Кроме того, с помощью этого метода можно моделировать в эксперименте условия in vCi/O , когда белковые полимеры находятся в связанном с фосфолипидами мембран состоянии.
Обнаружение субстрат-специфичных форм фосфолипаз вносит существенный вклад в классическую энэимологию, в понимание механизмов катализа на границе раздела фаз, в определение физиологической роли тех или иных фосфолипидов и их ацильньгх радикалов в функционировании мембранных структур. Эти исследования создают необходимую основу для разработок методов коррекции уровня свободных жирных кислот и лизосоединений в митохондриях и тромбоцитах, что в свою очередь приводит к ингибированию процесса тромбогенеза.
Исследования Са - регуляции фосфолипаз является важным этапом работы. Прежде всего эти исследования расширяют понимание.механизмов модулирования активности мембраносвязанных фосфолипаз А^ ионами Са , уровень которых изменяется в органеллах и в клетках при различных условиях. Установлено, что эффекты ионов Са + опосредованы кальмодулином. На основе исследований кальмодулиновой регуляции ферментов выявлены специфические ингибиторы фосфолипаз-
5 антагонисты кальмодулина. Ингибиторы кальмодулина могут бить рекомендованы и внедрены в лечебную практику в качестве фармаген -тов для коррекции^функционального состояния клетки при патологических условиях.
Изучение трансацилааных реакций, катализируемых высокоочи-щенным препаратом митохондриальной фосфолипаэы kg вносит вклад в фундаментальную науку о метаболизме фосфолипидов в клетке.' Эти эксперименты подтверждает наличие энергонезависимых, обратимых реакций обмена ацкльних радикалов и свидетельствуют о тесной взаимосвязи процессов гидролиза и обмена ацильных групп в молекулах фосфоглицерицов. Обнаруженное свойство очищенного митохондриаль-ного препарата катализировать обмен жирнокислотных радикалов может быть использовано для синтеза новых фосфолипидов.
Исследование активности фосфолипаз в интактных тромбоцитах и изменение соотношения активностей различных субстрат-специфичных форм фермента в норме и при патологии лежат в основе разработок ранней диагностики различных заболеваний и, в частности, ИБС.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены и доложены на: II Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мемб ран"(Ташкент, i960), III Конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Ташкент, І98І), ІУ Всесоозном симпозиуме по биохимии липидов (Киев, 1983), III Советско-Швейцарсксм симпозиуме "Биологические мембраны. Структура и функции" (Ташкент, 1983), Всесоозном симпозиуме "Молекулярные механизмы регуляции энергии" (Пущино, 1984), I Конференции биохимиков Узбекистана (Ташкент, 1986), 18 Конференции FB&S (Любляна, 1987), XII Всесоозном совещании по транспортным АТФазам (Иркутск, 1987), Всесоозном симпозиуме по биохимии липидов (Алма-Ата, 1907), УІ Всесоозном симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных процессов" (Петрозаводск, 1989), 35 Международной конференции по биохимии липидов (Абердин, 1994).
Публикация работ
По материалам диссертации опубликовано 25 научных работ. Получено 3 авторских свидетельства.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и ,i.. обсуждения (3 главы), описания материалов и методов исследования,
выводов, списка литературы, вклсчасщего 323 наименования. Объем диссертации " страница машинописного текста. Рисунков 54, таблиц 12.
