Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 24
1.1. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации и тенденции ее развития на ближайшее десятилетие 24
1.2. Пробиотики как новый класс современных медицинских иммунобиологических препаратов 34
1.3. Биологически активные вещества, синтезируемые пробиотическими микроорганизмами родов Bacillus и Lactobacillus 43
1.4. Краткий обзор современного состояния рынка фармакологических препаратов (отечественных и импортных) на основе пробиотических бактерий 52
1.5. Пограничные покровы тела. Нормофлора кожи, ее значение и функции...64
1.6. Роль нормальной микрофлоры для обеспечения постоянства микробиоценоза полости рта 75
1.7. Значимость микробиологического фактора в противоинфекционной защите женщин при некоторых генитальных инфекциях 80
1.7.1. Способы коррекции дисбиозов влагалища 84
1.8. Острые и хронические заболевания печени - одна из важных проблем современной клинической медицины 87
1.8.1. Морфофункциональные особенности печени 88
1.8.2. Уровень и характер регистрируемой в настоящее время заболеваемости гепатобилиарной системы 92
1.8.3. Современные фармакологические препараты для лечения патологических состояний печени 96
Глава 2. Результаты собственных исследований 101
2.1. Материалы и методы исследований 101
2.1.1. Микроорганизмы и препараты, используемые в работе 101
2.1.2. Лабораторные животные и экспериментальные модели 114
2.1.3. Материалы, питательные среды 119
2.1.4. Методы физико-химических, биохимических и иммунологических исследований 120
2.1.5. Статистическая обработка результатов исследований 126
2.2. Разработка экспериментальных образцов пробиотических препаратов для наружного применения на основе транскутанных проводников 128
2.2.1. Изучение биологических свойств и сохраняемости микроорганизмов в составе экспериментальных образцов препаратов 146
2.2.1.2. Доклиническая оценка безопасности и активности мягких лекарственных форм 152
2.2.1.3. Изучение терапевтической эффективности гелевых пробиотических препаратов на моделях инфекционных процессов пограничных покровов тела 173
2.2.1.3.1. Биохимические исследования сыворотки крови лабораторных животных при оценке терапевтической эффективности испытуемых препаратов на моделях локализованной гнойной инфекции кожи 188
2.2.1.3.2. Влияние исследуемых образцов пробиотического препарата бацилакт на некоторые факторы клеточного и гуморального иммунитета при экспериментальном моделировании кожного инфекционного процесса 193
2.2.1.4. Изучение терапевтической эффективности гелевых пробиотических препаратов на моделях резаных ран кожных покровов 203
2.2.1.5. Фармакокинетика биокомпонента препарата бацилакт 207
2.3. Фармакологическое изучение экспериментального образца пробиотического препарата дентозар 210
1. Конструирование экспериментального образца метаболического препарата 210
2. Фармакологические и морфологические исследования экспериментального образца зубного эликсира дентозар 223
2.1. Определение «острой» токсичности 223
2.2. Изучение «хронической» токсичности 225
2.2.1. Изучение некоторых других показателей «хронической» токсичности 228
2.2.2. Патоморфологические исследования 233
2.2.3. Лабораторные исследования экспериментального образца дентозара 243
2.2.4. Исследование общего и биохимического анализа крови лабораторных животных 246
3. Клинико-лабораторные экспресс-исследования экспериментального
образца зубного эликсира дентозар 252
Разработка экспериментального образца бикомпонентного
метаболического пробиотика фемивит и обоснование
возможности его применения у больных с инфекционно-
воспалительными заболеваниями гинекологического профиля 259
1. Фармакологические и морфологические исследования
экспериментального образца средства интимной гигиены фемивит 269
1.1. Изучение «острой» и «хронической» токсичности экспериментального образца фемивита 269
1.2. Экспериментальное изучение ориентировочно-исследовательских реакций у лабораторных животных 283
2. Доклиническое изучение сердечной деятельности белых крыс после применения экспериментального образца препарата фемивит 285
3. Сравнительная оценка влияния изучаемого экспериментального образца фемивит на некоторые показатели периферической крови 289
3.1. Общий анализ периферической крови 289
2.4.3.2. Оценка влияния экспериментального образца препарата на липидный обмен 295
2.4.4. Обоснование целесообразности терапевтического применения экспериментального образца фемивита у больных бактериальным вагинозом 298
2.5. Разработка экспериментального образца пробиотического гепатопротектора гепатобиол 304
2.5.1. Выбор микроорганизмов и создание пробиотического препарата с выраженным гепатопротекторным действием 305
2.5.1.1. Выбор микроорганизмов для конструирования экспериментального образца гепатопротекторного средства 306
2.5.1.2. Обоснование критериев для отбора штаммов Bacillus subtilis 307
2.5.2. Экспериментальная оценка протекторных свойств споровых культур штаммов Bacillus subtilis на лабораторных животных при моделировании у них острого токсического поражения печени 314
2.5.3. Композиционный состав экспериментального образца гепатопротекторного средства гепатобиол 325
2.5.3.1. Изучение протекторных свойств комплекса биологически активных веществ штамма В. subtilis на культуре клеток гепатоцитов 327
2.5.4. Изучение токсического влияния различных концентраций четыреххлористого углерода на культуру клеток крысиных гепатоцитов 332
2.5.4.1. Изучение цитопротекторных свойств БАВ, продуцируемых штаммом Bacillus subtilis В-9906, на модели токсического поражения клеток печени 333
2.5.5. Конструирование экспериментального образца гепатопротекторного средства 339
2.5.6. Доклиническая оценка фармакологической эффективности
гепатопротекторного экспериментального образца препарата
гепатобиол 344
2.5.6.1. Оценка безопасности экспериментального образца препарата гепатобиол для лабораторных животных 344
2.5.6.1.1. Патоморфологические исследования печени 350
2.5.6.1.2. Исследование биохимических показателей 357
2.5.6.1.3. Исследование показателей гуморального статуса 361
2.5.7. Фармакодинамика и фармакокинетика клеточного компонента
экспериментального образца гепатопротекторного препарата 371
Заключение 375
Выводы 393
Практические рекомендации 397
Список литературы
- Биологически активные вещества, синтезируемые пробиотическими микроорганизмами родов Bacillus и Lactobacillus
- Методы физико-химических, биохимических и иммунологических исследований
- Влияние исследуемых образцов пробиотического препарата бацилакт на некоторые факторы клеточного и гуморального иммунитета при экспериментальном моделировании кожного инфекционного процесса
- Разработка экспериментального образца пробиотического гепатопротектора гепатобиол
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
В настоящее время в Российской Федерации наблюдаются существенные изменения в окружающей среде обитания. Нарастают неблагоприятные факторы (как экологические, так и социальные), ухудшаются условия жизни отдельных групп населения (особенно в регионах и сельской местности), качество атмосферного воздуха, продуктов питания, питьевой воды. Обеспеченность и доступность современными эффективными и безопасными лекарственными средствами достигли такого уровня, что это стало серьезно влиять на состояние здоровья населения страны, уровень заболеваемости и эпидемическую ситуацию по ряду инфекций (Гарбузов Г.А. Дисбактериоз: лечение и профилактика без лекарств. СПб.: Изд-во “Питер”, 2012. 224 с; Ивушкина Л.И. и соавт. Грамотрицательная условно-патогенная микрофлора - этиологический агент вторичной инфекции у больных туберкулезом легких. Антибиотики и химиотерапия. 2006. Т.51, №1. С.11-13; Онищенко Г.Г. Санитарно-эпидемиологическая обстановка. Режим доступа: epidemiologic_situation/6114/. html.; Melstrom K.A.J. et al. New perspectives for a new century : implications of pathogen responses for the future of antimicrobial therapy. J. Burn. Care. Res. 2006. Vol.27, №3. P.251-264).
По данным различных источников существенно увеличилась не только общая инфекционная заболеваемость, но и количество инфекций, отличающихся вялотекущим, рецидивирующим и хроническим течением. Возросло и число инфекционных поражений, вызываемых условно-патогенными возбудителями (Онищенко Г.Г. О состоянии заболеваемости внутрибольничными инфекционными болезнями. Стерилизация и госпитальные инфекции. 2006, №1. С.5-7; Rodryguez-Bano J. еt al. Clinical and Molecular Epidemiology of Extended-Spectrum (3-Lactamase-Producing Escherichia coli as a Cause of Nosocomial infection or Colonization : Implications for Control. Clin. Infect. Dis. 2006. Vol. 42. P.37-45). Значительное внимание уделяется изучению различных видов таких микроорганизмов, их этиологической и патогенетической роли в возникновении тех или иных патологических состояний (Акимкин В.Г. Актуальные вопросы эпидемиологии внутрибольничных инфекций. М.: ММА им. И.М. Сеченова, 2000. 34 с).
В настоящее время все большую значимость приобретает проблема борьбы с воспалительными и гнойными заболеваниями кожных покровов и слизистых. По данным ряда авторов неудовлетворительные результаты лечения таких поражений существенно возросли (Nordmann P. et al. Emergence of plasmid-mediated resistance to quinolones Emergence of plasmid-mediated resistance to quinolones in Enterobacteriaceae. J. Antimicrob. Chemother. 2005. Vol. 56. P.463-469; Phaff S.J. et al. Macrolide resistance of Staphylococcus aureus and Haemophilus species associated with long-term azithromycin use in cystic fibrosis Macrolide resistance of Staphylococcus aureus and Haemophilus species associated with long-term azithromycin use in cystic fibrosis. J. Antimicrob.
Chemother. 2006. Vol.57. P.741-746; Piddock L.J. Clinically relevant chromosomally encoded multidrug resistance efflux pumps in bacteria. Clin. Microbiol. Rev. 2006. Vol.19, №2. P.382-402).
Данные о заболеваемости людей пародонтитом и пародонтозом (более чем 95 и 80 % взрослого населения соответственно) хорошо известны. В настоящее время можно сказать, что это два наиболее распространенных в мире заболевания. Лечение их, как правило, комплексное, достаточно сложное, длительное и в целом дорогостоящее. Предлагаемые лекарственные и профилактические средства недостаточно эффективны (Грудянов А.И. и соавт. Применение пробиотиков в комплексном лечении воспалительных заболеваний пародонта. М.: МИА, 2006. 112 с.; Матисова Е.В. Колонизация условно-патогенными микроорганизмами слизистой оболочки полости рта при хроническом пародонтите : дис… канд. мед. наук. Волгоград, 2010. 146 с.).
На фоне роста заболеваемости населения РФ особую тревогу вызывает
снижение показателей женского здоровья. Так, количество женщин, страдающих
бесплодием, составляет около 20%, а нарушения нормального состава вагинальной
микрофлоры отмечается более чем в 70% всех наблюдаемых случаев.
Сформировавшиеся дисбиотические явления поддерживают патологические
процессы в органах малого таза, препятствуют наступлению беременности, создают
реальную угрозу осложнений у матери и ребенка (Анкирская А.С. и соавт.
Мониторинг видового состава и чувствительности к антимикотикам
дрожжеподобных грибов, выделенных из влагалища женщин репродуктивного возраста. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2006. Т.8, №1. С.87-95; Инфекции в акушерстве и гинекологии. Под ред. О.В. Макаровой, В.А. Алешкиной, Т.Н. Савченко. М.: МЕДпресс-информ, 2007. 464 с.).
Увеличивается количество больных вирусными гепатитами, а также гепатитами токсической, алкогольной и лекарственной этиологий. Они являются этиологической причиной более 50% случаев циррозов печени. Ежегодно в мире регистрируется более 500 млн. заболевших вирусными гепатитами. В РФ количество больных с циррозом возрастает на 200 тыс. чел. в год. Ежегодное увеличение числа больных гепатобилиарными заболеваниями весьма значительное и составляет от 15 до 30% населения (Гончикова С.Н. и соавт. Дизрегуляция апоптоза гепатоцитов при различных поражениях печени, возможности фитокоррекции. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2009. №2 (99). С.236-238; Ивашкин В.Т. О состоянии организации медицинской помощи больным с заболеваниями органов пищеварения в Российской Федерации. Рос. журн. гастроэнтерол. 2004. Т.14, №3. С.4-9; Гепатология : избранные лекции по внутренним болезням : Под ред. А.С. Празднова. Челябинск: ЧелГМА, 2002. №8. 146 с.).
Приведенные факты, с учетом потенциальной опасности постоянного их нарастания, охвата все большего количества, в первую очередь, трудоспособного
населения РФ, можно без преувеличения отнести не только к
широкораспространенным, но и к социально-значимым заболеваниям со всеми вытекающими отсюда последствиями.
В этой связи целесообразным представлялось использование для лечения различных заболеваний пробиотических препаратов, которые в настоящее время считаются наиболее адекватными и эффективными профилактическими и лекарственными средствами (Осипова И.Г. Экспериментально-клиническое изучение споровых пробиотиков : дис… д-ра биол. наук. М., 2006. 283 с.; Сорокулова И.Б. Теоретическое обоснование и практика применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых пробиотиков : автореф. дис… д-ра биол. наук. Киев, 1999. 32 с.; Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание : пробиотики и функциональное питание. М.: Грантъ, 2001. Т.III. 288 с.).
Таким образом, наши усилия были сосредоточены на разработке современных (в том числе и новых видов) фармацевтических препаратов для использования в практической медицине по таким направлениям, как: травматические и инфекционные поражения кожных покровов; воспалительные заболевания тканей и органов полости рта (хронический генерализованный пародонтит); бактериальный вагиноз; токсические поражения гепатобилиарной системы.
Цель исследования
Целью настоящей работы было проведение экспериментальных исследований по обоснованию актуальных направлений разработки, получению и изучению новых фармакологических препаратов на основе пробиотических микроорганизмов и их биологически активных метаболитов, определению путей их практического применения для лечения таких значимых заболеваний, как инфекционные и травматические поражения кожных покровов, хронический генерализованный пародонтит, бактериальный вагиноз и острый токсический гепатит.
Задачи исследования
-
Провести исследования по обоснованию разработки экспериментальных образцов новых медицинских препаратов и их использования для лечения: в терапии – острого токсического гепатита, в хирургии – инфекционных и травматических поражений кожных покровов, в стоматологии – хронического генерализованного пародонтита, в гинекологии – бактериального вагиноза.
-
Сконструировать экспериментальные образцы фармакологических пробиотических препаратов в мягкой (бацилакт) и жидкой (дентозар, фемивит, гепатобиол) лекарственных формах.
-
Провести на различных видах лабораторных животных доклинические испытания созданных экспериментальных образцов пробиотических препаратов и обосновать рекомендации по их практическому применению.
-
На экспериментальных моделях изучить основные механизмы действия разработанных образцов пробиотиков.
5. Разработать проекты нормативных документов, необходимых для реализации и внедрения результатов выполненной работы.
Методология и методы исследования
Работа выполнена в 2007-2012 гг. на кафедре фармакологии и клинической фармакологии в соответствии с планами НИР ГБОУ ВПО “Уральский государственный медицинский университет” Минздрава России. Иммунофармаколо-гические исследования проведены в Институте иммунофизиологии и иммунофарма-кологии УрО РАН (г. Екатеринбург).
На начальном этапе исследований были изучены по своим родовым и видовым
характеристикам различные пробиотические микроорганизмы, по комплексу
предложенных нами объективных критериев выбраны наиболее оптимальные
штаммы, на основе которых в последующем были сконструированы
экспериментальные образцы пробиотиков, изучены в доклинических исследованиях на адекватных экспериментальных моделях их безопасность и фармакологическая активность. Терапевтическая эффективность разработанных пробиотических препаратов дентозар и фемивит была также изучена в пилотных клинических экспресс-исследованиях.
Для решения поставленных задач автором использован комплекс современных методов, включающих методы индикации и идентификации микроорганизмов, изучения их биохимических и антагонистических свойств, высокоэффективной жидкостной хроматографии, иммуноферментного анализа, оценки терапевтической эффективности препаратов на различных экспериментальных моделях, в том числе и на клеточных культурах. В работе было задействовано 1755 лабораторных животных.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и рекомендаций базируется на достаточном числе наблюдений и использовании современных методов статистической обработки материалов исследования, при консультативном участии специалистов в области математического анализа, с использованием пакетов компьютерных программ Microsoft Office Excel 2007 и “Statistica 6.0”.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 62-й, 64-й, 65-й, 68-й
межвузовских научно-практических конференциях «Актуальные вопросы
современной медицинской науки и здравоохранения» (Екатеринбург, 2007, 2009, 2010, 2013); III Съезде Фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007); VI Всероссийском научном семинаре с молодежной научной школой (Уфа, 2007); Российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию ПГФА (Пермь, 2007); ежегодной Российской научно-практической конференции “Фармация и общественное здоровье” с международным участием (Екатеринбург, 2008, 2009, 2010, 2011, 2012); научно-практической конференции “Высокие технологии и инновации – российской экономике” (Екатеринбург, 2008); третьей межрегиональной
специализированной Выставке-конференции “Национальный проект – здоровье”
(Екатеринбург, 2008); the International conference Рharmacology (Harbin, China, 2008);
VII Международном конгрессе “Доказательная медицина – основа современного
здравоохранения” (Хабаровск, 2008); II Международной научно-практической
конференции “Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным
факторам среды” (Челябинск, 2008); Российской научно-практической конференции
ПГФА, проводимой в рамках 14-ой международной выставки “Медицина и здоровье”
(Пермь, 2008); научно-практической конференции с международным участием
“Достижения клинической фармакологии в России” (Москва, 2009); Всероссийской
научно-практической конференции “Актуальные проблемы фармацевтической науки
и практики” (Владикавказ, 2009); XI, XII, XIII, XIV, XV международных конгрессах
«Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013);
межрегиональной научно-практической конференции “Актуальные вопросы
современной физиологии и медицины” (Ижевск, 2010); IV Съезде фармакологов России “Инновации в современной фармакологии” (Казань, 2012); Евразийском Конгрессе с международным участием “Медицина, фармация и общественное здоровье” (Екатеринбург, 2013); VIII Всероссийской конференции с международным участием “Иммунологические чтения в г. Челябинске” (Челябинск, 2013); Всероссийской конференции с международным участием “Современные проблемы биохимии и биотехнологии” (Уфа, 2013).
Результаты настоящей диссертационной работы доложены и обсуждены в ГБОУ ВПО “Уральский государственный медицинский университет” Минздрава России на межкафедральном заседании, протокол №12 от 21.06.2013 г. и проблемной комиссии по фармакологии и фармации протокол №14 от 25.06.2013 г.
Личное участие автора в выполнении исследований, результаты которых
изложены в данной научно-квалификационной работе, заключались в следующем:
теоретические исследования выполнены автором лично в полном объеме; автором
обоснованы основная идея работы, ее цели, конкретные задачи и методология
выполнения экспериментальных исследований; автор непосредственно осуществлял
организацию, планирование, выполнение более 95% всего объема работ, анализ и
обобщение полученных результатов; лично автором впервые предложены к
использованию моно-, бикомпонентные метаболические и комбинированные
пробиотики в качестве новых фармакологических препаратов; выбраны
перспективные штаммы микроорганизмов и их биологически активных веществ; обоснован комплекс критериев и экспериментальные модели для оценки свойств пробиотиков, проведена оценка терапевтической эффективности полученных образцов. Автором сформулированы основные положения, выносимые на защиту, заключение, выводы и предложения по практическому применению полученных результатов.
В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве со специалистами Уральского государственного медицинского университета, Института иммунологии и физиологии УрО РАН, Ижевской государственной медицинской академии и других организаций.
Положения, выносимые на защиту
-
Экспериментальные образцы пробиотика бацилакт, на основе гелевых форм транскутанных проводников (тизоль, эфтидерм, кремнийтитанорганический глицерогидрогель), метаболических препаратов дентозар и фемивит, а также комбинированный препарат гепатобиол являются новыми эффективными лекарственными средствами.
-
Лечебный эффект предлагаемых экспериментальных препаратов обеспечивается высокой биохимической и антагонистической активностью пробиотических бактерий в отношении различных видов условно-патогенных (патогенных) возбудителей инфекционных заболеваний; комплексом, продуцируемых ими биологически активных веществ и выраженными иммуномодулирующими свойствами.
-
Разработанные и изученные экспериментальные образцы пробиотических препаратов могут быть рекомендованы как самостоятельно (монотерапия), так и для включения в комплексную систему лечения больных с такими широко распространенными и социально-значимыми заболеваниями, как инфекционные и травматические повреждения кожных покровов, хронический генерализованный пародонтит, бактериальный вагиноз, токсические поражения гепатобилиарной системы.
-
Внедрение разработанных пробиотиков в различных лекарственных формах существенно расширит фармацевтический рынок Российской Федерации, наполнит его новыми эффективными, доступными и недорогими фармакологическими препаратами, позволит значительно снизить зависимость практической медицины от использования антибиотиков и других противомикробных препаратов.
Научная новизна
Критериям научной новизны соответствует вся совокупность результатов проведенных теоретических и экспериментальных исследований. Обоснованы современные направления в исследованиях новых фармакологических препаратов и по их результатам сконструированы и испытаны шесть экспериментальных образцов пробиотиков. Изучены основные механизмы действия полученных пробиотических препаратов.
Впервые созданы препараты нового поколения: моно- и бикомпонентные метаболические (дентозар и фемивит), а также комбинированные (гепатобиол) пробиотики, состав которых представлен как живыми пробиотическими клетками, так и их биологически активными продуктами.
На основании данных лабораторных и доклинических исследований впервые показана терапевтическая эффективность разработанных экспериментальных образцов пробиотических препаратов для лечения ряда широкораспространенных и социально-значимых заболеваний человека: травматических повреждений кожных покровов, осложненных гнойно-воспалительными процессами; хронического генерализованного пародонтита, бактериального вагиноза, острого токсического гепатита.
Обоснованы рекомендации для клинических испытаний в современном практическом здравоохранении предлагаемых новых образцов фармакологических пробиотических препаратов.
Теоретическая и практическая значимость работы
Теоретический вклад в экспериментальную фармакологию состоит в обосновании и реализации новых принципов в конструировании пробиотических препаратов на основе не только живых микроорганизмов, но и метаболических продуктов бактериального синтеза.
Расширены и дополнены критерии выбора микроорганизмов и биологически активных веществ (БАВ), которые целесообразно использовать для создания новых пробиотиков.
На экспериментальных моделях изучен ряд механизмов взаимодействия макроорганизма и пробиотических микроорганизмов, входящих в состав разрабатываемых пробиотических препаратов.
Теоретический вклад в клиническую микробиологию состоит в том, что изучены некоторые особенности циркуляции условно-патогенной микрофлоры при таких дисбиотических и патологических состояниях, как раневые инфекции кожных покровов, бактериальный вагиноз, хронический генерализованный пародонтит, а также динамика их изменений при применении экспериментальных пробиотических препаратов. Впервые установлено наличие гепатопротекторного действия у пробиотических микроорганизмов и их метаболитов.
По результатам выполненных исследований разработаны:
экспериментальные образцы мягкой лекарственной формы препарата бацилакт на основе трех современных транскутанных проводников: кремнийтитанорганичес-кого глицерогидрогеля, тизоля и эфтидерма для лечения травматических и инфекционных поражений кожных покровов;
экспериментальный образец лечебно-профилактического средства
монокомпонентного метаболического пробиотика дентозар для коррекции
микрофлоры и лечения воспалительных заболеваний ротовой полости;
экспериментальный образец бикомпонентного метаболического пробиотика фемивит для восстановления нормальной вагинальной микрофлоры и лечения бактериального вагиноза;
экспериментальный образец комбинированного пробиотического препарата гепатобиол для лечения и профилактики острых и хронических токсических поражений печени;
проекты фармакопейных статей на каждый препарат;
технические условия на предлагаемые препараты;
сборник инструкций по поддержанию в активном и жизнеспособном состоянии пробиотических микроорганизмов, являющихся основой для получения пробиотиков;
технологические инструкции по производству и применению новых пробиотиков.
Все разработанные образцы новых пробиотических препаратов защищены патентами РФ.
Внедрение результатов исследования в практику
Выполнен комплекс экспериментальных исследований разработанных
препаратов, который оформлен в виде “Отчетов о доклинических испытаниях”. Полученные положительные результаты этих испытаний объективно подтверждают перспективность и необходимость проведения их дальнейших (клинических) испытаний, целесообразность доведения предлагаемых экспериментальных образцов препаратов до фармакопейных лекарственных форм и внедрения их в практическую медицину по следующим направлениям: хирургия, терапия, инфекционные болезни, дерматология, гинекология, стоматология.
Результаты исследований внедрены: в учебный процесс для студентов
фармацевтического, лечебно-профилактического, педиатрического, медико-
профилактического и стоматологического факультетов ГБОУ ВПО “Уральский государственный медицинский университет” Минздрава России; в научно-исследовательскую деятельность ГБОУ ВПО “Уральский государственный медицинский университет” Минздрава России, по направлению “Микробиологическая фармакология”, Института иммунологии и физиологии УрО РАН по направлению “Иммунофармакология”, Института органического синтеза им. И.Я. Постовского УрО РАН, ФГБУ “Уральский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. В.Д. Чаклина” Минздрава России; в научно-производственную деятельность ООО “Научно-производственное объединение “УралБиоСинтез”, ООО “Пробиотикфарминвест”, ООО “Дентозар”, ООО “НПЦУ “Медик”.
Публикации
Соискатель имеет 160 опубликованных работы, из них по теме диссертации опубликовано 63 научные работы общим объемом 15,00 печатных листа, в том числе 20 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертации, а также 1 работа в зарубежном научном издании.
Соискателю выдано 9 патентов РФ на изобретения. 33 работы опубликованы в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов.
Объем и структура диссертации
Биологически активные вещества, синтезируемые пробиотическими микроорганизмами родов Bacillus и Lactobacillus
Целью настоящей работы было проведение экспериментальных исследований по обоснованию актуальных направлений разработки, получению и изучению новых фармакологических препаратов на основе пробиотических микроорганизмов и их биологически активных метаболитов, определению путей их практического применения для лечения таких значимых заболеваний, как инфекционные и травматические поражения кожных покровов, хронический генерализованный пародонтит, бактериальный вагиноз и острый токсический гепатит.
Задачи исследования
1. Провести исследования по обоснованию разработки экспериментальных образцов новых медицинских препаратов и их использования для лечения: в терапии - острого токсического гепатита, в хирургии - инфекционных и травматических поражений кожных покровов, в стоматологии -хронического генерализованного пародонтита, в гинекологии -бактериального вагиноза.
2. Сконструировать экспериментальные образцы фармакологических пробиотических препаратов в мягкой (бацилакт) и жидкой (дентозар, фемивит, гепатобиол) лекарственных формах.
3. Провести на различных видах лабораторных животных доклинические испытания созданных экспериментальных образцов пробиотических препаратов и обосновать рекомендации по их практическому применению.
4. На экспериментальных моделях изучить основные механизмы действия разработанных образцов пробиотиков.
5. Разработать проекты нормативных документов, необходимых для реализации и внедрения результатов выполненной работы.
Научная новизна
Критериям научной новизны соответствует вся совокупность результатов проведенных теоретических и экспериментальных исследований. Обоснованы современные направления в исследованиях новых фармакологических препаратов и по их результатам сконструированы и испытаны шесть экспериментальных образцов пробиотиков. Изучены основные механизмы действия полученных пробиотических препаратов.
Впервые созданы препараты нового поколения: моно- и бикомпонентные метаболические (дентозар и фемивит), а также комбинированные (гепатобиол) пробиотики, состав которых представлен как живыми пробиотическими клетками, так и их биологически активными продуктами.
На основании данных лабораторных и доклинических исследований впервые показана терапевтическая эффективность разработанных экспериментальных образцов пробиотических препаратов для лечения ряда широкораспространенных и социально-значимых заболеваний человека: травматических повреждений кожных покровов, осложненных гнойно-воспалительными процессами; хронического генерализованного пародонтита, бактериального вагиноза, острого токсического гепатита.
Обоснованы рекомендации для клинических испытаний в современном практическом здравоохранении предлагаемых новых образцов фармакологических пробиотических препаратов.
Научно-практическая значимость
Теоретический вклад в экспериментальную фармакологию состоит в обосновании и реализации новых принципов в конструировании пробиотических препаратов на основе не только живых микроорганизмов, но и метаболических продуктов бактериального синтеза.
Расширены и дополнены критерии выбора микроорганизмов и биологически активных веществ (БАВ), которые целесообразно использовать для создания новых пробиотиков.
На экспериментальных моделях изучен ряд механизмов взаимодействия макроорганизма и пробиотических микроорганизмов, входящих в состав разрабатываемых пробиотических препаратов.
Теоретический вклад в клиническую микробиологию состоит в том, что изучены некоторые особенности циркуляции условно-патогенной микрофлоры при таких дисбиотических и патологических состояниях, как раневые инфекции кожных покровов, бактериальный вагиноз, хронический генерализованный пародонтит, а также динамика их изменений при применении экспериментальных пробиотических препаратов. Впервые установлено наличие гепатопротекторного действия у пробиотических микроорганизмов и их метаболитов.
По результатам выполненных исследований разработаны: экспериментальные образцы мягкой лекарственной формы препарата бацилакт на основе трех современных транскутанных проводников: кремнийтитанорганического глицерогидрогеля, тизоля и эфтидерма для лечения травматических и инфекционных поражений кожных покровов; экспериментальный образец лечебно-профилактического средства монокомпонентного метаболического пробиотика дентозар для коррекции микрофлоры и лечения воспалительных заболеваний ротовой полости; экспериментальный образец бикомпонентного метаболического пробиотика фемивит для восстановления нормальной вагинальной микрофлоры и лечения бактериального вагиноза; экспериментальный образец комбинированного пробиотического препарата гепатобиол для лечения и профилактики острых и хронических токсических поражений печени; проекты фармакопейных статей на каждый препарат; технические условия на предлагаемые препараты; сборник инструкций по поддержанию в активном и жизнеспособном состоянии пробиотических микроорганизмов, являющихся основой для получения пробиотиков; технологические инструкции по производству и применению новых пробиотиков. Все разработанные образцы новых пробиотических препаратов защищены патентами РФ.
Методы физико-химических, биохимических и иммунологических исследований
В настоящее время по результатам многочисленных теоретических и экспериментальных исследований определена роль и основные функции нормальной микрофлоры человека [3, 21, 85, 108, 150, 191, 207, 236, 256, 259, 301-303, 327, 372, 373, 378, 386, 397, 420, 437, 454-456, 486, 487, 509-513, 527, 528, 542, 549, 559, 594-598].
Так установлено, что нормальная микрофлора участвует в обмене веществ, экзогенных субстратов и метаболитов, белков, жиров, углеводов, холестерина, стероидных гормонов, желчных солей и т.п., регулирует сорбцию и выделение ионов Na, СІ, К, Са, Mg, Zn, Fe, Си, Р, Мп и др., обладает антагонистической активностью к патогенной и условно-патогенной микрофлоре [13, 27, 50, 86, 89, 430, 437, 438, 555, 690, 756], является одним из факторов неспецифической устойчивости, продуцирует биологически активные соединения, в том числе антибиотики и витамины группы В, К и др. Она также обеспечивает колонизационную резистентность микроорганизмов, участвуют в процессах физиологического воспаления и способна оказывать детоксицирующее и антимутагенное воздействие, путем разрушения канцерогенных веществ. Считается также, что нормальная микрофлора - это "хранилище и источник различных хромосомных и плазмидных генов" [86, 327, 329, 367, 372, 378, 386, 397, 542].
Изменения в количественном и качественном состоянии нормомикробиоценоза, которые определяются как дисбиозы, сопровождаются определенными неблагоприятными изменениями в организме человека (воспалительными заболеваниями различных внутренних органов, нарушениями функционирования ЖКТ и гепатобилиарной системы, язвенной и мочекаменной болезнями, артритами, эндогенными инфекциями и т.д.) [41, 52, 162, 176, 237, 259, 288, 327, 378, 379, 391, 398, 399, 420, 487, 507, 528, 542, 549, 550, 559, 637, 656, 660].
Считается, что единственным эффективным способом восстановления состава микрофлоры и нормализации ее функционирования является использование пробиотических препаратов в рамках современной концепции микробиологической терапии [135, 144, 150, 191, 256, 302, 303, 329, 367, 368, 373, 484, 486, 509-513, 594-598, 612].
В настоящее время к числу высокоэффективных лечебно-профилактических медикаментозных средств отечественные и зарубежные специалисты относят пробиотические фармакологические препараты [52, 76, 101, 128, 155, 157, 162, 176, 177, 182-184, 196, 197, 199, 200-202, 207, 235, 244-246, 296, 302, 311, 376, 404, 417, 419, 425, 436, 458, 469, 476, 509, 571, 606-608, 695,702,704,757,761,791].
Пробиотики - медицинские иммунобиологические препараты на основе живых бактерий, антагонистически активных в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и не оказывающих отрицательного влияния на представителей нормальной микрофлоры [45, 142, 143, 150, 197, 242, 272, 274-278, 345, 411, 433, 465, 629, 660, 661, 665, 666, 691, 692, 770, 784, 785].
Термин «пробиотик» предложен в 1974 г. R.B. Parker для обозначения организмов и субстанций, обеспечивающих микробиологическое равновесие кишечной микрофлоры [728].
По мнению Г. А. Сафонова с соавт. [490] данное предложение относится к микроорганизмам и продуктам их ферментации, обладающих антагонистической активностью по отношению к патогенной микрофлоре.
По определению G.R. Gibson, М.В. Robertroid [472], "пробиотики - это микробиологические пищевые добавки, которые благотворно влияют на хозяина путем улучшения микробиологического баланса его кишечника".
Рассматривая проблему дисбиозов, ряд авторов называют биопрепараты из нормальной микрофлоры, используемые для профилактики и лечения этого состояния, эубиотиками [3, 55, 71, 87, 89, 142, 143, 207, 259, 276, 306, 372, 420, 460, 487, 528, 549, 559, 678, 692, 761, 762, 772]. К ним относят препараты, содержащие бифидо- и лактобактерии, Е. coli, споровые формы бактерий [658, 660, 661, 664, 673, 676, 678, 702, 725, 754]. Однако Б.А. Шендеров с соавт. [150, 595, 596, 598] считают, что пробиотиками являются "любые живые или убитые микроорганизмы, их структурные компоненты, метаболиты, а также вещества другого происхождения, позитивно влияющие на функционирование микрофлоры хозяина, улучшающие его адаптацию к окружающей среде в конкретной экологической нише и оказывающие при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции и биохимические реакции организма хозяина через оптимизацию его микробиологического статуса".
Многочисленные исследования по разработке новых медицинских иммунобиологических препаратов и дальнейшему изучению механизмов действия и их фармакологических эффектов дают основание утверждать, что в XXI в. пробиотики смогут занять одно из лидирующих мест на рынке фармакологических препаратов, существенно потеснив традиционные лекарственные средства [52, 76, 101, 124, 128, 162, 182-184, 199-202, 244-246, 296, 299, 300, 321, 329, 347, 707, 788].
В последние десятилетия наряду с пробиотиками в практической медицине применяют также пребиотики и синбиотики. К пребиотиком относят "препараты немикробного происхождения, способные оказывать позитивный эффект на организм хозяина через селективную стимуляцию роста или активности нормальной микрофлоры кишечника" [236, 437, 637, 651, 653, 656, 672, 684, 696, 704, 724, 752, 762]. Так, в качестве таких пребиотиков наиболее известными являются олигосахариды (например, фруктозо- и олигосахариды, активно стимулирующие рост бифидобактерий). Можно предполагать, что наибольший терапевтический эффект можно получить при совместном назначении пробиотиков и пребиотиков. Такие комбинированные препараты получили в настоящее время наименование симбиотиков [598, 427, 606-608, 710,737,761].
Влияние исследуемых образцов пробиотического препарата бацилакт на некоторые факторы клеточного и гуморального иммунитета при экспериментальном моделировании кожного инфекционного процесса
Доклинические исследования гелевых лекарственных форм бацилакта являются неотъемлемым и важным этапом, определяющим объективные показатели действия (влияния) экспериментальных композиций на лабораторных животных. Проводимые in vivo исследования на животных определяет и возможность экстраполяции полученных результатов на человека. В первую очередь нами была проведена доклиническая оценка безопасности и активности мягких лекарственных форм экспериментальных образцов препарата бацилакт.
На первом этапе доклинических испытаний изучали острую и хроническую токсичность.
Острую токсичность определяли на двух видах лабораторных животных (белые мыши и белые крысы) при различных путях введения: подкожном и местном (накожном). Препараты применяли однократно в концентрации -10 микробных клеток, содержащихся в объеме 0,5 см3, и в концентрации, в 10 раз ее превышающей - 10 микробных клеток. В качестве контроля служили животные, в отношении которых аналогично использовали только гелевые композиции без биокомпонента. Вводимая или наносимая доза составляла 0,5 см . Продолжительность наблюдения за животными после введения препаратов составляла 1 сутки. В процессе наблюдения ежедневно фиксировали следующие показатели: общее состояние животных, двигательную активность, интенсивность потребления корма и воды, изменение массы тела, а также регистрировали количество выживших или погибших животных. В таблице 13 представлены данные изучения острой токсичности новых лекарственных форм препарата бацилакт для белых мышей.
В результате изучения острой токсичности экспериментальных образцов пробиотических препаратов установлено, что лабораторные животные во всех группах оставались живыми и признаков интоксикации у них не выявлено в течение всего срока наблюдения. В отношении других контролируемых показателей, то они у животных подопытных групп и контрольных не различались.
Согласно полученным данным, можно отметить, что испытуемые препараты как и при используемой дозе, равной 10 микробных клеток на одно животное (рекомендуемая разовая лечебная доза), так и в случае увеличения дозы на один порядок (10 КОЕ), при исследуемых путях введения не оказывают токсического действия на экспериментальных животных (белые мыши).
Аналогичные результаты были получены при испытании данных препаратов и на белых крысах. В этих исследованиях величины доз также составляли 10 и 10 клеток. Гибель экспериментальных животных ни в одном из изучаемых случаев зафиксировано не было.
Полученные результаты по изучению острой токсичности явились основанием для последующих исследований по оценке влияния испытуемых препаратов на лабораторных животных при их длительном применении (хроническая токсичность).
Хроническую токсичность препаратов изучали на белых мышах при ежедневном накожном нанесении биокомпонента в концентрации 10 и 10 микробных клеток в объеме 0,5 см на животное (подопытная группа) и гелевых композиций без биокомпонентов в том же объеме (контрольная группа) в течение 30 суток. Наблюдение за животными проводили в течение всего периода нанесения испытуемых образцов препаратов и последующих 7 суток, после прекращения аппликаций. Регистрировали потребление корма и воды, изменение массы и температуры тела, состояние волосяного покрова и слизистых оболочек, поведенческие реакции, а также выживаемость (гибель) животных. Результаты изучения хронической токсичности испытуемых препаратов представлены в таблице 14.
При наблюдении за поведением белых мышей после ежедневных аппликаций исследуемых экспериментальных образцов препаратов не отмечали каких-либо отрицательных изменений. Внешний вид животных подопытной группы, состояние шерстного покрова, интенсивность потребления корма и воды не имели отличий от животных контрольной группы. Динамика изменения массы тела и температуры подопытных белых мышей за время наблюдения также практически не различались. В месте нанесения препаратов у всех групп экспериментальных животных отсутствовали гиперемия, отечность, шелушение, усиление капиллярного рисунка кожных покровов.
Хроническую токсичность новых форм пробиотических препаратов изучали также и на белых крысах. Как и в предыдущем случае ни одно из лабораторных животных не заболело и не погибло. Величины используемых доз, вводимых каждому животному были выше и составляли 10 и 10 КОЕ.
Как на 1-е, так и на 14-е сутки макроскопическая картина внутренних органов подопытных животных была сравнима с органами контрольных животных. Не удалось также при микроскопическом (гистологическом) исследовании определить наличие на все сроки наблюдения каких-либо патологоанатомических изменений.
Так, при вскрытии подопытных животных (белые крысы) в головном мозге патоморфологических изменений не установлено. Структура белого вещества не была изменена. Микроциркуляторной патологии сосудов не выявлено, цитоархитектоника слоев нервных клеток различных участков мозга оставалась без изменений (рисунки 1,2). При микроскопическом изучении сердца патоморфологических изменений также не было обнаружено. Волокна сердечной мышечной ткани без изменений (рисунки 3,4). На срезах легочной ткани паренхима органа не изменена. Эпителий бронхов без дистрофических проявлений (рисунки 5,6). В структуре печеночной ткани балочная цитоархитектоника была сохранена. Дистрофических изменений гепатоцитов не выявляли. Ядра эпителиоцитов и клеток Купфера находились в пределах нормы. Лимфогистиоцитарные инфильтраты отсутствовали (рисунки 7,8).
В структуре почечной ткани также патологические изменения отсутствовали. Эпителий почечных канальцев и клубочков был без изменений (рисунки 9,10).
Иммунокомпетентные клетки селезенки оставались без реактивных изменений. Белая и красная пульпа различных участков селезенки находилась в состоянии нормы. Сосудистые изменения не обнаруживались (рисунки 11, 12).
Таким образом, изучение острой и хронической токсичности исследуемых препаратов свидетельствовало об отсутствии у них токсического действия на лабораторных животных. Следует особенно подчеркнуть тот факт, что эти препараты не вызывали никаких признаков патологического воздействия на организм подопытных животных при различных способах введения и в концентрациях, значительно превышающих рекомендуемые для их клинического применения.
Разработка экспериментального образца пробиотического гепатопротектора гепатобиол
Оценивали биохимические показатели сыворотки крови экспериментальных групп животных в условиях моделирования локализованной гнойной инфекции кожи, вызванной S. aureus. Исследовали такие показатели как: Забор материала для исследований (сыворотку крови) проводили на 1-е, 7-е и 14-е сутки после начала лечения.
Полученные экспериментальные данные о влиянии способов лечения на биохимические показатели сыворотки крови, при лечении инфицированных поражений кожи у экспериментальных животных представлены в таблице 24.
Как видно, в группе подопытных животных с воспроизведенной моделью локализованной гнойной инфекции кожи в сравнении с контрольными (нелеченными и интактными) группами животных, на первые сутки эксперимента отмечали повышение всех изучаемых биохимических показателей сыворотки крови на фоне снижения концентрации общего белка.
Обращает на себя внимание выраженная азотемия, обусловленная увеличением количества мочевины в сыворотке крови до величины 11,9±0,4 ммоль- дм" . Активность трансаминаз - АЛТ, ACT возросла в небольшой степени. Показатель отношения АСТ/АЛТ существенно не изменялся. Активность щелочной фосфатазы также увеличивалась до величины 120,2±0,4 Ед дм" . Тимоловая проба и количественное содержание амилазы в сыворотке крови существенно не изменялись. На 7-е и 14-е сутки эксперимента биохимические показатели сыворотки крови в контрольной группе экспериментальных животных (без лечения) постепенно нормализовались до величин, полученных в группе интактных животных. На 1-е сутки после начала аппликации трех видов испытуемых гелевых препаратов наблюдали значимое повышение активности трасаминаз, в большей степени в группе подопытных животных, получавших испытуемый препарат бацилакт и КТГГ (АЛТ -72,1±5,5 Ед-дм"3, ACT - 58,9±4,3 Ед-дм"3). В этой же группе подопытных животных следует отметить и повышение показателя отношения АСТ/АЛТ до величины 0,81±0,04.
Примечание: - во всех изучаемых случаях достоверных (р 0,05) по F-критерию Фишера различий в сравнении с группой Контроль «без лечения» не установлено.
Во всех группах, без исключения, отмечали повышение активности щелочной фосфатазы, в большей степени выраженное в группе животных, получавших препарат бацилакт с КТГГ (126,7±0,4 Ед-дм"). Азотемию наблюдали в группах подопытных животных, где использовали испытуемые препараты бацилакт и тизоль (12,6±0,5 ммоль-дм") и препарат сравнения эплан (12,5±0,4 ммоль-дм"). В группе животных, которым назначали испытуемый препарат бацилакт с КТГГ, концентрация мочевины была наименьшей (11,1±0,5 ммоль-дм" ).
Гипопротеинемия в большей степени была выражена в группах подопытных животных, для лечения которых использовали препарат сравнения эплан (43,6±5,4 г-дм"), и в группе животных, где применяли препарат бацилакт (тизоль) (44,3±5,5 г-дм"). Менее выраженное снижение концентрации общего белка в сыворотке крови наблюдали у экспериментальных животных, которых лечили препаратом бацилакт с КТГГ (48,3±5,6 г-дм"), сравнимое с величиной, полученной в контрольной группе (без лечения) - 48,4±5,7 г-дм" .
На 7-е сутки, после начала лечения испытуемыми препаратами наблюдали нормализацию биохимических показателей во всех группах подопытных животных. Активность трансаминаз оставалась повышенной в группе животных, получавших препарат бацилакт с КТГГ, но показатель отношения АСТ/АЛТ снижался до нормальных величин - 0,73±0,05. Активность щелочной фосфатазы также оставалась высокой во всех подопытных группах животных, но в большей степени в группе животных, получавших препарат бацилакт с КТГГ - 116,2±0,4 Ед дм" . Гипоглобулинемия в меньшей степени была выражена в группе подопытных животных, получавших препарат бацилакт с КТГГ (61,8±5,5 г-дм" ).
Повышенное содержание мочевины в сыворотке крови сохранялось во всех группах подопытных животных, леченных препаратами на основе бацилакта. В меньшей степени повышение концентрации мочевины наблюдали у животных, получавших препарат бацилакт с КТГГ - 8,6±0,6 ммоль-дм" .
На 14-е сутки наблюдения изменение биохимических показателей в группах подопытных животных, получавших испытуемые препараты, было сравнимо с изменением этих же показателей в группах животных, не получавших лечение, и в контрольной группе интактных животных.
Концентрация билирубина в сыворотке крови подопытных животных не изменялась в течение всего опыта. Активность ос-амилазы во всех группах экспериментальных животных также соответствовала полученным показателям в контрольной группы животных.
Таким образом, исследования по оценке изменений биохимических показателей сыворотки крови при моделировании локализованной гнойной инфекции кожи выявили значимое снижение уровня общего белка и повышение концентрации мочевины во всех подопытных группах животных, что является, по-видимому, следствием подавления протеосинтетической функции печени из-за изменения процессов синтеза и ресинтеза протеинов, вследствие чего, и происходило прогрессирующее снижение общего количества белка в сосудистом русле и увеличение концентрации мочевины.
Явления гипопротеинурии и азотемии в большей степени были выражены в группе подопытных животных, получавших испытуемый препарат сравнения эплан и бацилакт (тизоль), и в меньшей степени, - в группе подопытных животных, которым назначали испытуемый препарат бацилакт с КТГГ, что говорит о более выраженной терапевтической эффективности препарата, содержащего кремнийорганический глицерогидрогель.
Также необходимо отметить значимое повышение активности трансаминаз - ACT, АЛТ, щелочной фосфатазы на 1-е сутки, с последующим их снижением и нормализацией на 7-е и 14-е сутки в группе подопытных животных, которых лечили препаратом бацилакт (КТГГ), что может говорить также о определенном гепатотропном действии испытуемого препарата и его прямом или опосредованном влиянии на метаболическую функцию печени.
