Введение к работе
Актуальность. Одним из важных патогенетических факторов опухолевого роста, как известно, является дефектность иммунного ответа и, как следствие, развитие иммуносупрессии. Вклад в этот процесс вносят, с одной стороны, опухолевые клетки, которые сами продуцируют различные иммуносупрессорные цитокины [Fu Y.X. et al., 1991; Oghiso Y. et al., 1993]. С другой стороны, при опухолевом росте возрастает продукция иммуносупрессорных цитокинов лимфоцитами, дендритными клетками, макрофагами и др. [Alleva D.G. et al., 1994; Huang M. et al., 1998; Radoja S. et al., 2000]. Кроме того, источником иммуносупрессорных цитокинов могут быть незрелые гемопоэтические клетки различных ростков кроветворения - естественные супрессорные клетки (ЕСК). ЕСК - крайне неоднородная популяция клеток нулевого фенотипа, обладающих способностью подавлять функции иммунокомпетентных клеток неспецифически (без предварительного контакта с мишенями, не требуя рестрикции по антигенам комплекса гистосовместимости) [Michelson J.D. et al. 1988; Noga S.J. et al. 1988; Saffran D.C. et al. 1991; Hoskin D.W. et al. 1992; Sugiura K. et al. 1992].
ЕСК обладают широким спектром иммунодепрессивного действия: подавляют митоген- и антиген-индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов, утилизацию ИЛ-2 и образование ЦТЛ; ингибируют пролиферацию и продукцию IgM В-лимфоцитами в ответ на ЛПС, а также выработку специфических антител на эритроциты барана и на опухолевые антигены; снижают активность НК и продукцию ФНО-сс макрофагами [Nicoletti G. et al., 1985; Subiza J.L. et al., 1989; Young M.R. et al., 1988; Young M.R. et al., 1990; Young M.R. et al., 1994]. В то же время, ЕСК обладают способностью оказывать выраженное цитостатическое действие in vitro на опухолевые клетки [Sugiura К. et al., 1990; Seledtsov V.I. et al., 1995].
В основе механизма иммуносупрессорного действия ЕСК лежит, как правило, секреция ими супрессорных факторов, таких как трансформирующий фактор роста бета (ТФР-Р), оксид азота (NO), простагландины, некоторые нуклеозиды и другие, в
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА , | СІ ОЭ
4 том числе еще не идентифицированные вещества [Moore S.C. et al., 1992; Belsky Y.P. et al., 1993; Angulo I. et al., 1995; Kusmartsev S.A. et al., 1995; DeKoter R.P. et al., 1997; Yanagie H. et al., 1997; Mori T. et al., 1998]. Основным супрессорным фактором ECK интактного костного мозга является оксид азота [Angulo I. et al., 1995], при опухолевом росте - ТФР-бета [Young M.R.I, et al., 1990; Young M.R.I, et al., 1992]. В последнее время появились сообщения о том, что фактором ЕСК при опухолевом росте может быть оксид азота [Kusmartsev S.A. et al., 2000, Gabrilovich D.I. et al., 2001; Mazzoni A. et al., 2002].
Роль оксида азота при опухолевом росте в настоящее время активно обсуждается. В литературе имеются данные, указывающие как на проопухолевое [Jaiswal М. et al., 2000; Meeta J. et al., 2001; Kisley L.R. et al., 2002], так и противоопухолевое действие NO [Xie К. et al., 1996; Lagadec P. et al., 1999; Wei D. et al., 2003]. Какой, про- или противоопухолевый эффект будет оказывать оксид азота, может зависеть от длительности его экспозиции, его концентрации и типа тканей [Wink D.A. et al., 1998]. Низкие дозы NO стимулируют клеточный рост и предохраняют клетки от апоптоза, а высокие концентрации могут ингибировать клеточный рост и индуцировать апоптоз [Kim Р.К. et al., 2001].
В то время как факторы ЕСК, обуславливающие иммуносупрессорный эффект, известны, о медиаторах противоопухолевой активности информации нет, только в работах [Seledtsov V.I. et al., 1997; Бельский Ю.П. и др., 1999] показано, что она не зависит от NO. Было обнаружено, что при определенных экспериментальных условиях можно раздельно регулировать противоопухолевую и иммуносупрессорную активности клеток костного мозга [Бельская Н.В. и др., 2000], однако данные о путях активации противоопухолевых свойств ЕСК в литературе отсутствуют.
Печень эмбриона как источник ЕСК исследовалась мало. Известно, что она является органом эмбрионального кроветворения, интенсивность которого снижается к концу внутриутробного развития. Показано, что выделенные из печени эритроидные незрелые клетки подавляют функции В-лимфоцитов и не влияют на Т-клетки [Цырлева HJF. 8„рр, J985L Данные о противоопухолевой активности ЕСК
1 - JUf ff
5 эмбриональной печени, а также о роли оксида азота в подавлении пролиферации мишеней в литературе отсутствуют.
Сравнительные исследования иммуносупрессорной и противоопухолевой активностей ЕСК популяций костномозговых клеток в зависимости от степени их обогащения незрелыми гемопоэтическими клетками хотя и представлены в литературе, но фрагментарны и противоречивы. Совсем нет данных о роли оксида азота в качестве возможного супрессорного фактора ЕСК у обогащенных клеточных популяций. Так, в работах [Sugiura К. et al., 1988; Sugiura К. et al., 1990] показано, что при разделении клеток по аффинности к агглютинину из зародыша пшеницы (WGA) ЕСК с иммуносупрессорными и противоопухолевыми свойствами сосредотачивались во фракции WGA-позитивных клеток. Напротив, в работе [Seledtsov V.I. et al., 1997] показано, что ЕСК с иммуносупрессорной и противоопухолевой активностями принадлежат к разным популяциям - первые к WGA+, а вторые - к WGA-негативным клеткам.
Цель исследования: изучить роль оксида азота в иммуносупрессорной и противоопухолевой активностях естественных супрессорных клеток разных кроветворных тканей (костный мозг, печень эмбриона) и обогащенных в разной степени гемопоэтическими элементами, а также механизмы инициации и реализации противоопухолевой активности в зависимости от свойств опухолевых клеток.
Задачи:
1.Сравнить вклад оксида азота в иммуносупрессорную и противоопухолевую активности разных популяций костномозговых клеток, отличающихся содержанием незрелых гемопоэтических клеток (цельный костный мозг, его неприлипающая к пластику фракция, фракция с низкой и высокой плавучей плотностью, а также при обогащении незрелыми клетками в результате длительного их культивирования).
2.Изучить иммуносупрессорные и противоопухолевые свойства клеток эмбриональной печени, участие оксида азота в их проявлении.
6 3.Исследовать механизмы индукции и реализации противоопухолевой активности костномозговых клеток (зависимость от контакта клетка-клетка между эффектором и мишенью, секреция индукторных и антипролиферативных факторов клетками эффекторами и мишенями).
4.Изучить противоопухолевую активность клеток костного мозга и участие в ней оксида азота с использованием различных опухолевых клеточных линий.
5.Изучить способность опухолевых клеток проявлять иммуносупрессорную активность через секрецию оксида азота.
Научная новизна. В работе показано, что оксид азота является основным фактором иммуносупрессорной, но не противоопухолевой активности костного мозга и клеток эмбриональной печени интактных животных. Впервые проведено исследование противоопухолевой активности костного мозга в зависимости от типа опухолевых клеток-мишеней и установлено, что для ее индукции необходим контакт клетка-клетка между эффектором и мишенью. Впервые показано, что опухолевые клетки способны стимулировать синтез оксида азота неприлипающими миелокариоцитами, продуцировать его сами и проявлять естественную супрессорную активность, в основе которой лежит механизм, аналогичный механизму индукции и реализации иммуносупрессорной активности кроветворных клеток интактного организма.
Практическое значение работы. Полученные данные позволят глубже понять механизмы, лежащие в основе регуляции иммунного ответа, прежде всего, направленного на подавление опухолевого роста. Результаты работы внесут вклад в представления о патогенезе иммунодепрессии, развивающейся при онкологических заболеваниях, и роль в этом опухолевых клеток.
Основные положения выносимые на защиту:
1. Неприлипающие клетки костного мозга и эмбриональной печени (14-е и 19-е сутки внутриутробного развития) обладают естественной супрессорной активностью: NO-зависимой иммуносупрессорной и NO-независимой противоопухолевой активностями. Обогащение клеток костного мозга незрелыми гемопоэтическими элементами приводит к увеличению естественной супрессорной
7 активности. Клеточные популяции с более высокой иммуносупрессорной активностью обладают и более высокой противоопухолевой.
2. Неприлипающие клетки костного мозга продуцируют факторы,
подавляющие пролиферацию опухолевых клеток. Выработка их индуцируется
опухолевой клеткой-мишенью, при этом важную роль играет непосредственный
контакт клетка-клетка между миелокариоцитами и трансформированными
клетками.
-
Клетки различных опухолевых линий (карцинома легких LLC и Эрлиха, мастоцитома Р-815, лимфолейкоз L1210, миеломоноцитарная линия WEHI-3, эритролейкоз К-562) инициируют NO-независимую противоопухолевую активность костного мозга, несмотря на то, что некоторые опухоли (карцинома легких LLC и Эрлиха, миеломоноцитарная линия WEHI-3, эритролейкоз К-562) стимулируют NO-синтазу костномозговых клеток.
-
Опухолевые клетки (карцинома легких LLC и Эрлиха, мастоцитома Р-815, лимфолейкоз L1210, миеломоноцитарная линия WEHI-3) способны продуцировать оксид азота под влиянием интерферона-у, а клетки карциномы Эрлиха и миеломоноцитарной линии продуцируют его и без экзогенного стимула. Так же все эти опухолевые линии могут проявлять NO-зависимую иммуносупрессорную активность, аналогичную естественной супрессорной активности нетрансформированных гемопоэтических клеток.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на конференции молодых ученых, посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2004 г.); V-ом Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2004 г.)
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 10 научных статей.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 19 рисунками и 16 таблицами.
8 Библиографический указатель включает 282 источников, в том числе 27 отечественных и 255 иностранных.
