Введение к работе
Актуальность темы. Антрациклиновый антибиотик доксорубицин обладает высокой противоопухолевой и противолейкозной активностью при низкой избирательности действия. Одной из характерных токсикологических особенностей препарата является кардиотоксичность. Включение цитостатика в липосомы позволяет оптимизировать его противоопухолевый эффект. В настоящее время на мировом фармацевтическом рынке присутствует несколько липосомальных форм доксорубицина: Доксил, Келикс, в состав которых входит полиэтиленгликоль (ПЭГ), защищающий липосомы от обнаружения и захвата фагоцитарной системой, поэтому ПЭГ-липосомы позволяют поддерживать более высокую концентрацию доксорубицина в крови в течение длительного времени.
С целью увеличения избирательности противоопухолевого действия доксорубицина актуальны исследования по созданию термочувствительных липосом, используемых в комбинации с локальной гипертермией. Термолипосомы высвобождают цитостатик в процессе нагревания опухоли до температуры 40-43 C. При этой температуре в липосомальной мембране образуются поры, через которые инкапсулированный доксорубицин проникает в окружающее пространство. Новый препарат ThermoDox, созданный компанией Celsion Corporation совместно с Duke University (США), в сочетании с высокочастотной аблацией проходит III фазу клинических испытаний при гепатоцеллюлярном раке, а с нагревом токами сверхвысокой частоты (СВЧ-нагревом) – I-II фазы клинических испытаний при рецидивирующем раке молочной железы.
В РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН совместно с МИТХТ им. М.В.Ломоносова разработана модель термолипосомального доксорубицина, однако ее существенным недостатком изначально являлась невысокая эффективность инкапсулирования цитостатика в везикулы, для увеличения которой потребовалась модификация технологии получения лекарственной формы. Данная работа посвящена оптимизации состава, технологии производства и разработке методов анализа термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина.
Цель и задачи исследования. Получение термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина для увеличения селективности доставки препарата в опухоль.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
-
Оптимизировать технологию получения термолипосомального доксорубицина с высокой степенью загрузки цитостатика в везикулы: выбрать подходящий состав термолипосомальной мембраны и соотношение препарат : суммарные липиды.
-
Разработать методику очистки термолипосомальной дисперсии от невключившегося цитостатика.
-
Подобрать криопротектор, разработать режим лиофилизации термолипосомального доксорубицина и наработать лиофилизированный препарат в количестве, достаточном для проведения химико-фармацевтических и биологических исследований.
-
Разработать методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином.
-
Выбрать критерии качества готового препарата, провести его стандартизацию и изучить стабильность в процессе хранения.
-
Провести оценку биологической активности лиофилизированного термолипосомального доксорубицина в сочетании с локальной гипертермией in vitro и in vivo.
Научная новизна исследования. Разработан состав и технология производства лиофилизированного термолипосомального доксорубицина. Изучено влияние различных криопротекторов на стабильность термолипосом с доксорубицином до и после лиофилизации, а также в процессе замораживания до температуры –18 C. Разработан режим лиофилизации термолипосомального доксорубицина. Разработаны методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином. Выбраны критерии и параметры качества лиофилизированного термолипосомального доксорубицина, разработан проект ФСП на препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг». Показана стабильность лекарственной формы в процессе хранения в течение одного года при температуре 18 C. В биологических экспериментах показано, что термолипосомальный препарат в комбинации с локальной гипертермией обладает большей избирательностью действия по сравнению со свободным доксорубицином.
Практическая значимость и внедрение результатов исследования. Создана новая термочувствительная липосомальная лекарственная форма высокоактивного противоопухолевого антибиотика доксорубицина для использования в комбинации с локальной гипертермией. В экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo выявлено преимущество новой лекарственной формы перед субстанцией доксорубицина. Разработан проект ФСП, в соответствии с которым проведена стандартизация препарата «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг».
В РФ в настоящее время липосомальные лекарственные формы не производятся. Разработка и производство собственного высокоэффективного препарата для лечения онкологических больных позволит расширить его доступность для широкого круга отечественных пациентов, повысив тем самым лекарственную безопасность страны.
Внедрено в учебный процесс методическое пособие «Липосомальные формы лекарственных препаратов» для системы послевузовского профессионального образования провизоров.
Апробация работы. Материалы проведенных исследований представлены на конференциях: VI, VII и VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (24-26 марта 2007 г., 17-19 марта 2008 г. и 21-22 апреля 2009 г., Москва); VIII конференции молодых онкологов с международным участием «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (26-27 апреля 2007 г., Киев); The 2008 Nanotechnology Conference and Trade Show, NSTI Nanotech 2008, 11th Annual Conference (June 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA); The Second Saint-Petersburg International Conference on NanoBioTechnologies, NanoBio 2008 (16-18 June 2008, Saint-Petersburg, Russia); XII и XIII Российском онкологическом конгрессе (18-20 ноября 2008 г. и 17-19 ноября 2009 г., Москва); The 2008 Materials Research Society (MRS) Fall Meeting (December 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA); III съезде токсикологов России (2-5 декабря 2008 г., Москва); Международном форуме по нанотехнологиям Rusnanotech 2008 и Rusnanotech 2009 (3-5 декабря 2008 г. и 6-8 октября 2009 г., Москва); Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (18-19 февраля 2009 г., Москва); IV региональной конференции молодых ученых-онкологов имени академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (24 апреля 2009 г., Томск); Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития» (10-11 сентября 2009 г., Томск).
Апробация диссертационной работы прошла 28 сентября 2009 г. в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ, из них 5 статей, 5 тезисов докладов на английском языке и 20 тезисов на русском языке.
Связь темы диссертационной работы с планом научных работ учреждения. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН по теме: «Разработка и создание новых лекарственных форм для медицинской промышленности» (№ гос. регистрации 01.200.316267), а также в рамках научно-технической программы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» на 2007-2009 гг.
Положения, выносимые на защиту:
-
Состав и технология производства лиофилизированного термолипосомального доксорубицина.
-
Методики химико-фармацевтического анализа: спектрофотометрическое определение содержания доксорубицина в лекарственной форме и хроматографическое определение компонентов лекарственной формы.
-
Результаты контроля качества шести наработанных серий препарата и изучения их стабильности в процессе хранения при температуре 18 C.
-
Результаты оценки эффективности действия термолипосомального доксорубицина в сочетании с локальной гипертермией in vitro и in vivo.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав результатов собственных исследований, общего заключения, общих выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 244 страницах машинописного текста, содержит 92 рисунка и 54 таблицы. Библиографический список включает 318 наименований, в том числе 278 – на иностранном языке.
