Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Актопротекторы и их применение 13
1.2. Обоснование целесообразности использования растительного сырья 14
1.2.1. Ботаническая характеристика черной смородины (Ribes nigrum L., семейство Крыжовниковые – Grosssulariaceae
1.2.2. Ботаническая характеристика малины обыкновенной (Rubus idaeus L., Семейство Розоцветные - Rosaceae)
1.2.3. Ботаническая характеристика иван-чая узколистного, или кипрея узколистного (Chamerion angustifolium L., семейство Кипрейные -Onagraceae)
1.2.4. Ботаническая характеристика лабазника вязолистного (Filipendula ulmaria (L.) Maxim., семейство Розоцветные - Rosaceae ).
1.3. Многокомпонентные растительные препараты и биологически активные добавки на фармацевтическом рынке Российской Федерации
1.4. Перспективы использования растительного сырья 26
1.5. Способы экстрагирования растительного сырья 28
1.6. Гранулирование сухих экстрактов из растительного сырья
Выводы к главе 1 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 34
2.1. Объекты исследования 34
2.2. Стандартизация растительного сырья и сбора 34
2.3. Методики идентификации и количественного определения действующих веществ в сухих экстрактах
2.3.1. Идентификация и количественное определение БАВ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сухих экстрактах из сбора СМИЛ
2.3.1.1. Валидация методики определения рутина 42
2.3.1.2. Валидация методики определения кверцетина 45
2.3.1.3. Валидация методики определения хлорогеновой кислоты 47
2.3.2. Методика спектрофотометрического определения флавоноидов в сухих экстрактах
2.4. Исследование технологических параметров растительного сырья, сбора СМИЛ, сухих экстрактов и гранулятов
2.5. Оценка качества твердой лекарственной формы (капсулы) с гранулятом
2.6. Методы статистической обработки результатов 55
ГЛАВА 3. Разработка технологии экстракта из сбора растительного сырья
3.1. Определение подлинности и показателей качества сбора СМИЛ 56
3.1.1. Внешние признаки 56
3.1.2. Микроскопия. 58
3.2. Фитохимический анализ растительного сырья и сбора 66
3.3. Определение степени поглощения растительного сырья водой и спиртом этиловым
3.4. Выбор экстрагента 71
3.5. Разработка технологии получения экстракта из сбора растительного сырья
3.5.1. Технология получения водного экстракта из сбора СМИЛ 75
3.5.2. Технология получения сухого экстракта из сбора СМИЛ методом комбинированной спиртовой экстракции
3.6. Идентификация и количественное определение ведущих БАВ сухих экстрактов, полученных из сбора СМИЛ
3.7. Исследование сухих экстрактов из сбора СМИЛ методом микроскопии
3.8. Изучение технологических характеристик сухих экстрактов 95
Выводы к главе 3 99
ГЛАВА 4. Разработка соства и технологии капсул с сухими экстрактами из сбора смил
4.1. Выбор вспомогательных веществ, для гранулирования и исследование их технологических свойств
4.2. Выбор способа гранулирования и разработка составов для грануляции
4.3. Технология получения твердых желатиновых капсул с гранулятом экстракта из сбора СМИЛ
4.4. Упаковка твердых желатиновых капсул 113
4.5. Оценка качества твердых желатиновых капсул с гранулятом
Выводы к главе 4 119
ГЛАВА 5. Изучение эффективности сбора смил и сухих экстрактов из него
Выводы к главе 5 124
Обсуждение результатов 125
Общие выводы 139
Список литературы
- Обоснование целесообразности использования растительного сырья
- Методики идентификации и количественного определения действующих веществ в сухих экстрактах
- Фитохимический анализ растительного сырья и сбора
- Технология получения твердых желатиновых капсул с гранулятом экстракта из сбора СМИЛ
Обоснование целесообразности использования растительного сырья
Смородина черная – Ribes nigrum L., семейство крыжовниковые – Grosssulariaceae, многолетний кустарник 1-1,5м высотой и до 2,0-2,5м в диаметре окружности куста. Молодые ветви светло-зеленые, с многочисленными волосками и железками. Старые ветви коричневые, голые. Листья крупные (до 8,5 см длиной и 10 см шириной), очередные, черешковые, трех-пятилопастные с грубопильчатым краем, с ароматным специфическим запахом, морщинистые, сверху – голые, блестящие, на нижней стороне расположены масляные железки. Цветки мелкие, обоеполые, с двойным околоцветником, зеленовато-розовые или лиловые, по 5-11 собраны в висячие кисти. Чашечка трубчатая, тычинок 5. Плоды – шаровидные буро-черные или черные многосеменные ягоды, с кисло-сладким вкусом. Цветет в мае-июне, плоды созревают в июле-августе [25,27,121]. В настоящее время смородину повсеместно культивируют как плодово-ягодное растение.
Химический состав. В листьях черной смородины отмечено высокое содержание аскорбиновой кислоты (300 - 400 мг%). Активно синтезируются фенольные соединения, представленные катехинами, флавоноидами, антоцианами, гидроксикоричными кислотами. В листьях были найдены гликозиды кемпферола и кверцетина, мирицетин, кверцитрин [63,128].
Ценность листьев черной смородины обусловлена также содержанием проантоцианидинов – продельфинидинов и проантоцианидина [168,187], составляющих основную (до 80 %) часть потребляемых человеком биофлавоноидов [85,86,89,182]. Исследования последних лет показывают противовоспалительную способность продельфинидинов выделенных из листьев черной смородины [128].
В листьях черной смородины идентифицированы более 15 минеральных веществ, необходимых для нормальной жизнедеятельности организма человека: медь, магний, серебро, железо, марганец, сера, фосфор, алюминий, барий, хром, кальций, а также эфирные масла, каротин и фитонциды, обуславливающие бактерицидную активность листьев [128].
Применение. Высушенные листья смородины черной оказывают дезинфицирующее действие, активны в отношении дизентерийной палочки и могут применяться в качестве вспомогательного средства, повышающего активность антибиотиков. Применяются как поливитаминное средство (витамин С и Р) для повышения сопротивляемости организма, усиления его компенсаторных механизмов. Листья смородины черной входят в состав витаминных сборов с листьями малины, брусники, плодами шиповника [8,83].
В отечественной народной медицине листья смородины черной используют в качестве потогонного, мочегонного средства, при туберкулезе лимфатических желез, в виде отвара – для лечения ревматизма, подагры. В тибетской медицине листья смородины употребляют вместо чая при заболеваниях кожи, диарее [83,128].
Полукустарник с многолетним корневищем и прямостоячими, густо покрытыми шипами двулетними стеблями высотой 50-150 (200) см. Стебли первого года травянистые, цилиндрические, прямостоячие с поникающей верхушкой, сизоватые, имеют многочисленные тонкие шипы красноватого или красновато-коричневого цвета [6,10].
Листья на вегетативных побегах непарноперистые с 3-7 листочками, верхний из которых крупнее остальных. На генеративных побегах листья тройчатые. Листочки неравнопильчатые, сверху с простыми или звездчатыми редкими волосками, а снизу беловойлочные. Цветки белые около 1 см диаметром. Соцветия кистевидные рыхлые верхушечные и пазушные. Цветет в июне-июле. Плоды созревают не одновременно, в июле-августе [6]. Малина обыкновенная в диком виде распространена в лесной зоне и прилегающих районах лесостепной зоны европейской части страны и Западной Сибири. Это растение лесной зоны. Обитает на богатых влажных почвах, растет в горах на каменистых грубоскелетных глинистых и суглинистых почвах. Теневынослива, но под пологом древесных пород не плодоносит. Хорошо цветет и плодоносит на вырубках, гарях, буреломах, вдоль опушек, просек и дорог, по берегам речек и горных ручьев [41].
Химический состав. По данным литературных источников в листьях малины обыкновенной содержатся: кверцетин, кемпферол, гиперозид, изокверцитрин, афцелин. астрагалин, рамнозид кемпферола. В сухом экстракте листьев малины содержатся: кофейная кислота, галловая кислота, кверцетин, гиперозид, салициловая кислота, эллаговая кислота [67,68,101].
Применение. Плоды малины обыкновенной являются официнальным сырьем в отечественной медицине. Листья малины обыкновенной включены в Международную Фармакопею «Martindale» и применяются в форме настоя (чая) как средство, расслабляющее гладкую мускулатуру матки и кишечника, используется при обильных и болезненных менструациях, в акушерской практике, а также как вяжущее при заболеваниях горла [8,160].
Настой из листьев малины известен как потогонное и жаропонижающее средство при простудных заболеваниях [83]. Цветки, листья и плоды употребляют как гиполипидемическое средство при атеросклерозе и как средство, улучшающее реологические свойства крови при гипертонической болезни и ишемической болезни сердца, в качестве противовоспалительного и высоковитаминного средства. Высушенные листья входят в состав сборов трав для гигиенических ванн, а сок из свежих листьев используют для мазей, применяемых при угрях и высыпаниях. Из сухих листьев малины готовят отвар для примочек при ушибах[83,85,86].
Методики идентификации и количественного определения действующих веществ в сухих экстрактах
Лабазник вязолистный - крупное многолетнее травянистое растение с коротким горизонтальным корневищем. Стебли достигают в высоту 1 м и часто отливают красным. Листья очередные, перисто-рассеченные. Их большие и маленькие сегменты чередуются друг с другом, имеют отчетливое перистое жилкование, городчатые или пильчатые края и серебристо опушены с нижней стороны. Мелкие белые цветки с многочисленными тычинками собраны в метельчатые соцветия на концах побегов. Цветет с июня по август.
Растет на сырых и заболоченных лугах, главным образом в поймах рек, по берегам озер и других водоемов, в зарослях кустарников, в черноольховых, березовых, реже широколиственных сырых и заболоченных лесах [41,83,85,160].
Химический состав. В лекарственных целях используют все части растения. Надземная часть лабазника вязолистного содержит простые фенолы, флавоноиды, органические кислоты, гидроксикумарины, дубильные вещества, тритерпеновые соединения, полисахариды, каротиноиды, аминокислоты, макро- и микроэлементы [1,42]. Применение. Трава лабазника широко используется в народной медицине России и ряда европейских стран как общеукрепляющее, противовоспалительное, диуретическое, противоязвенное, гипогликемическое, седативное, противогеморройное, антиспастическое и вяжущее средство [1,42,155,160]. В народной медицине используют соцветия, подземную и надземную части таволги вязолистной. Настой из таволги вязолистной обладает мочегонным, потогонным, кровоостанавливающим, вяжущим действием. Экстракты надземной части лабазника проявляют ноотропную, адаптогенную, гепатопротекторную и антиоксидантную активность [42,142,143,157,158,180]. Цветки лабазника разрешены к применению в качестве противовоспалительного, вяжущего и ранозаживляющего средства [36]. Эксперименты на животных показали, что экстракты из травы лабазника обладают спазмолитическим, капилляроукрепляющим, противодиабетическим, противомикробным [190] действием [20,42]. Таким образом, растительное сырье, выбранное для создания сбора, применяется в народной, традиционной (тибетской), этномедицине (у тувинцев) и у старообрядцев как противовоспалительное, общеукрепляющее, ранозаживляющее, мягчительное, обволакивающее, поливитаминное, противолихорадочное, кровоостанавливающее средство при широком спектре заболеваний - внутрь при язвенной болезни желудка, гастритах, колитах, нарушениях обмена веществ, наружно - для промывания ран, язв, при артралгиях, в виде припарок при ушибах [157,158].
Химический состав выбранного растительного сырья богат и разнообразен, что обеспечивает разностороннее действие на организм. Для выбранных видов растительного сырья можно определить комплекс биологически активных соединений, обуславливающий терапевтический эффект – это флавоноиды, кумарины, гидроксикоричные и фенолкарбоновые кислоты, полифенольные (дубильные) вещества, полисахариды (слизи), витамины (аскорбиновая кислота, каротиноиды), хлорофиллы и макро- и микроэлементы
Многокомпонентные растительные препараты и биологически активные добавки на фармацевтическом рынке Российской Федерации
На фармацевтическом рынке России широко представлены биологически активные добавки (БАД), применяемые в качестве источников разнообразных биологически активных веществ, в том числе, флавоноидов, а также для коррекции различных патологических (пограничных) состояний. Чаще всего БАД представлены многокомпонентными растительными составами, поскольку лекарственные растения издавна и с большим успехом используется как в народной, так и в традиционной медицине не только в индивидуальном виде, но и в различных сочетаниях [11,122].
Ассортимент лекарственных форм БАД разнообразен - таблетки, гранулы, брикеты, лекарственное растительное сырье цельное и в фильтр-пакетах. Самой распространенной формой сочетания и применения лекарственного растительного сырья являются сборы. Сборы (лат. species) являются в РФ официнальной лекарственной формой (требования к ним изложены в ГФ ХI издания в статье «Сборы») и представляют собой смеси нескольких видов измельченного, реже цельного, растительного сырья, иногда с добавлением солей и эфирных масел, используемые в качестве лекарственных средств [79,122,126,129,184].
Вместе с тем, комбинации различных видов растительного сырья выпускаются также в виде БАД.
Анализ фармацевтического рынка РФ показал, что совсем небольшой процент БАД содержат в своем составе листья малины обыкновенной, листья смородины черной, траву таволги вязолистной, траву кипрея узколистного, а составы, которые содержали бы все эти компоненты, не встречаются. В таблице 1 представлены некоторые БАД, содержащие выбранные для исследования растения [11,129,137,145].
Фитохимический анализ растительного сырья и сбора
Калибровку проводили по стандартам анализируемых веществ. Были приготовлены стандартные растворы с концентрациями: хлорогеновой кислота 2,8 мг, кверцетин 2,8 мг в 10 мл смеси (50:50) мобильной фазы А и В. Для построения калибровочных графиков анализируемых веществ последовательно инжектировали 5, 10, 15, 20 мкл стандартного раствора.
Подготовка образца к анализу. В виалу отбирали точную навеску (20-40 мг) анализируемого образца экстакта и добавляли 1 мл смеси (50:50) мобильной фазы А и В. Экстрагировали в течении 5 минут при 50С. Затем раствор центрифугировали при 3000 об/мин в течении 3 минут. Далее фильтровали на фильтре с размером пор 0,45 мкм. Переносили в хроматографическую виалу и хроматографировали при вышеуказанных условиях.
Количественное определение анализируемых веществ осуществляли с использованием данных калибровок стандартного раствора. Количественное определение рутина. Определение проводили на жидкостном хроматографе Waters Breeze с УФ-детектором 2487 при следующих условиях: Колонка Symmetry С-18 4.6x150 mm 5\ш\ Мобильная фаза: А - 0,1% трифторуксусная кислота в воде; В - метанол
Калибровку проводили по стандартам анализируемых веществ. Был приготовлен стандартный раствор, с концентрацией рутина 7,1 мг в 10 мл мобильной фазы В. Для построения калибровочных графиков анализируемого вещества последовательно инжектировали 5, 10, 15, 20 мкл стандартного раствора.
Подготовка образца к анализу.
В виалу отбирали точную навеску (30-40 мг) анализируемого образца экстракта и добавляли 1 мл мобильной фазы В. Экстрагировали в течении 5 минут при 50С. Затем раствор центрифугировали при 3000 об/мин в течении 3 минут. Далее фильтровали на фильтре с размеров пор 0,45 мкм. Переносили в хроматографическую виалу и хроматографировали при вышеуказанных условиях.
Количественное определение анализируемого вещества осуществляли с использованием данных калибровок стандартного раствора.
Валидацию методики определения рутина в экстракте проводили на основании руководства по валидации биоаналитических методик FDA и EMA, по следующим характеристикам: специфичность, линейность, правильность и прецизионность, предел количественного определения [127]. Селективность Для определения специфичности проводили анализ экстрактов (навеска 30 мг в 1 мл этилового спирта) содержащих рутин. На полученных хроматограммах было видно, что соэкстрактивные вещества не мешают определению рутина.
Проводили анализ четырех образцов стандартных растворов рутина в следующих концентрациях: 100,0 мкг/мл, 200,0 мкг/мл, 300,0 мкг/мл, 400,0 мкг/мл. По полученным значениям был построен калибровочный график (R2 =0,999807), совместно с уравнением калибровочной кривой 2.77e+004x-9,59y+005
Отклонения концентраций калибровочных растворов, рассчитанных по уравнению линейной зависимости, от фактических значений приведены в таблице 1. Таблица 2 Отклонения концентраций калибровочных растворов рутина от
Полученные отклонения соответствуют нормам FDA и EMA(не более 20 % для нижнего диапазона линейности, не более 15 % - для остальных точек) Правильность и прецизионность Проводили анализ 3 образцов c концентрацией рутина 100,0 мкг/мл, 200,0 мкг/мл, 300,0 мкг/. Каждый раствор хроматографировали 3 раза. Таблица 3 Величины стандартного отклонения (S.D), относительного стандартного отклонения (RSD, %) и относительной погрешности (, %) Введено мкг/мл Найдено мкг/мл Найдено мкг/мл, среднеезначение (n=3) S.D.n=3 RSD, %n=3 ,
Полученные величины стандартного отклонения (S.D), относительного
стандартного отклонения (RSD, %) и относительной погрешности (, %) соответствуют нормам FDA и EMA (не более 20 % минимальной концентрации, не более 15 % - для остальных двух концентраций). Предел количественного определения
Предел количественного определения (ПКО) методики определяли на основании данных линейности, правильности и прецизионности. Предел количественного определения методики составил 100,0 мкг/мл. Валидация методики определения кверцетина Валидацию методики определения кверцетина в экстракте проводили на основании руководства по валидации биоаналитических методик FDA и EMA , по следующим характеристикам: специфичность, линейность, правильность и прецизионность, предел количественного определения [127].
Технология получения твердых желатиновых капсул с гранулятом экстракта из сбора СМИЛ
По данным литературы и результатам собственных исследований в сборе СМИЛ содержится большое разнообразие химических соединений, основными из которых являются флавоноиды, дубильные вещества, органические кислоты и другие соединения, обусловливающие фармакологическое действие сбора [1,5,32,67,68,128]. В связи с этим, стандартизацию сухих экстрактов, полученных из сбора СМИЛ, проводили именно по этим ведущим группам БАВ. Количественное определение суммарного содержания БАВ в сухих экстрактах (водном и спиртовом) из сбора СМИЛ проводили спектрофотометрическим методом на спектрофотометре «Genesis 5» в кювете с толщиной слоя 10 мм. Определяли сумму полифенольных соединений в пересчете на рутин (=410 нм), сумму органических кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту (=327 нм), сумму дубильных веществ в пересчете на галловую кислоту (=275 нм), в качестве раствора сравнения использовали спирт этиловый 95%. Для установления воспроизводимости и точности методики было проведено пять определений каждого показателя и проведена статистическая обработка результатов.
В результате исследования установлено высокое содержание ведущих групп БАВ в экстрактах, полученных как методом водной экстракции, так и методом трехэтапной экстракции с элементами циркуляции.
Для подтверждения качественного и определения количественного содержания БАВ использовали метод ВЭЖХ. Исследование проводили на жидкостном хроматографе Waters Breeze с УФ-детектором 2487. Колонка Symmetry С-18 4.6x150 mm 5цт. Условия количественного определения хлорогеновой кислоты и кверцетина: мобильная фаза: 0,1% трифторуксусная кислотата в воде - ацетонитрил, объем инжекции 10 мкл, поток 1.4 мл/мин; температура колонки 30С; длина волны детектора 330 нм. Условия количественного определения рутина - мобильная фаза: 0,1% трифторуксусная кислота в воде - метанол; объем инжекции 10 мкл; поток 1 мл/мин; температура колонки 30С; длина волны детектора 210 нм.
Калибровку проводили по стандартам анализируемых веществ, полученных от Sigma-Aldrich, США: хлорогеновая кислота, кверцетин, рутин. Количественное определение анализируемого вещества осуществляли с использованием данных калибровок стандартного раствора. Число определений по каждому показателю составило 5. Результаты, полученные в ходе анализа, представлены в таблице 18.
Результаты исследования свидетельствуют о том, что при спиртовой экстракции, вытяжка в большей степени обогащается рутином – 19,7 ± 0, мг/г, в то время как при использовании воды в качестве экстрагента, содержание рутина в экстракте составляет только 3,9 ± 0,03 мг/г от суммы флавоноидных соединений. Органические кислоты извлекаются в большей степени при водной экстракции. Так, содержание хлорогеновой кислоты в сухом водном экстракте составляет 6,2 ± 0,05 мг/г, в то время как в спиртовом – 2,4 ± 0,03 мг/г. Кверцетин в водном и спиртовом экстракте содержится примерно в равном количестве – 2,2 ± 0,04 мг/г и 2,3 ± 0,03 мг/г, соответственно.
Поскольку форма и размер частиц в сухих экстрактах обусловливают их технологические характеристики, такие как – сыпучесть, насыпная масса, прессуемость, удельная поверхность и ряд других, было проведено исследование сухих экстрактов (водного и этанольного) из сбора СМИЛ с помощью микроскопа Hirox Nuerique КН-7700, при следующих условиях: Lens MX (G) – 5040 Z; Normal: х200. Результаты проведенного микроскопического исследования представлены на рисунке 16.
На фотографиях, приведенных на рисунке 16 видно, что частицы экстрактов представляют собой кристаллы неправильной формы. В отраженном свете поверхность частиц шероховатая, блестящая (на фотографиях видна в виде светлых бликов). Частицы экстрактов полидисперсны, размер их составляет: в водном экстракте – 500-4500 мкм, в спиртовом – 300-3000 мкм (табл. 19).
Технологические и физико-химические характеристики сухих экстрактов имеют важное значения при разработке и изготовлении твердых лекарственных форм и в значительной степени определяют выбор технологии и качество готового продукта [55,125,150].
