Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Фармакокинетические взаимодействия лекарственных веществ, метаболизируемых изоферментом цитохрома P450 CYP1A2
1.1. Межлекарственное взаимодействие 14
1.2. Индукция и ингибирование 15
1.2.1. Подходы к отбору маркерных субстратов 18
Методы оценки межлекарственного взаимодействия (фенотипирование и генотипирование)
1.2.3. Фенотипирование по активности изофермента CYP1A2 24
Изоформа CYP1A2, как составная часть суперсемейства цитохрома P450
Метаболизм субстратного маркера CYP1A2 – кофеина (человек и модельные животные). Сходства и отличия
Фармакокинетика субстратного маркера CYP1A2-кофеина и его метаболитов (человек и модельные животные). 34
Сходства и отличия
Межлекарственное взаимодействие субстратного маркера
1.5. CYP1A2-кофеина с различными лекарственными веществами
Нормативная база по изучению межлекарственных взаимодействий
1.7. Исследования, требуемые для идентификации 46
изоферментов цитохрома Р450, участвующих в биотрансформации ЛС Оценка ингибирования изоферментов цитохрома Р450 in vitro
1.7.1. Оценка индукции изоферментов цитохрома Р450 in vitro 1.7.2.
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы 49
2.1.1. Объекты исследования 49
2.2. Реактивы 52
2.3. Аналитическая аппаратура и средства измерений 52
2.3.1. Основные аналитические приборы
2.3.2. Вспомогательные устройства
2.4. Экспериментальные животные 53
2.5. Методы 53
2.5.1. Введение препарата
2.5.2. Способ отбора крови и мочи
2.5.3. Приготовление растворов для анализа
Приготовление концентрированных и рабочих стандартных растворов
Приготовление подвижной фазы для хроматографического анализа
Методика количественного определения кофеина и его
2.5.4. метаболитов в плазме крови и моче крыс на основе 55
высокоэффективной жидкостной хроматографии Условия количественного определения кофеина и его метаболитов в плазме крови и моче животных
2.5.4.2. Построение калибровочных кривых
Метрологическая характеристика методик определения кофеина и его основных метаболитов
Обработка биологических проб, экстракция кофеина и его метаболитов из биологических образцов
Подготовка плазмы крови крыс к хроматографическому анализу
Определение процента извлечения кофеина и его метаболитов из плазмы крови
2.5.5.3. Подготовка мочи крыс к хроматографическому анализу 61
Определение процента извлечения кофеина и его
Испытание на разведение опытных образцов плазмы крови и суточной мочи крыс
Фармакокинетические параметры, используемые для интерпретации экспериментальных данных метаболитов из мочи
2.5.7. Оценка индуцирующего или ингибирующего эффекта
2.5.8. Статистическая обработка полученных результатов
Глава 3. Оценка фармакокинетического взаимодействия афобазола с препаратом-субстратом цитохрома CYP1A2 в эксперименте
Влияние дозы и режима дозирования афобазола на фармакокинетику кофеина и его метаболитов у крыс
Оценка метаболических отношений кофеина и его метаболитов после различных режимов дозирования 81
Глава 4. Оценка влияния афобазола на изменение активности изоформы CYP1А2 после его введения в различных дозах по данным мочевой экскреции
Глава 5. In vivo оценка метаболического отношения маркера CYP1A2 после введения афобазола в сравнении со стандартными индукторами и ингибиторами цитохромов Общее заключение 106
Выводы 108
ПО
Литература
- Фенотипирование по активности изофермента CYP1A2
- Аналитическая аппаратура и средства измерений
- Фармакокинетические параметры, используемые для интерпретации экспериментальных данных метаболитов из мочи
- Оценка метаболических отношений кофеина и его метаболитов после различных режимов дозирования
Введение к работе
Актуальность проблемы
Взаимодействие лекарственных средств (ЛС) играет важную роль в эффективности и безопасности фармакотерапии и может приводить, как к повышению, так и понижению эффективности лечения, а иногда, к проявлению серьезных нежелательных реакций. В последнее время все большее внимание уделяется изучению взаимодействия лекарственных веществ (ЛВ) на уровне изменений их биотрансформации. Известно несколько сотен ЛС, влияющих на метаболизм других препаратов. При этом ЛС способны, как повышать активность ферментов метаболизма ЛВ (индукция), так и снижать ее (ингибирование) (Кукес В.Г. с соавт., 2008; Жердев В.П. с соавт., 2010; Levy R.H. et al., 2002; Testa B., Kramer S.D., 2008).
Влияние новых ЛС на изоформы цитохрома P450 необходимо оценивать уже на доклиническом этапе в экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo. Несмотря на технологические преимущества в проведении in vitro исследований, интерпретация полученных параметров остается проблематичной из-за невозможности корректной экстраполяции на целостный организм (Tucker G.T. et al., 2001). Последнее определяет высокую вероятность ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Поэтому предпочтительным представляются опыты in vivo с использованием в качестве экспериментальной модели беспородных крыс (Kobayashi K. et al., 2002; Lee D.Y. et al., 2006).
В современной терапевтической практике при лечении различных патологий полипрагмазия стала основным подходом, поэтому описание межлекарственных взаимодействий является стандартной процедурой уже на этапе разработки лекарственных средств как за рубежом, так и в Российской Федерации в течение последних 20 лет (Сычев Д.А., 2009; Bailie G.R. et al., 2004; Nagai N., 2010).
В ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН создан оригинальный анксиолитик афобазол 2-(2-морфолиноэтилтио)-5-этоксибензилимидазола дигидрохлорид (Середенин С.Б. с соавт., 1998; Seredenin S.B., 2003).
Афобазол находит все более широкое применение в клинической практике при лечении генерализованных тревожных расстройств в составе поликомпонентной фармакотерапии. Существует вероятность, что наряду с афобазолом могут применяться метаболизируемые изоферментом CYP1А2 препараты, например, атипичные нейролептики (клозапин, оланзапин), фторхинолоны, циметидин, рифампицин, фенобарбитал и другие сильнодействующие ЛС. При этом возможны нежелательные межлекарственные взаимодействия и, как результат выраженные побочные эффекты.
В связи с этим чрезвычайно важной и актуальной задачей является изучение лекарственных взаимодействий афобазола при комбинированном приеме с препаратами, являющимися типичными субстратами представителей суперсемейства цитохромов CYP1A2.
Диссертация выполнена в соответствии с плановой темой НИР Федерального государственного бюджетного учреждения «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН «Изучение механизмов эндо- и экзогенной регуляции функций ЦНС, разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств» (№ госрегистрации 01. 2006 06601).
Цель исследования
Изучение фармакокинетического взаимодействия афобазола при комбинированном введении с препаратом-маркером кофеином, являющимся типичным субстратом изоформы цитохрома CYP1А2.
Задачи исследования
Для достижения цели настоящего исследования были поставлены следующие задачи:
-
Воспроизвести/модифицировать аналитический метод количественного определения кофеина и его метаболитов (параксантина, теобромина, теофиллина и 1,3,7-триметилмочевой кислоты) в плазме крови и моче крыс с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
-
На крысах оценить фармакокинетическое взаимодействие афобазола при одинаковой длительности введения (субхроническое) в эффективной, анксиолитической дозе (5 мг/кг) и дозе, превышающую эффективную (25 мг/кг), с препаратом-субстратом цитохрома CYP1A2.
-
Изучить влияние длительности введения афобазола (однократно, в течение 2-х и 4-х суток) в дозе 25 мг/кг на изменение активности изоформы CYP1А2 у крыс.
4. Оценить метаболические отношения (МО) маркера CYP1A2 после введения афобазола в различных дозах по данным мочевой экскреции и провести сравнительный анализ с МО полученными в плазме крови крыс.
5. Показать адекватность и избирательность разработанной методологии на примере определения изменения активности изоформы CYP1A2 после введения стандартных ингибиторов и индукторов данного изофермента в эффективных дозах у крыс.
6. Сделать заключение о возможном комбинированном применении афобазола с препаратами различных фармакологических групп, метаболизируемых CYP1A2.
Научная новизна исследования
Впервые изучена фармакокинетика субстратного маркера CYP1A2 – кофеина и его метаболитов при комбинированном введении с афобазолом.
Установлено, что после введения афобазола в течение 4-х суток (по 3 раза в сутки через каждые 3 ч) в эффективной, анксиолитической дозе 5 мг/кг ни ингибирующий, ни индуцирующий эффекты на изоформу CYP1А2 не выявлены. Пятикратное увеличение дозы афобазола до 25 мг/кг при курсовом введении препарата позволило выявить умеренный индуцирующий эффект через 2 суток, который усиливался через 4 дня.
По данным мочевой экскреции установлено, что афобазол в эффективной, анксиолитической дозе 5 мг/кг и в дозе 10 мг/кг после 4-х дневного введения (3 раза в сутки) не вызывал изменения активности изоформы CYP1А2. В то же время увеличение дозы афобазола до 25 мг/кг после многократного введения препарата позволило выявить умеренный индуцирующий эффект. Дальнейшее ее увеличение до 50 мг/кг практически не изменило степень выраженности этого эффекта, что может быть объяснено насыщением активных центров изофермента молекулами афобазола.
Сравнение величин МО (метаболит/кофеин), полученных в плазме крови и суточной моче крыс показало, что усиление индуцирующего эффекта происходит только при значительном увеличении дозы афобазола. Различия в значениях МО в плазме крови и моче можно объяснить различными уровнями концентрации теобромина, параксантина и кофеина в рассматриваемых биожидкостях.
Апробирована методология изучения влияния ЛС на изоформу CYP1A2 цитохрома Р450 in vivo с использованием стандартных модификаторов и субстрата-маркера.
Установлено, что активность изоформы CYP1A2 у крыс можно оценивать по одному из метаболитов препарата-маркера (параксантину или теобромину).
Практическая значимость исследования
Афобазол в эффективной, анксиолитической дозе (5 мг/кг) у крыс, соответствующей терапевтической у человека, не вызывает ни ингибирующего, ни индуцирующего эффектов на изоформу CYP1А2. Таким образом, терапевтическая доза афобазола у человека (10 мг) также не будет вызывать изменений активности данной изоформы.
Полученные данные могут составить основу рекомендаций по комбинированному применению афобазола с рядом ЛС с целью повышения эффективности и безопасности проводимой фармакотерапии.
Апробированную методологию оценки изменения активности CYP1А2 с применением стандартных индуктора и ингибитора можно использовать при разработке новых ЛС.
Личный вклад автора
Автором самостоятельно воспроизведена и модифицирована методика количественного определения кофеина и его метаболитов в биоматериале, проведены исследования по изучению влияния афобазола на фармакокинетику кофеина и его метаболитов, обработаны результаты, сформулированы выводы. При непосредственном участии автора подготовлены публикации по результатам работы.
Положения, выносимые на защиту
1. Афобазол в эффективной дозе 5 мг/кг после субхронического введения не вызывает изменения активности изоформы CYP1А2.
2. Однократное введение афобазола в дозе 25 мг/кг не изменяет активность изоформы CYP1А2. Субхроническое введение афобазола в этой дозе в течение 2-х суток вызывает умеренный индуцирующий эффект. При увеличении длительности введения афобазола до 4 суток его индуцирующий эффект усиливается.
3. Афобазол в дозе 5 мг/кг и 10 мг/кг после 4-х дневного введения не вызывает изменения активности изоформы CYP1А2. Увеличение дозы афобазола до 25 мг/кг вызвало индуцирующий эффект. Дальнейшее увеличение дозы препарата до 50 мг/кг практически не изменило степень выраженности этого эффекта.
4. Сравнительный анализ величин МО метаболитов кофеина (теобромина и параксантина) в плазме крови и суточной моче крыс показал, что с увеличением дозы афобазола индуцирующий эффект усиливается. Оценку активности изоформы CYP1А2 можно проводить по данным полученным в плазме крови или суточной моче крыс.
5. Апробирована методология изучения влияния лекарственного средства афобазола на изоформу цитохрома Р450 CYP1A2 в эксперименте.
6. Афобазол в терапевтической дозе 10 мг (3 раза в день) не вызывает изменения активности изоформы CYP1A2, поэтому его можно применять в сочетании с препаратами, метаболизируемыми данным изоферментом.
Апробация работы
Основные результаты работы представлены на XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012 г.); IV съезде фармакологов России «Инновация в современной фармакологии» (Казань, 2012 г.); Евразийском конгрессе «Медицина, фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2013 г.); IX Международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: Вопросы медицины» (Москва, 2013 г.); Первой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Проблема разработки новых лекарственных средств» (Москва, 2013 г.); конференции лаборатории фармакокинетики ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН (Москва, 2013 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 3 статьи (в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ), 1 статья и 4 тезиса докладов в материалах российских и международных конференций.
Объем и структура диссертации
Фенотипирование по активности изофермента CYP1A2
Соединения различных химических классов, в том числе лекарства, могут оказывать влияние на активность ферментов биотрансформации ЛС, при этом возможна либо индукция (повышение активности), либо ингибирование (снижение активности) ферментов. Индукция и ингибирование ферментов биотрансформации ЛС имеют безусловное значение для фармакотерапии, составляя основу фармакокинетического взаимодействия [7, 13, 116, 158].
Индукция ферментов метаболизма выражается в абсолютном увеличении количества энзимов и их активности в результате воздействия на них определенного реагента, в частности ЛС. Процесс индукции вызывает ускорение реакций биотрансформации и обычно приводит к снижению фармакологической активности, а значит эффективности препаратов, применяемых совместно с индуктором. Различные субстраты вызывают индукцию ферментов биотрансформации ЛС, отличающихся между собой молекулярной массой, субстратной специфичностью, иммунохимическими и спектральными характеристиками. Более того, у разных людей интенсивность индукции ферментов может существенно отличаться [13, 116].
Описаны следующие механизмы индукции:
Фенобарбиталовый. Данный механизм, наиболее характерен для, так называемой, «аутоиндукции». Аутоиндукция представляет собой адаптивный механизм, инактивации ксенобиотиков. Среди ЛС типичными аутоиндукторами являются производные барбитуровой кислоты, в частности, среди которых особенно выделяется фенобарбитал. Отсюда название механизма индукции.
Рифампицин-дексаметазоновый. Активность изоферментов цитохрома P450 1A1, 3A4, 2B6 возрастает при взаимодействии молекулы индуктора со специфическими рецепторами, принадлежащими к классу белков – регуляторов транскрипции: прегнан-Х-рецептор (PXR), Ah-рецептор, CAR-рецептор.
Этаноловый. Стабилизация молекулы фермента биотрансформации ЛС вследствие образования комплекса с некоторыми ксенобиотиками (этанол, ацетон) [11].
Ингибирование ферментов метаболизма ЛС представляет собой угнетение активности ферментов метаболизма под действием ксенобиотиков. При снижении активности ферментов метаболизма ЛС, повышается концентрация их субстратов в крови и это может стать причиной развития нежелательных лекарственных реакций. Ингибирование изоформами цитохрома Р450 метаболизма ЛВ при сочетанном применении второго препарата, является одной из главных причин взаимодействия ЛС в организме человека и может привести к серьезным побочным эффектам [13, 84, 116].
Одним из направлений предсказания возможности ингибирования ЛС, является использование данных, полученных in vitro. За последние 20 лет методы in vitro получили бурное развитие, поскольку процедуры проводятся быстро и просто [24, 116, 161].
К настоящему моменту описаны механизмы ингибирования ферментов биотрансформации, которые сводятся к следующему: - Связывание с регуляторной областью гена фермента биотрансформации ЛС. Так происходит ингибирование ферментов биотрансформации под действием большого количества ЛС (циметидин, флуоксетин ципрофлоксацин, эритромицин и т.д.). - Конкурентное метаболическое взаимодействие. Некоторые препараты с высоким аффинитетом к определенным изоферментам цитохрома P450 (верапамил, нифедипин, исрадипин) ингибируют биотрансформацию препаратов с более низкой величиной данного параметра. - Прямая инактивация изоферментов цитохрома P450. Угнетение взаимодействия цитохрома P450 с НАДФ-Н-цитохром P450 редуктазой (фумакумарины сока грейпфрута и лайма) [14]. Для каждого фермента существуют «классические» (стандартные) ингибиторы и индукторы. В частности для CYP1A2 выявлены следующие стандартные ингибиторы и индукторы. Поскольку предметом обсуждения в настоящей работе является возможное воздействие афобазола на активность
Аналитическая аппаратура и средства измерений
Кажущийся клиренс после перорального приема составляет в среднем 0,02-0,14 л/ч/кг, кажущийся объем распределения у взрослых колеблется от 0,3 до 1,0 л/кг. Выводится кофеин в виде метаболитов (теобромина, теофиллина, параксантина) почками, 1-5% кофеина выводятся в неизменном виде [2, 3, 9, 28, 67, 75].
Фармакокинетика кофеина может изменяться под действием препаратов, влияющих на изменение активности CYP1A2 (человек и крысы) или CYP2C (крысы), например, путем аутоиндукции или при помощи определенных антидепрессантов и нейролептиков. Таким образом, пациентам, принимающих кофеин-содержащие препараты, или любителям кофе, принимающих лекарства, которые взаимодействуют с CYP1A2, может потребоваться корректировка дозы приема кофеина внутрь или прекращение приема.
Установлено, что кофеин и его метаболиты являются сильными ингибиторами переносчиков органических анионов у человека [154], которые встречаются в легких, почках, и яичках человека [113], а также в гематоэнцефалическом барьере, что было показано на культуре эндотелиальных клеток человеческого мозга [85]. Период полувыведения кофеина составляет 4-5 ч, но этот параметр может быть пролонгирован у пациентов с заболеваниями печени, у новорожденных (до 100 часов), или во время беременности [64, 77, 101]. Его биотрансформация ограничивается главным образом печенью (связано с активностью CYP1A2), а выведение неизмененного соединения почками составляет 3% [59, 100, 122].
Моделирование, основанное на исследованиях близнецов, показывает, что генетика играет важную роль в индивидуальной изменчивости при употреблении кофеина и при прямом воздействии кофеина. Фармакодинамические и фармакокинетические полиморфизмы были обусловлены действием кофеина. Эти данные могут помочь в будущем при исследовании роли генетики в формировании острых и хронических эффектов кофеина [168].
Lelo A., Birkett D.J. и др. изучали фармакокинетику кофеина, параксантина, теобромина и теофиллина на 6 здоровых добровольцах мужского пола после перорального приема каждого компонента в отдельных случаях. Общий плазменный клиренс кофеина и параксантина имел приблизительно одинаковые значения (2,07 и 2,20 мл/мин/кг, соответственно) так же как и для теофиллина и теобромина (0,93 и 1,20 мл/мин/кг, соответственно). Плазменный клиренс несвязанного кофеина и параксантина был так же близок по величине (3,11 и 4,14 мл/мин/кг, соответственно), как и для теофиллина и теобромина (1,61 и 1,39 мл/мин/кг, соответственно). Периоды полувыведения теофиллина и теобромина (6,2 и 7,2 ч, соответственно) были значительно больше периодов полувыведения кофеина и параксантина (4,1 и 3,1 ч, соответственно). Кажущийся объем распределения в стационарном состоянии теофиллина (0,441 л/кг) был меньше, чем у других метилксантинов (0,630-0,721 л/кг). Однако объем распределения свободной фракции теофиллина (0,771 л/кг), оказался таким же, как и для теобромина (0,791 л/кг), в то время как для параксантина (1,180 л/кг) этот параметр был близок по значению к объему распределения кофеина (1,061 л/кг) [114].
Изофермент CYP1A2 метаболизирует ряд ЛС, включая клозапин, оланзапин и теофиллин. Эти лекарственные препараты демонстрируют высокую степень межиндивидуальных различий фармакокинетического ответа. Измерение активности CYP1A2 in vivo может являться важным инструментом для выявления факторов, влияющих на изменчивость фармакокинетики препарата, и помогать в подборе дозы препаратов, метаболизируемых данной изоформой [76]. До настоящего времени кофеин остается единственным соединением, применяемым для проведения фенотипирования CYP1A2 in vivo [13].
Существует большое количество матриц (биологические жидкости, содержащие препарат, и/или метаболита/ы) для измерения активности CYP1A2 с помощью кофеина. На данный момент потенциальное влияние периода метилксантинового воздержания на фенотипирование CYP1A2 и воздействие кофеина на определение активности CYP1A2 являются актуальными вопросами [130].
В исследовании Teekachunhatean S. и соавт. проведен сравнительный анализ фармакокинетики кофеина после введении в виде клизмы и приема одной порции кофе. Относительная биодоступность кофеина после кофеиновой клизмы, была в 3,5 раза меньше, чем после перорального потребления кофе [157].
Работа Wilkinson J.M. и соавт. посвящена распределению кофеина и его метаболитов (теофилина, теобромина, параксантина) в мозге 20-дневного плода крысы и плазме крови взрослого человека. Установлено, что значения AUC кофеина в мозге плода крысы и плазме крови взрослого человека не отличались для мозга и плазмы при одинаковой дозировке (5 или 25 мг/кг). Однако метаболиты кофеина накапливались в мозге плода при введении обеих доз, в результате чего наблюдалось трехкратное увеличение образования метаболитов по сравнению с уровнем кровообращения плода. Поскольку многие аспекты метаболизма кофеина схожи у крыс и человека, предполагается, что потреблению кофеина во время беременности должно уделяться особое внимание [167].
Фармакокинетические параметры, используемые для интерпретации экспериментальных данных метаболитов из мочи
Полученные экспериментальные данные были статистически обработаны с помощью программы «Excel v. 11.0». Достоверность различий для сравниваемых концентраций исследуемых соединений оценивали с помощью критерия Стьюдента (программа «Statistica 6.0») [20].
Поскольку на каждую временную точку использовали по 8 животных, результирующая фармакокинетическая кривая была построена по усредненным концентрациям, поэтому при расчетах фармакокинетических параметров отсутствует статистическая обработка результатов.
Рисунки были выполнены с использованием графического редактора «Origin v. 7.0». В таблицах представлены следующие статистические характеристики: Mean ( х) - среднее арифметическое; SD - стандартное отклонение; S х - стандартная ошибка среднего арифметического; А х - 95% доверительный интервал результата отдельного определения; s% - относительная погрешность отдельного определения. Заключение
Воспроизведенная и модифицированная методика ВЭЖХ может применяться для количественного определения кофеина и его метаболитов в биопробах. Метод обладает рядом достоинств: время определения каждой пробы составляет около 8 мин, простая пробоподготовка. Методику можно использовать для оценки активности изоформы CYP1A2 при изучении межлекарственных взаимодействий.
Материалы данной главы были опубликованы в следующей печатной работе: 1. Новицкая Я.Г. Количественный анализ кофеина и его метаболитов в плазме крови крыс с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии как метод для определения метаболических отношений. [Текст]/Я.Г. Новицкая, А.А. Литвин, В.П. Жердев, Е.В. Блынская, С.Э. Кондаков// Вестн. Моск. Сер. 2. Химия. Ун-та. - 2013. - Т.54,№1. - С. 56-60. Глава 3. Оценка фармакокинетического взаимодействия афобазола с препаратом-субстратом цитохрома CYP1A2 в эксперименте
В данной главе представлены данные по влиянию афобазола на изофермент CYP1A2 с использованием маркера – кофеина.
Предполагается, что изменение величины AUCo кофеина в сторону уменьшения в зависимости от продолжительности введения афобазола можно объяснить повышением интенсивности биотрансформации исходного соединения и как следствие индукцией изоформы CYP1A2. И наоборот, увеличение AUCo кофеина при прочих равных условиях можно объяснить снижением интенсивности биотрансформации препарата–маркера и как следствие ингибированием CYP1A2.
В случае метаболитов кофеина (теобромин, параксантин) увеличение соответствующих значений AUCo в зависимости от длительности введения афобазола приведет к индукции изучаемой изоформы (повышение интенсивности биотрансформации исходного соединения), а уменьшение AUCo – к ингибированию фермента.
Кофеин (1,3,7-триметилксантин) является алкалоидом пуринового ряда. При попадании в организм человека и животных в результате биотрансформации кофеина образуется ряд метаболитов (теобромин, теофиллин, параксантин и 1,3,7-триметилмочевая кислота) [158]. Известно, что в организме кофеин метаболизируется в основном представителем суперсемейства цитохромов Р450 изоферментом CYP1А2. Данный изофермент участвует в метаболизме таких препаратов, как атипичные нейролептики (клозапин, оланзапин), фторхинолоны, циметидин, рифампицин, фенобарбитал и др. Все это делает кофеин и его метаболиты одним из наиболее широко используемых маркеров активности изофермента CYP1A2 для изучения комбинированного действия лекарственных препаратов [13, 58].
Цель данного этапа – изучение фармакокинетического взаимодействия афобазола с препаратом – субстратом изоформы CYP1A2 у крыс. 3.1. Влияние дозы и режима дозирования афобазола на фармакокинетику кофеина и его метаболитов у крыс
В данном разделе представлены результаты влияния афобазола на фармакокинетику субстратного маркера CYP1A2 – кофеина и его метаболитов после различных режимов введения анксиолитика в эксперименте.
Материалы и методы Исследование проводили на белых беспородных крысах-самцах (масса тела 200±20 г), полученных из питомника «Столбовая» РАМН (см. гл. 2 раздел. 2.4).
Анализ проб плазмы крови крыс проводили с использованием метода ВЭЖХ. Методики извлечения из плазмы крови и количественного определения исследуемых веществ подробно изложена в гл. 2 (см. раздел. 2.5.4, 2.5.5.1 и 2.5.5.2).
Образцы крови отбирали в течение 24 ч. Поскольку на каждую временную точку использовали по 8 животных, результирующую фармакокинетическую кривую строили по усредненным концентрациям.
Для изучения влияния величины вводимой дозы на изучаемые процессы использовали эффективную, анксиолитическую дозу афобазола – 5 мг/кг [144] и дозу в 5 раз превышающую таковую.
Второй фактор, оцениваемый в настоящем исследовании, – влияние длительности введения крысам афобазола в дозе 25 мг/кг на возможный индуцирующий или ингибирующий эффекты.
Препарат-маркер кофеин вводили животным в дозе 50 мг/кг. Выбор доз афобазола и кофеина продиктован низкой токсичностью препаратов. Так LD50 афобазола для крыс составляет 1100 мг/кг [23].
Оценка метаболических отношений кофеина и его метаболитов после различных режимов дозирования
Влияние новых лекарств на изоформы цитохрома P450 необходимо оценивать уже на доклиническом этапе в экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo. Несмотря на технологические преимущества в проведении in vitro исследований, интерпретация полученных параметров остается проблематичной из-за невозможности корректной экстраполяции на целостный организм [161].
Последнее определяет высокую вероятность ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Поэтому предпочтительным представляются опыты in vivo с использованием в качестве экспериментальной модели беспородных крыс. Установлено, что белки CYP1A1, 1A2, 2C8, 2C9, 2D6 и 3А4 человека и CYP 1A1, 1A2, 2C13, 2C11 2D1 и 3A1(23) крыс гомологичны на 78%, 70%, 68%, 77%, 71% и 73%, соответственно [112].
Имеются обоснованные данные о сходстве в субстратной специфичности этих изоформ цитохрома Р450 у человека и крыс [104].
В соответствии с рекомендациями регуляторных органов, действующими в Евросоюзе, Российской Федерации, США и Японии, разработчики ЛС представляют информацию о биотрансформации новых препаратов и их влиянии на участвующие в метаболизме лекарств изоформы цитохрома Р450. Для использования в качестве позитивного контроля приводятся стандартные индукторы и ингибиторы активности различных изоформ цитохрома Р450, набор которых ежегодно, с накоплением новой информации, обновляется и дополняется [24, 38, 125, 160].
Ранее нами было показано, что афобазол в диапазоне анксиолитических доз не изменял активность изофермента CYP1A2 [19]. В данной работе адекватность и избирательность примененной методологии оценки индуцированных изменений цитохрома in vivo доказывается регистрацией его активности по МО маркера после введения крысам афобазола в сравнении со стандартными ингибиторами и индукторами.
Цель данного этапа – доказать адекватность и избирательность разработанной методологии на примере определения изменения активности изоформы CYP1A2 после введения стандартных ингибиторов и индукторов данного изофермента в эффективных дозах у крыс.
Материалы и методы
Исследование проводили на белых беспородных крысах-самцах (масса тела 200±20 г), полученных из питомника «Столбовая» РАМН (см. гл. 2 раздел. 2.4). Изменение активности CYP1A2 под влиянием афобазола, индуктора или ингибитора проводили на выборке из 24 животных. Крыс разделили на 3 группы по 8 особей в каждой. Введение афобазола в дозе 5 мг/кг – группа I, фенитоина в дозе 10,4 мг/кг - группа II, ципрофлоксацина в дозе 44,0 мг/кг – группа III.
В качестве препарата-маркера для изоформы CYP1А2 использовали кофеин, который вводили животным перорально, однократно в дозе 50 мг/кг без и на фоне субхронического введения афобазола, фенитоина и ципрофлоксацина. При изучении влияния афобазола, индуктора или ингибитора на изменение активности CYP1A2 крысам каждой группы сначала вводили кофеин без афобазола, индуктора или ингибитора (контроль), затем по истечении 3-х суток этим же животным вводили афобазол (индуктор или ингибитор) в течение 4-х суток (субхроническое введение). Последнее введение афобазола (индуктора или ингибитора) производили вместе с кофеином. При изучении влияния афобазола, индуктора или ингибитора на изменение активности изоформы CYP1A2 сбор мочи проводили по схеме, описанной в гл. 2 (см. раздел. 2.5.2). Методики экстракции и количественного определения кофеина его метаболитов подробно изложены в гл. 2 (см. раздел. 2.5.4, 2.5.5.3 и 2.5.5.4) [18].
В качестве индуктора изоформы CYP1А2 использовали фенитоин. Этот препарат относятся к группе умеренных индукторов. В качестве ингибитора изоформы CYP1А2 использовали ципрофлоксацин. Препарат относится к сильным ингибиторам. Выбранные индуктор и ингибитор рекомендованы для оценки активности соответствующих изоформ у человека [160]. Эффективные дозы фенитоина и ципрофлоксацина рассчитывали, исходя из терапевтических доз для человека по соответствующей формуле [135]:
