Введение к работе
Актуальность проблемы. Рассеянный склероз является самой частой
неврологической причиной инвалидизации лиц трудоспособного возраста (25 -
40 лет), за исключением травматических поражений (Lassman et al, 2001), что
определяет актуальность его изучения. Рассеянный склероз является
хроническим аутоиммунным заболеванием нервной системы, протекающим с
поражением белого вещества головного и реже, спинного, мозга, что
сопровождается образованием очагов воспаления и демиелинизации (Тгарр
B.D. et al, 1999). Заболевание в типичных случаях характеризуется
хроническим, рецидивирующе-ремиттирующим, течением с последующим
вторичным прогрессированием, сопровождающимся накоплением
органических неврологических нарушений. (Lassman Н. et al, 2001) Основными чертами патоморфологии Р.С. являются наличие очагов демиелинизации, олигодендроцитарной гибели и аксональной дегенерации (Prineas and McDonald 1997), а так же наличие глиалыгых очагов. Полагают, что под воздействием инициирующего события, в роли которого могут выступать инфекционные (Steiner L, 2001), средовые и генетические (Compston A, et al 2002) факторы, происходит реактивация аутореактивных клонов преимущественно Т-лимфоцитов, нарушению гематоэнцефалического барьера с последующим развитием иммунно-опосредованного воспалением и демиелинизацией (Silber Е., ShariefM.K., 1999).
Несмотря на более чем вековую историю изучения проблемы, оценка степени активности воспалительно-демиелинизирующего процесса представляет серьёзную проблему. Диагностика осуществляется с помощью совокупности клинических критериев (Poser 1983) а так же посредством магнитно резонансной томографии (М.Р.Т.). Наличие клинически не проявляющихся обострений, (Kraus J. et al, 2002), необходимость повторного динамического наблюдения с применением специальных контрастирующих методик MPT (Miller D.H., et al., 1996) затрудняет процесс диагностики и делает юиск лабораторных маркеров активности воспалительного процесса особенно актуальным. Среди всего многообразия эффекторных молекул, принимающих участие в повреждении олигодендроцитов, оксид азота играет особо важную роль. Являясь продуктом синтеза семейства синтетеаз оксида азота (NOS) из аминокислоты Л-аргинина, NO потенциально нейротокичен (Dawson et al., 1994), способен оказывать прямое токсическое действие на культивируемые олигодендроциты. Биоптаты больных рассеянным склерозом содержат повышенное содержание iNOS м РНК по сравнению с интактными зонами мозга (Bagasra О. et al., 1995), что позволяет считать продукты окисления NO перспективными кандидатами на роль индикаторов активности заболевания.
Совокупность эпидемиологических (частота встречаемости рассеянного склероза по данным ВОЗ составляет 1:1000 среди населения северной Европы) и этических причин послужила стимулом для изучения роли оксида азота в патогенезе аутоиммунных заболеваний нервной системы на экспериментальной модели рассеянного склероза - экспериментального^ауюнммумиш и лтпгафало-миелита (Э.АЭ.), который развивается под воздеирШіЄмІШМтйЗаіши воспри-
имчивых видов животных различными антигенами (V&RSffey ^TLL?
переносом CD4+T клеток (Ben Nun et al., 1981, Pattinelly et al, 1981) и проявляется параличами конечностей и хвоста, нарушениями зрения и атаксией. Способность ингибиторов NOS модулировать клиническое течение экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита известна с работ Koprowski (1993), однако механизм действия остается не известным. Известно (Cross et al, 1994, Zhao et al, 1996), что назначение аминогуанидина приводило к улучшению клинического течения экспериментального аутоимунного энцефаломиелита на мышах и крысах (Brenner et al., 1997, Zielasek et al, 1995). В то же время назначение N(omega) -nitro-L-arginine-methylester способствовало утяжелению заболевания и повышению летальности (Ruuls et al, 1996, Gold et al, 1997). Более того, назначение NMA PVG крысам привело к развитию тяжелого энцефаломиелита у животных, считавшихся полностью резистентным к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (Cowden et al., 1998, Willenborg et al, 1998). Следует так же отметить, что все упомянутые модели являются монофазными, со слабой выраженностью демиелинизации, а, следовательно, не вполне адекватными для изучения рассеянного склероза. Таким образом, изучение последствий назначения ингибиторов iNOS на крысах Dark Auguti, иммунизированных миелиновым олигодендроцитарным белком, представляется актуальным.
Поскольку мишенью аутоиммунно-опосредованного воспаления при рассеянном склерозе и экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите являются олигодендроциты, то изучение механизмов, лежащих в основе процессов ремиелинизации является.актуальным. В случае усиления процессов ремиели-зации возможно восстановить утраченные неврологические функции, предотвратить аксональное повреждение и прогрессирование неврологических симптомов. Присутствие ремиелинизации было доказано для многих экспериментальных моделей травматического и аутоиммунного повреждения (Bornstein М.В. and Raine C.S. 1969, Blakemore et al, 1974; Linington et al, 1988; Rodriguez et al, 1992; Reynolds and Wilkin, 1993; Carroll and Jennings, 1994), однако источники клеток - предшественников олигодендроцитов по прежнему неизвестны. Идентификация нейрональных стволовых клеток, как самоподдерживающейся, полипотентной популяции, способной дифференцироваться в астроциты, олигодендроциты и нейроны, и реагирующей на повреждение Ц.Н.С. пролиферацией и миграцией, открывает новые возможности для изучения роли этих клеток в патогенезе экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.
Цель исследования - оценить роль оксида азота и участие нейрональных стволовых клеток в патогенезе экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и рассеянного склероза.
Задачи:
1. Исследовать особенности системного метаболизма оксида азота в ходе течения экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и у больных рассеянным склерозом, и, сопоставив динамику клинической картины заболевания с изменениями концентрацией продуктов окисления оксида азота в лик-
воре и сыворотки крови, выяснить, может ли содержание нитритов в ликворе и сыворотке крови служить индикатором активности воспалительного процесса..
Изучить влияние интравентрикулярного и системного введения ингибитора синтетазы оксида азота на клиническое течение и степень выраженности воспаления при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.
Исследовать влияние ингибитора синтетазы оксида азота на степень выраженности Т-клеточного иммунного ответа в динамике экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.
Оценить влияние ингибитора синтетазы оксида азота на В-клеточное звено иммунного ответа в динамике экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.
Изучить реакции и изменения нейрональных стволовых клеток при развитии аутоимуно опосредованного воспаления и демиелинизации при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.
Научная новизна работы. Продемонстрировано наличие корреляции между клинической картиной заболевания и концентрацией нитритов в ликворе от больных рассеянным склерозом.
На экспериментальной модели рассеянного склероза продемонстрирована возможность ослабления клинических проявлений экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита посредством интравентрикулярного и системного введения эфира нитрометиларгинина (L-NAME). Показано его влияние как противовоспалительного агента применительно к экспериментальному аутоиммунному энцефаломиелиту. Впервые продемонстрировано влияния ингибиторов синтетазы оксида азота на специфический и неспецифический иммунный ответ. Изучены особенности метаболизма оксида азота на фоне перенесения Э.А.Э.
Исследована реакция нейрональных стволовых клеток на развитие очагов демиелинизации в спинном мозге при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.
Практическая значимость работы. Показана возможность использования продуктов окисления оксида азота в качестве лабораторного маркера активности воспалительно демиелинизирующего процесса у больных с рассеянным склерозом. Изучены последствия терапевтического использования ингибиторов синтетазы оксида азота на экспериментальной модели рассеянного склероза. Идентифицированы источники ремиелинизации при ЭАЭ., которыми являются нейрональные стволовые клетки.
Основные положения, выносимые на защиту:
Продукты окисления оксида азота в ликворе являются маркером активности воспалительного процесса при рассеянном склерозе.
Интратекальное и системное назначение L-NAME приводит к ослаблению клинических проявлений экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита на крысах Dark Agouti, и подавлению процессов воспаления и демиелинизации. Интратекальное и системное назначение NOS ингибиторов оказывает мо-
дулирующее влияние на интенсивность Т клеточного иммунного ответа, смещая баланс Thl/Th2 в сторону преобладания Th2 клеток.
В ответ на развитие экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита происходит активация нейрональных стволовых клеток, которые пролифери-руют, мигрируют из внутренней стенки центрального канала спинного мозга в очаги демиелинизации и дифференцируются в олигодендроциты, являясь эндо-геннным источником ремиелинизации.
В процессе миграции нейрональные стволовые клетки подвергаются прямой макрофагальной атаке, что может служить причиной незавершенной ремиелинизации при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.
Личный вклад автора в проведенное исследование. В процессе работы автором самостоятельно выполнены: постановка задач, планирование и выполнение экспериментов; измерение продуктов окисления оксида азота в ликворе и сыворотке крови; статистическая обработка полученных данных; воспроизведение экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита; стереотаксиче-ские инъекции и установка осмотических минипомп; секционная работа с последующим патоморфологическим анализом; иммуннофлуоресцентная и конфокальная микроскопия; анализ фактического материала полученного в процессе исследования, написание и оформление диссертации, формулирование выводов.
Апробация работы. Результаты работы доложены на Всемирном конгрессе в Праге «Second International conference in Biology, Chemistry and therapeutic Application ofNitric Oxide" в 2002 г. и на международной конференции в Санкт-Петербурге «Joint Research Training Program with Karolinska Institutet and St. Petersburg Medical Schools» в апреле 2003. По теме диссертации опубликовано 3 статьи в ведущих международных медицинских журналах.
Внедрение результатов исследования. Основные положения диссертационного исследования включены в учебную программу кафедры патофизиологии Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии.
Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, главы обсуждения результатов и выводов. Список литературы включает 298 источников (из них 25 отечественных и 273 зарубежных источников). Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 19 рисунков.
