Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Патогенез ревматоидного артрита: современные представления (обзор литературы) 9
1.1. Современные представления о патогенезе ревматоидного артрита 9
1.2. Роль оксида азота в развитии воспалительного поражения опорнодвигательного аппарата 19
1.3. Феномен апоптоза и механизмы развития воспаления при ревматоидном артрите 28
1.4. Оксид азота как медиатор апоптоза при патологии опорнодвигательного аппарата 36
1.5. Рольцитокинов в развитии ревматоидного артрита 40
Глава II. Материал и методы 48
2.1 Клиническая характеристика больных 48
2.2 Методы лабораторного и инструментального исследования 51
Глава III. Роль апоптоза и NO-синтазной функции в развитии адьювантного артрита 61
Глава IV. Нитрооксидсинтетические механизмы воспаления у больных ревматоидным артритом 74
Глава V. Роль апоптоза в патогенезе ревматоидного артрита 92
Глава VI. Цитокиновый профиль и его взаимосвязь с NO-синтазной функцией и апоптозом у больных ревматоидным артритом 111
Заключение 119
Выводы 135
Практические рекомендации 137
Литература 138
Приложения 181
- Роль оксида азота в развитии воспалительного поражения опорнодвигательного аппарата
- Оксид азота как медиатор апоптоза при патологии опорнодвигательного аппарата
- Методы лабораторного и инструментального исследования
- Роль апоптоза и NO-синтазной функции в развитии адьювантного артрита
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Ревматические заболевания (РЗ) в последние годы привлекают все большее внимание ученых в силу своей высокой распространенности и социальной значимости. Поражая преимущественно лиц трудоспособного возраста, они приводят к ранней инвалидизации, имеют тенденцию к прогрессиро-ванию, значительно укорачивают продолжительность жизни. Среди РЗ особое теоретическое и медико-социальное значение имеет ревматоидный артрит (РА), классический пример хронических воспалительных заболеваний человека [29]. Ежегодно в Российской Федерации регистрируется около 300 тысяч больных РА, а болезненность по этому заболеванию по данным статистики составляет 2,75 на 1000 лиц 18 лет и старше [34; 36; 46].
Высокая социально-экономическая значимость РА связана с тем, что на лечение больных расходуются огромные средства, существенно превышающие бюджет других хронических заболеваний [17]. Распространенность РА в мире составляет 0,5 - 1% [35; 47; 127; 283]. Прямые медицинские затраты на лечение больных РА в США оцениваются, согласно различным источникам, от 3,7 до 8,6 млрд. долларов в год [65]. При этом пациенты, страдающие РА, используют ресурсы здравоохранения в значительно большей степени, чем страдающие другими заболеваниями внутренних органов. Так, в Швеции стоимость медицинского обеспечения больных РА в 2,5 раза выше, чем прямые затраты на обслуживание пациентов, не страдающих РА [151]. Показано также, что средняя продолжительность жизни при РА достоверно на 10 — 15 лет короче ожидаемой возрастных уровней, а 5-летняя выживаемость у больных с системными вариантами не превышает 50% [33]. Прогноз заболевания при РА со значительной деструкцией суставов сравним с таковым у больных атеросклеротическим поражением трех коронарных сосудов и у больных с IV стадией ходжкинской лимфомы [30].
Существенными звеньями или составляющими элементами борьбы с РЗ являются их своевременная диагностика, выяснение этиологии и патогенеза заболеваний, их профилактика и лечение. Многие аспекты этих вопросов при РА остаются неясными и, как следствие этого, сохраняется и по сей день запоздалая диагностика, хронизация течения, отсутствие надежной этиопато-генетической терапии, позволяющей в ранние сроки прервать прогрессиро-вание патологического процесса и, тем более, привести к регрессу наступивших патологических органических изменений. Исследования в этом направлении не потеряли актуальности.
Проведенный анализ литературы показал, что развитие научно-обоснованной концепции патогенеза РА за последние годы достигло заметных успехов. Они связаны, главным образом, с выяснением ряда важных патогенетических звеньев аутоиммунного процесса, свойственного этому заболеванию, и возможностью их нейтрализации с помощью специфических антител. В то же время, несмотря на установление множества существенных патогенетических деталей, удовлетворительной общей концепции патогенеза РА не существует, что иллюстрируется недостаточной клинической эффективностью используемых терапевтических подходов [41].
Раскрытие механизмов гиперплазии синовиальной оболочки, сопровождающейся появлением пренеопластических характеристик у синовиальных макрофагов и фибробластов в виде экспрессии протоонкогенов и особой ин-вазивности [290] невозможно без уточнения следующих проблем:
- роль апоптоза в развитии РА на ранней и поздней стадиях патологического процесса;
- роль NO-синтазной компоненты на разных этапах развития РА;
- взаимосвязь продукции оксида азота и апоптоза в процессе эволюции РА;
- взаимоотношения цитокиновой сети с феноменом апоптоза и продукцией оксида азота при РА.
Изучение этих механизмов даст новое, более целостное, концептуальное представление о патогенезе РА, особенно ранних стадий, что позволит разработать более эффективные методы прогнозирования, мониторинга и лечения этого тяжелого заболевания.
Цель работы: определить значение апоптоза и оксида азота в механизмах развития ревматоидного артрита и оценить возможность прогнозирования течения, эффективности проводимой терапии.
Задачи исследования:
1. Изучить состояние и динамику NO-синтазной функции у больных РА.
2. Определить роль про- (Fas, р53) и антиапоптотических (Вс1-2) механизмов в развитии РА.
3. Установить характер изменения нитрооксидпродуцирующей функции клеток синовиальной оболочки в условиях экспериментального адъю-вантного артрита.
4. Выяснить роль апоптоза (Fas, р53, Вс1-2 опосредованные звенья) в развитии экспериментального адъювантного артрита.
5. Оценить взаимосвязь между нитрооксидпродуцирующей функцией, феноменом апоптоза и цитокиновым профилем у больных РА.
6. Установить соотношения между продукцией оксида азота, апоптозом, синтезом цитокинов и клинико-лабораторными характеристиками РА.
7. Установить влияние различных терапевтических программ на нитроок-сидпродуцирующую функцию, апоптоз, цитокины у больных РА.
Научная новизна работы.
В настоящей работе проведено комплексное исследование синтеза оксида азота и апоптоза у больных РА.
Впервые выявлены специфические особенности экспрессии про- и анти-апоптотических маркеров на ранней и поздней стадиях патологического процесса, что проясняет роль апоптоза в эволюции РА.
Впервые установлена протективная роль индуцибельной нитрооксид-синтазы в развитии аутоиммунного воспаления суставов.
Представлены в динамике взаимоотношения между продукцией оксида азота, апоптозом и цитокиновым профилем, что позволило выяснить новые звенья патогенеза РА.
Продемонстрирована возможность прогнозирования степени тяжести и течения РА путем мониторинга маркеров апоптоза (Bcl-2, sFas).
Оценена динамика нитроксидсинтетической функции, апоптоза и цито-кинового профиля в зависимости от проводимой терапии. Показана возможность использования гистохимических и иммуноцитологических показателей для объективизации контроля за эффективностью проводимой терапии.
Практическая ценность.
Проведенные исследования показали, что установленная закономерность экспрессии Вс1-2, р53 и sFas молекул апоптоза на ранних и поздних стадиях РА позволяет прогнозировать течение патологического процесса и, соответственно, подбирать адекватные терапевтические программы.
Доказанная протективная роль индуцибельной нитрооксидсинтазы на ранних стадиях аутоиммунного воспаления суставов определяет нецелесообразность использования в лечебных схемах селективных блокаторов последней и определяет необходимость синтеза противовоспалительных препаратов доноров оксида азота.
Продемонстрирована способность некоторых базисных препаратов инициировать апоптоз синовиальных клеток и положительно влиять на цитоки-новый профиль у больных РА.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Интенсивность апоптоза клеточных элементов синовиальной оболочки значительно различается на ранней и поздней стадиях развития РА.
2. Основным механизмом, определяющим активность апоптоза на разных стадиях эволюции РА является различный уровень экспрессии молекул р53, Вс1-2 и sFas.
3. Активная фаза РА сопровождается присутствием в синовиальной оболочке всех трех изоформ NOS с различным паттерном экспрессии в зависимости от длительности течения заболевания.
4. Цитокиновый профиль синовиальной жидкости на разных стадиях РА отличается гетерогенностью и наличием связей с нитрооксидпродуци-рующей функцией синовиальной оболочки, а также клиническими индексами активности заболевания.
5. Определение активности про- и антиапоптотических молекул, метаболитов оксида азота, цитокинов синовиальной жидкости у больных РА позволяет прогнозировать течение заболевания и эффективность проводимой терапии.
Роль оксида азота в развитии воспалительного поражения опорнодвигательного аппарата
NO образуется в модифицированном цикле мочевины, который имеет две важные функции: инкреторную, смысл которой состоит в восстановлении L-аргинина для постоянного синтеза NO; экскреторную, для выведения из организма избытка азота, одного из конечных продуктов клеточного метаболизма. Первый шаг синтеза NO заключается в окислении аминокислоты аргинина с одновременным синтезом другой аминокислоты цитруллина под влиянием фермента нитрооксидсинтазы (NOS). NOS — это сложно-устроенный фермент, представляющий собой гомодимер, то есть состоящий из двух одинаковых белковых субъединиц, к каждой из которых присоединено несколько кофакторов, определяющих каталитические свойства фермента.
NO-синтазы составляют группу ферментов различающихся по аминокислотной последовательности белковой части молекулы и механизмам, регулирующим их активность, но тем не менее катализирующих одну и ту же реакцию превращения аминокислот с образованием оксида азота. Синтезировать и выделять NO способно большинство клеток организма, но наиболее хорошо изучены три клеточные популяции: эндотелий кровеносных сосудов, нейроны, макрофаги - клетки соединительной ткани, обладающие высокой фагоцитарной активностью. В связи с этим, традиционно выделяют три изо-формы NO-синтаз: нейрональную, макрофагальную, эндотелиальную (соответственно n-NOS, i-NOS, e-NOS). Нейрональная и эндотелиальная изофор-мы фермента постоянно присутствуют в клетках и называются конститутивными, а вторая изоформа (макрофагальная) является индуцибельной - фермент синтезируется в ответ на определенное внешнее воздействие на клетку.
Нейрональная конститутивная NO-синтаза I типа (n-NOS) экспресси-руется в нейронах. Изофермент представляет собой гомодимер, состоящий из двух одинаковых субъединиц и характеризуется обратимым связыванием? с кальмодулином. Более 50% аминокислотной: последовательности n-NOS идентичны редуктазе цитохрома Р-450. Регуляция активности nNOS и ее посттрансляционная модификация посредством фосфорилирования требует участия ионов Са . Функциональная связь активности энзима с NMDA-рецептором опосредуется; специальным белком; PSD-95 (белок постсинапти-ческого уплотнения), который, утилизирует проходящие через рецепторный канал ионы Єа?+, направляя их-..на активный центр NOS [43].
Индуцибельная;макрофагальнаягМ0-синтаза IlTHna(i-N0S);находится преимущественно в растворимой форме: Менее! зависимая от ионов Оа т кальмодулина, она отличается от n-NOS и e-NOS своей-первичной; структурой; Как и конститутивные изоформы, i-NOS содержит кальмодулинсвязы-вающий участок (аминокислотные остатки 503-532) и может экспрессиро-ватьсягв глиальных клетках.[146]..
Активность эндотелиальной конститутивной NO-синтазы III; типа (е-NOS) так же как и n-NOS зависит от внутриклеточной концентрации ионов; Єа и характеризуется обратимым- связыванием с кальмодулином. 57% аминокислотной; последовательности e-NOS и n-NOSr идентичны; а.их отличиям заключаются;в N-концевом локусе. e-NOS представляют мембраносвязанная и растворимая формы; первая,, очевидно,, имеет большее значение для механизмов трансдукцитМЭ; связанных с перестройкой напряжения и ускорением локального кровотока. Активность обеих фракций e-NOS; их модуляция;и посттрансляционная; модификация? регулируются процессами фосфорилирования и миристилирования: Иммунореактивная; e-NOS может экспрессиро-ваться в нейронах и астроцитарной глии [43].
В 1989- году впервые была описана NO-синтаза: мозга; крыс, катализирующая NADPH-зависимое образование оксида азота [40]1 Оказалось, что нейрональная NADPH-диафораза и Са Укальмодулин-зависимая NO-синтаза солокализованы [142]; При этом NOS как член дегидрогеназа-электрон-трансферазной группы ферментов обладает диафоразной активностью, пере носит электрон с NADPH на одноэлектронный акцептор и катализирует эк-вимолярное образование NO и L-цитруллина из L-аргинина. Нейрональная NOS - мембрано-связанный фермент и в отличие от лабильных неспецифических дегидрогеназ наиболее стабилен при фиксации, вот почему гистохимический метод выявления NADPH-d на фиксированных срезах можно считать вполне адекватным для диагностики нейрональной изоформы NOS. Получены данные, что i-NOS-иммунореактивность и NADPH-диафоразная позитивность обнаруживается в одних и тех же зонах и типах клеток синовиальной оболочки при РА [252].
Экспрессия i-NOS и повышенный синтез N0 впервые были продемонстрированы в моделях органоспецифических аутоиммунных заболеваний in vivo, таких как экспериментальный аллергический энцефаломиелит и имму-нологически опосредованный диабет у мышей без признаков ожирения [90; 91]. Далее, в нескольких моделях артритов на животных, включая линию мышей MRL//pr, адьювантный артрит, коллаген-индуцированный артрит, также была обнаружена экспрессия i-NOS и повышение продукции NO [78; 296; 327]. Дебют экспериментального артрита был предотвращен применением ингибитора i-NOS, L-NMMA, что позволило высказать предположение о возможной ключевой роли N0 в развитии и персистировании воспаления в этих моделях.
Экскреция нитратов с мочой у больных ревматоидным РА превышала в 2,7 раза таковую в сравнении с группой здоровых людей и уменьшалась при назначении преднизолона [299]. Однако, величина экскреции нитратов не коррелировала с уровнем С-реактивного белка, скоростью оседания эритроцитов, суставным счетом, продолжительностью утренней скованности. Коэффициент соотношения нитраты/креатинин в моче также оказался существенно повышенным (более чем в три раза) при РА [121].
Исследования концентрации нитритов в сыворотке крови у больных РА, анкилозирующим спондилоартритом и остеоартрозом (ОА) аналогично выявили повышение последних в сравнении с контролем, соответствующим по возрасту и полу [100; 238].
Оксид азота как медиатор апоптоза при патологии опорнодвигательного аппарата
Количество сигнальных: путей, эффекторных механизмов» и мессендже-poBj участвующих в феномене программированной клеточной смерти поистине огромно; Центральное место среди них занимает оксид азота (NO);, универсальная; молекула;,., значение которой в развитии программированной смерти клеточных элементов: су ставныхтканей до сихпоростается не ясным.
Известно, что; воспалительные и дегенеративные заболевания, опорно-двигательного аппарата характеризуются? повышенной продукцией; N0. Отчасти это объясняется повышенной зкспрессиеШі-ЖЖ [ 100; 133]:,
Топография экспрессии; i-NOS в тканях; суставов совпадает с локализацией зон:апоптоза при;РА и это, прежде всего, покровный;слой синовиальной оболочки;:и;хондроцитьь[ 105].. Установлено, что N0 является прямым медиатором апоптоза хондроцитов и; синовиальных фибробластов; при РА [59;;316].
Удалось показать,, что ингибитор i-NOS Ь-Ыс-монометиларгинин (L-NMMA) предотвращал апоптоз. Этот эффект отменял донор NO S-нитрозо-ацетил-пеницилламин; Получены данные, подтверждающие; свойство NO снижать энергопродукцию в митохондриях хондроцитов, что? приводило к уменьшению синтеза протеогликанов [309];
Возможные механизмы реализации апоптогенного эффекта NOв суставах многообразны. Среди них способность, NO ингибировать окислительное фосфорилирование в митохондриях клеток-мишеней [141]. Как следствие подавления электронного транспорта в митохондрии увеличивается количество1 супероксида параллельно с образованием пероксинитрита, который необратимо подавляет ферменты дыхательной цепи, нитрозилируя их и отнимая железо [213]. Подавление митохондриального дыхания приводит к падению трансмембранного потенциала, что является сигналом запуска; апоптоза [67]. Репертуар активности пероксинитрита включает также нитрозилирование гуанинал; разрывы цепочек ДНК, что может приводить к. мутациям или инициации процессов апоптоза [95], N0 может непосредственно активировать открытие: гигантской поры, что приводит к выходу цитохрома; С и запуску каспазного каскада [273]. N0 и его1 производные вызывают перекисное окисление фосфолипидов и окисление тиольных. групп; белков митохондри-альной мембраны, что» также сопровождается высвобождением в цитозоль апоптогенных факторов [313].
Представляют интерес данные о влиянии NO на: экспрессию р53. Белок р53; подавляет рост опухолей, поддерживает целостность-генома и может вызывать остановку клеточного цикла или апоптоз; р53 индуцирует экспрессию Вах, Fas р53А1Р (apoptosis inducing protein) и других апоптогенных белков, а: также сам перемещается в митохондрию при-апоптозе [209]; Концен-трацияр53 в клетке в обычных условиях очень мала; Повреждение ДНК ведет к- повышению уровня р53. В-экспериментах на- макрофагах: и клетках ин-сулиномы RINmSF гибель клеток, вызванная? N0, приводила к накоплению р53 [74]. Выяснилось, что Ь-NMMA подавляет накопление р53, вызванное действием цитокинов или липополисахарида, что- указывает на активную» роль N0 в стимуляцишэкспрессии р53; Некоторые авторы,считают, что этот эффект NO может быть связан с: его- способностью; подавлять функциониро-вание;протеосомы;р18]!.
В; других работах обнаружено существование в клетках человека; обратной связи между NO"и р53: повреждение ДНК, вызванное:накоплением N0; активирует экспрессию р53, а он репрессирует ген i-NOS человека [181]. Возможно,, существуют р53-независимые пути при NO-индуцированном апоптозе: NO подавляет экспрессию i-NOS путем ослабления активности транскрипционного ядерного фактора NFkB в гепатоцитах [308]. Ряд авторов сообщает о защитном эффекте NFkB при NO-зависимой клеточной смерти [92; 100].
Вышеперечисленные особенности взаимодействия между р53 и NO найдены при патологии суставов. Показано, что локализация i-NOS в тканях сустава при РА совпадает с таковой у высокочувствительного рецептора фактора роста нервов (NGF) trkA [245]. Можно предположить, что все этапы NGF-зависимой передачи сигнала активированы при РА, включая N0 и р53. Выявлено, что снижение экспрессии р53 сопровождается падением интенсивности NO-зависимого апоптоза синовиальных фибробластов [59]. Оказалось, что мишенью апоптоза при ОА является не только хрящ, но и синовиальная оболочка. Синовиальные фибробласты, после инкубации в течение 24 часов с N0 в значительной степени подвергались апоптозу. Параллельно, возрастала экспрессия р53, что может свидетельствовать о его протективном эффекте при ОА [67]. Апоптоз синовиальных фибробластов при ОА опосредуется NO-индуцируемой активацией тирозин киназы [152]. Другие исследователи приводят данные о заинтересованности митоген-активированных протеинки-наз МЕК 1/2 и р38, которые несут ответственность за увеличение экспрессии i-NOS и циклооксигеназы-2 [244].
Такими путями достигается жесткая регуляция синтеза NO, что предупреждает его повреждающее действие на ткани суставов.
Методы лабораторного и инструментального исследования
До и на фоне лечения исследовали уровни интерлейкинов 1(3, 6, 10, TNF-а а также концентрацию растворимого рецепторов sFas в сыворотке крови, синовиальной жидкости больных, полученной при пункции коленного сустава. Определяли нитрат - и нитрит - ионы в биологических жидкостях: сыворотке крови, моче, синовиальной жидкости.
С помощью гистохимического, иммуноцитохимического и общеморфологического методов исследовали образцы синовиальной оболочки коленного сустава 70 женщин и 8 мужчин в возрасте 25 - 56 лет с диагнозом РА. Материал получали во время артроскопии и синовкапсулэктомии, проведенных согласно показаниям (непрерывно рецидивирующий синовит коленного сустава в течение не менее чем 2 месяцев). Информационное согласие было получено от всех пациентов. Работа была утверждена Комитетом по этике научных исследований Владивостокского государственного медицинского университета.
В качестве контроля использовались образцы синовиальной оболочки и хряща 7 здоровых мужчин европеоидной расы в возрасте от 21 до 50 лет, погибших от комбинированной травмы (забор материала производился в течение не более 2 часов после наступления смерти), а также кровь и моча 40 здоровых доноров (28 женщин и 12 мужчин в возрасте от 18 до 63 лет). Забор синовиальной жидкости для контроля проведен у 10 пациентов (4 мужчины и 6 женщин в возрасте от 25 до 55-лет) во время эксплоративной-артротомии -коленного сустава по поводу предполагавшегося повреждения менисков. Образцы сыворотки крови и синовиальной жидкости немедленно после забора замораживались при температуре - 70С.
Экспериментальная часть исследований включала создание модели адь-ювантного артрита на линейных мышах. В соответствии с поставленными задачами в качестве объекта исследования выбрана линия мышей С57В1аск6, для которых характерен иммунный ответ с активацией ТЫ субпопуляции лимфоцитов. В ходе эксперимента изучались морфологические изменения в тканях коленного сустава мышей, Проводилось определение активности NADPH-диафоразы и иммуноцитохимические исследования с целью выявления локализации конститутивной (n-NOS) и индуцибельной изоформ (i-NOS) NOS, атак же маркеров апоптоза- Вс1-2 и р-53 (Табл. 4).
Работа выполнена на 22 взрослых самцах мышей весом по 80-1 Юг. Животным параартикулярно (коленный сустав) вводилось по 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда. В качестве контроля использовались 10 интактных мышей этой же линии.
Полный адьювант Фрейнда представляет собой взвесь убитых термической обработкой микобактерий туберкулёза (MAFF) в минеральном масле (SIGMA) и широко используется для индукции артрита, подобного ревматоидному у экспериментальных животных [58; 83; 169].
Адьювантный артрит сопровождается типичной аутоиммунной реакцией, основным звеном которой является Т-клеточный иммунитет [42; 168; 236].
Мыши содержались в одинаковых условиях вивария при 12 часовом дневном и 12 часовом ночном цикле в течение 30 дней. Пища и вода давались ad libitum. Животных выводили из эксперимента по две на 7 и 30 сутки после введения адьюванта. Эвтаназию животных осуществляли путём дека-питации под тиопенталовым наркозом. Забор материала производился в течение 10 минут, задние лапки мышей были ампутированы и фиксированы в 3% растворе параформальдегида приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) в течение часа, затем хранились при комнатной температуре в де-кальцинирующем растворе, содержащем 5,5 ЭДТА, 90 мл дистиллированной воды и 10мл 10% формалина. Процесс декальцинации занял 9 недель, при этом раствор обновлялся каждые 7 дней. После фиксации и декальцинации часть материала заливали в парафин для изучения морфологических изменений по общепринятой методике, часть образцов промывали в 30% растворе сахарозы на фосфатном буфере (рН7,4) в течение 12-24 часов при t 4С, подготавливая для иммуноцитохимических и гистохимических исследований.
Материал для общемор.фологических и иммуногистохимических исследований сразу после забора в течение 2-х часов фиксировали в 4% параформальдегіде, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) при температуре 4С, затем сутки промывали в 30% забуференном растворе сахарозы при той же температуре для криостатных срезов. Готовили серийные срезы толщиной 50 мкм (для проведения гистохимической реакции на NADPH-d) и 20 мкм (для проведения иммуногистохимической реакции) во фронтальной плоскости на криотоме. Часть материала заливали в парафин по общепринятой методике.
Парафиновые срезы интраоперационных образцов и тканей и полученных в ходе эксперимента на мышах, окрашивали гематоксилином и эозином для интерпретации морфологических изменений.
Роль апоптоза и NO-синтазной функции в развитии адьювантного артрита
В синовии мышей обнаруживаются неоднородная локализация NOS-позитивных и апоптотических клеток, количество и плотность которых коррелируют с длительностью воспалительной реакции. В синовиальной оболочке у контрольных животных NADPH-d экспрессируется в цитоплазме си-новиоцитов и эндотелии капилляров. В покровном слое синовиоциты наиболее многочисленны. Здесь они выявляются в виде пласта из однотипных по структуре и форме элементов, тесно прилежащих друг к другу (рис. За). В субпокровном уровне NADPH-d-позитивные клетки практически отсутствуют, однако их количество постепенно увеличивается по направлению к глубокому стромальному слою (Рис. 36). В глубине синовии превалируют полиморфные рыхло расположенные клетки, не имеющие какой-либо определенной тенденции в ориентации перикариона. Количественные особенности распределения клеток по слоям синовии соотносятся с изменениями степени активности энзима. Аналогичное распределение по слоям и клеткам синовиальной оболочки показывает c-NOS (Рис. Зв).
В ответ на введение адьюванта в синовиальной оболочке развивается картина аутоиммунного воспаления, которая характеризуется появлением плазмо-лимфоцитарных инфильтратов, гипертрофией ворсин и подрастанием интерстициальных микрососудов в процессе становления хронической воспалительной реакции. При окрашивании срезов гематоксилином и эозином на ранних стадиях воспаления (первые семь дней) наблюдается преобладание дистрофических и деструктивных изменений синовии. К ним относятся очаги фибриноидного пропитывания с «запылением» ткани фрагментами разрушенных ядер и цитоплазмы синовиоцитов. В составе воспалительных инфильтратов отмечаются мононуклеарные лимфоциты, цитолиз фибробласти-ческих элементов и деструктивные васкулиты (Рис. 4).
На поздней стадии экспериментального артрита (20 - 30 дней от начала введения адьюванта) в воспаленной синовиальной оболочке начинают доминировать пролиферирующие фибробласты и гистиоциты (макрофаги) с многочисленными внутри плазматическими включениями {Рис. 5). Последние, вероятно, представляют вторичные лизосомы. Эти особенности - несомненный показатель активности процесса, дебют которого начинается с антител-зависимой пролиферации плазмоцитов и макрофагов. Другим показателем является появление в структурах синовии индуцибельной изоформы NOS.
При иммуноцитохимической обработке срезов синовиальной оболочки нами обнаружено, что в начальной фазе адьювантного артрита количество синовиоцитов, экспрессирующих i-NOS, постоянно увеличивается, достигая максимума на 7 - 14 день воспаления. Большинство клеток локализуется в покровном и стромальном слоях, они имеют разнообразную форму и величину (Рис. 6). Сравнительный анализ показывает, что относительное количество i-NOS-иммунопозитивных синовиоцитов резко отличается от численности клеток, содержащих n-NOS (Табл. 5). Аналогичным образом колеблется ак тивность NADPH-d. Оптическая плотность формазанового преципитата в си-новиоцитах, если судить по количеству и окраске преципитата, превосходит показатели гистохимической реакции в контрольной группе животных (Табл. 6). Однако хронический артрит (25 - 30 день от начала введения адьюванта) характеризуется уже значительным снижением количества i-NOS-иммунореактивных элементов, что закономерно сопровождается усилением экспрессии конститутивного изофермента и NADPH-d в соответствующих клеточных популяциях.
