Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Медико-биологические предпосылки поиска и разработки новых анксиолитиков 14
1.1.1. Основные типы тревожных расстройств 14
1.1.2. Патогенетические механизмы тревожных расстройств 18
1.1.3. Современная фармакотерапия тревожных расстройств 27
1.1.4. Особенности патогенеза тревожных расстройств при алкоголизме 31
1.2. Методологические особенности разработки новых анксиолитиков 36
1.2.1. Оценка тревожных состояний у мелких лабораторных животных 37
1.2.2. Экспериментальные модели тревожности 39
1.3. Холеідистокининовая система как фармакологическая «мишень» фармакотерапии тревожных расстройств 48
1.3.1. Рецепторы холецистокинина 50
1.3.2. Антагонисты ХЦК-рецепторов 55
1.3.3. Поиск новых антагонистов ХЦК-рецепторов 61
1.3.4. Функциональное значение ХЦК и его рецепторов в организме 64
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 77
2.1. Животные 77
2.2. Препараты 78
2.3. Методы исследования 79
2.3.1. Радиолигандный метод 79
2.3.2. Поведенческие методы исследования 81
2.3.3. Определение содержания моноаминов и их метаболитов в отдельных структурах мозга с использованием метода ВЭЖХ 95
ГЛАВА 3. Исследование структурно функциональной зависимости в ряду аналогов тетрапептида холецистокинина1 97
3.1. Изучение влияния длины спейсеров на взаимосвязь «структура-активность» в ряду трипептоидных ретро-аналогов хцк 4 97
3.2. Изучение влияния индолильного фармакофорного фрагмента на взаимосвязь «структура-активность» в ряду ретро-аналогов хцк-4 100
3.3. Изучение влияния природы с-концевого замещения на взаимосвязь «структура-активность» в ряду трипептоидных ретро-аналогов ХЦК-4 102
ГЛАВА 4. Исследование характера рецепторных взаимодействий соединения ГБ-115 105
ГЛАВА 5. Исследование психотропных свойств соединения гб-115 112
5.1. Изучение анксиолитической активности соединения ГБ-1 112
5.1.1. Влияние ГБ-115 на поведение лабораторных животных в тесте ОП 112
5.1.2. Изучение влияния ГБ-115 на поведение лабораторных животных в тесте ПКЛ 119
5.1.3. Изучение влияния ГБ-115 на поведение крыс в тесте «конфликтная ситуация» 129
5.1.4. Изучение механизма анксиолитического действия ГБ-115 в опытах in vivo 131
5.2. Изучение антиалкогольной активности соединения ГБ 115 141
5.2.1. Влияние ГБ-115 на продолжительность этанолового наркоза 141
5.2.2. Оценка влияния ГБ-115 на добровольное потребление раствора этанола в условиях экспериментального алкоголизма 144
5.2.3. Влияние ГБ-115 на поведение беспородных крыс при «отмене» этанола 147
5.3. ИЗУЧЕНИЕ АНТИНОЦИЦЕПТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ГБ-115 151
5.3.1. Оценка эффектов ГБ-115 при химической стимуляции ноцицепторов в тесте «уксусные корчи» 151
5.3.2. Оценка эффектов ГБ-115 в тесте «горячая пластинка» при термической стимуляции ноцицепторов 156
5.3.3. Оценка эффектов ГБ-115 в тесте «отдергивание хвоста» при термической стимуляции ноцицепторов 156
5.3.4. Оценка влияния ГБ-115 на индуцированную морфином анальгезию при термической стимуляции ноцицепторов
5.4. Оценка антидепрессивной активности гб-115 163
5.5. Оценка антиаддиктивных свойств ГБ-115 1
5.5.1. Влияние ГБ-115 на поведение крыс в условиях отмены бензодиазепиновых транквилизаторов у животных со сформировавшейся «лекарственной зависимостью» 166
5.5.2. Влияние ГБ-115 на синтез и метаболизм моноаминов в отдельных структурах мозга у крыс при моделировании синдрома отмены диазепама в опытах ex vivo 171
ГЛАВА 6. Исследование общей фармакологической активности соединения гб-115 174
6.1. Оценка влияния гб-115 на координацию движений 174
6.2. Оценка противосудорожной актив ности гб-115 174
6.3. Оценка влияния гб-115 на мнестические функции3 176
6.4. Влияние гб-115 на сердечно-сосудистую и дыхательную систему
6.4.1. Влияние ГБ-115 на частоту дыхания и возникновение патологических форм дыхания у кроликов 178
6.4.2. Изучение влияния соединения ГБ-115 на ЭКГ у крыс
6.5. Изучение психотропных эффектов гб-115 при длительном применении5 182
6.6. Изучение аддиктивного потенциала гб-115
6.6.1. Оценка первичных подкрепляющих свойств ГБ-1156 187
6.6.2. Оценка вторичных подкрепляющих свойств ГБ-115 190
Заключение 192
Выводы 208
Список литературы
- Современная фармакотерапия тревожных расстройств
- Антагонисты ХЦК-рецепторов
- Радиолигандный метод
- Изучение механизма анксиолитического действия ГБ-115 в опытах in vivo
Введение к работе
Актуальность. Согласно эпидемиологическим данным, тревожными расстройствами страдает от 7,9% до 14,5% населения (Lepine, 2002; Alonso, et al., 2007; Fullana, et al., 2010; Lenze, et al., 2011). Значительно возрастает потребление алкоголя, одним из негативных действий которого является увеличение тревожности, что рассматривается в качестве элемента «порочного круга», усиливающего алкоголизацию (Kiefer, et al., 2002; Breese, et al., 2005).
Патогенетические механизмы тревожных расстройств чрезвычайно гетерогенны. Сходный фенотип тревоги и страха может быть обусловлен изменениями в функционировании многочисленных нейрохимических систем ЦНС (Середенин С.Б., 2002, 2003; Morilak, et al., 2005; Adell, 2010; Sztainberg, et al., 2010; Tasan, et al., 2011; Riaza Bermudo-Soriano, et al., 2012), поэтому для лечения тревожных расстройств применяются препараты разных групп, транквилизаторы, антидепрессанты, психостимуляторы, ноотропы, природные адаптогены. При установленной эффективности каждая группа имеет определенные недостатки. Так, например, распространенные в 70-80-х гг. прошлого века и не утратившие значения до настоящего времени бензодиазепиновые транквилизаторы, наряду с анксиолитическим, обладают нежелательными гипноседативным и миорелаксирующим эффектами, нарушают когнитивные функции, вызывают зависимость и синдром отмены (Ashton, 1994; Paterniti, et al., 2002; Landi, et al., 2005; Allison, et al., 2006; Licata, et al., 2008). Бензодиазепины купируют состояние тревоги при алкогольной абстиненции, но вызывают перекрестную зависимость, что резко ограничивает их использование по данному показанию (Myrick, et al., 2005; Leggio, et al., 2008; Caputo, et al., 2010; Bosshart, 2011). Доказано, что эффекты бензодиазепинов проявляются индивидуально и зависят от типа реакции на эмоционально-стрессовое воздействие (Середенин, С.Б. и соавт.,1979; Griebel, et al., 2000; do-Rego, et al., 2006).
Поэтому поиск анксиолитиков с новыми механизмами действия является актуальной проблемой психофармакологии, поскольку их создание позволит расширить арсенал психотропных средств и индивидуализировать фармакотерапию тревожных расстройств с учетом особенностей патогенеза заболеваний (Воронина Т.А. и Середенин С.Б., 2002; Середенин С.Б., 2003). Для лечения расстройств, вызванных алкоголем, важной представляется разработка препарата, не взаимодействующего непосредственно с ГАМКА-рецептором, что позволит избежать перекрестной зависимости. В данном аспекте перспективной является фармакологическая регуляция холецистокининовой системы, играющей важную роль в анксиогенезе (Rotzinger, et al., 2010).
Нейропептид холецистокинин (ХЦК) в организме представлен рядом биологически активных форм (Rehfeld, 1986), происходящих от молекулы предшественника препро-ХЦК (Deschenes, и др., 1984). ХЦК взаимодействует с ХЦК1- и ХЦК2-рецепторами, участвуя в регуляции многих поведенческих актов, включая тревогу и беспокойство (van Megen, et al., 1996), боль (Hebb, et al., 2005; Yoshinaga, et al., 2010), память (Daug, et al., 1998; Schneider, et al., 2009), депрессию (Derrien, et al., 1994) и зависимость от психоактивных веществ (Vaccarino, 1994; Alttoa, et al., 2004), а также насыщение (Fink, et al., 1998) и терморегуляцию (Szelenyi, 2001). Преобладающие в ЦНС ХЦК2-рецепторы в основном экспрессируются в лимбической системе (Hill, et al., 1987), вовлеченной в реализацию эмоциональных реакций (LeDoux, 2003; Damsa, et al., 2009). Активация ХЦК2-рецепторов вызывает анксиогенез и панические состояния, в то время как блокада ХЦК2-рецепторов – анксиолитический эффект (Daug, et al., 1998; Abelson, et al., 1999; Wang, et al., 2005). Минимальной последовательностью ХЦК, взаимодействующей с высокой аффинностью с ХЦК-рецепторами, является тетрапептид холецистокинина (ХЦК-4). Установлено, что ХЦК-4 имитирует свойства агониста ХЦК2-рецепторов, индуцируя тревожные состояния (Bradwejn, et al., 1994; Shlik, et al., 1997; Bertoglio, et al., 2005). Эти результаты определили задачу создания пригодного с позиций фармакокинетики соединения дипептидной структуры, химический дизайн которого позволяет прогнозировать взаимодействие с ХЦК-рецепторами и антагонистическое по отношению к ХЦК-4 фармакологическое действие.
В ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН в отделе химии под руководством члена-корреспондента РАМН, д.б.н., проф. Т.А.Гудашевой выполнены работы, в процессе которых с использованием топохимического принципа конструирования новых соединений Шемякина-Овчинникова-Иванова (Shemyakin, et al., 1969), синтезирован ряд дипептидов на основе ХЦК-4. Осуществлен виртуальный переход от природного тетрапептида L-Trp-L-Met-L-Asp-L-Phe-NH2 к его ретро-аналогу L-Phe-L-Asp-L-Met-L-Trp-NH2. В результате дальнейших химических модификаций получены трипептоидные аналоги ХЦК-4 с общей формулой Ph(CH2)nC(O)-NH(CH2)mC(O)-L-Trp-NH2. Синтезированные соединения явились предметом фармакологического изучения в настоящей работе.
Цель работы. Создание фармакологического препарата с анксиолитическими и антиалкогольными свойствами на основе структуры тетрапептида холецистокинина.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи.
-
Исследовать структурно-функциональную зависимость в ряду вновь синтезированных аналогов тетрапептида холецистокинина с использованием стандартных методов оценки анксиолитических средств, отобрать наиболее перспективное соединение для углубленного психофармакологического анализа.
-
Выявить механизм действия отобранного соединения.
-
Оценить его фармакологическую активность в зависимости от фенотипа эмоционально-стрессовой реакции в сравнении с известными анксиолитиками.
-
Изучить влияние соединения в условиях моделирования «синдрома отмены» психоактивных веществ.
-
Определить спектр фармакологической активности вещества на основе данных о его рецепторных взаимодействиях.
-
Провести анализ возможных побочных эффектов отобранного соединения при однократном и длительном введении.
-
Выполнить работы по доклинической оценке безопасности рассматриваемого соединения.
Научная новизна. На основе анализа зависимости «химическая структура-эффект» установлена фармакологическая активность триптофан-содержащего дипептидного аналога ХЦК-4 Ph(CH2)5CO-Gly-L-Trp-NH2 (соединения ГБ-115), в спектре которой проявляются анксиолитические, антиалкогольные, антидепрессивные и анальгетические свойства. Установлено, что при функциональном взаимодействии ГБ-115 проявляет эффекты антагониста тетрапептида ХЦК-4. Выявлены лигандные свойства ГБ-115 по отношению к ХЦК1-рецепторам, каппа-опиоидным и бомбезиновым рецепторам 3-го типа (bb3). Показано, что ГБ-115 проявляет анксиолитическое действие при пассивном фенотипе ответа на эмоциональный стресс. Действие препарата не сопровождается седацией, миорелаксацией, нарушением когнитивных функций. Установлено, что антидепрессивный эффект ГБ-115 не зависит от фенотипа эмоционально-стрессовой реакции. С использованием фармакологических анализаторов установлено участие опиоидных систем в анальгетическом действии ГБ-115. Доказана способность ГБ-115 восстанавливать поведенческие нарушения у животных со сформированной зависимостью при отмене этанола и бензодиазепинов. Выявлены изменения в дофаминергической системе, связанные с активацией поведения животных, длительно получавших диазепам при его резкой отмене. Охарактеризованы дозы ГБ-115, вызывающие анксиолитические, антиалкогольные, антидепрессивные и анальгетические эффекты. Показано, что ГБ-115 не вызывает патологического влечения и зависимости. В широком диапазоне доз доказано отсутствие проявления острых, хронических и специфических свойств токсичности.
Научно-практическая значимость. На основе выполненных исследований разработан фармакологический препарат ГБ-115, оригинальный по химической структуре и механизму действия, спектр фармакологической активности которого определяет преимущества по ряду показаний перед известными лекарственными средствами, применяемыми для лечения тревожных состояний и алкогольных расстройств. Препарат не имеет мировых аналогов. Полученные результаты включены в досье на препарат ГБ-115 в Минздрав РФ для получения разрешения на клинические исследования. Получены патенты РФ №2227144 (приоритет от 15.11.2001г.) на изобретение «Замещенные триптофан-содержащие дипептиды с холецистокининонегативной или холецистокининопозитивной активностью», №2429874 (приоритет от 16.04.2010г.) на изобретение «Анальгетическое средство для купирования висцеральной боли». Результаты исследований были использованы при составлении «Методических основ поиска фармакологических средств для лечения алкоголизма и оценки их эффективности».
Личный вклад автора. Автором самостоятельно выполнены все поведенческие эксперименты по изучению анксиолитической, психостимулирующей, седативной, противосудорожной, миорелаксирующей, антидепрессивной, анальгетической и антиаддиктивной активности соединения ГБ-115. Выполнено моделирование состояний зависимости от психоактивных веществ. Проведена статистическая обработка и описание полученных результатов, сформулированы выводы. При непосредственном участии автора проанализирован и отобран спектр потенциальных рецепторных мишеней действия ГБ-115, спланированы нейрохимические исследования, изучение возможного аддиктивного потенциала, определен дозовый диапазон для доклинической оценки безопасности ГБ-115, подготовлены публикации по результатам работы.
Положения, выносимые на защиту
1. Анксиолитическая активность в ряду N-фенилалканоилзамещенных триптофан-содержащих аналогов эндогенного ХЦК-4 определяется расстоянием между фенильной и индолильной группами в 13 -связей, что соответствует расстоянию между гидрофобными фрагментами в природном нейропептиде ХЦК-4, L-конфигурацией аминокислотного остатка триптофана и наличием амидной группы в качестве С-концевого заместителя.
2. ГБ-115 взаимодействует с ХЦК1-, bb3 и КОР рецепторами, проявляя в микромолярных концентрациях свойства антагониста ХЦК1-и bb3 рецепторов и агониста КОР.
3. ГБ-115 обладает анксиолитическими свойствами, антиаддиктивной активностью, умеренно выраженными антидепрессивными и антиноцицептивными эффектами. Препарат свободен от нежелательных побочных действий, свойственных бензодиазепиновым транквилизаторам.
4. Анксиолитический эффект ГБ-115 не изменяется при неселективной блокаде опиоидных рецепторов, суммируется при совместном введении с агонистом бомбезиновых рецепторов, не проявляется на фоне действия агониста ХЦК2-рецепторов.
5. Дипептид ГБ-115 фармакологически активен при пероральном введении.
6. Данные по изучению механизма действия, психотропной активности, общих фармакологических свойств и безопасности определяют целесообразность дальнейшей разработки ГБ-115 в качестве анксиолитика с антиалкогольными свойствами.
Основные сведения об апробации работы
Основные результаты диссертации доложены на 4-й Европейской конференции по биологии, биохимии и поведению (Морзин, Франция, 2000), 3-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Суздаль, Россия, 2001), международной конференции «Новые лекарственные средства: синтез, технология, фармакология, клиника» (Минск, Белоруссия,2001), 1-й, 2-й, 5-й, 6-й, 7-й, 9-й Ежегодных конференциях «Фармакогенетика в психиатрии» (Нью-Йорк, США, 2002, 2003, 2006, 2007, 2008, 2010), 27-м Европейском Пептидном симпозиуме (Сорренто, Италия, 2002), XIV Всемирном конгрессе по фармакологии (Сан-Франциско, США, 2002), 2-м Съезде Российского научного общества фармакологов (Москва, Россия, 2003), научной конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, Россия, 2005), 8-й Региональной конференции Европейской Коллегии по Нейропсихофармакологии (Москва, Россия, 2005), V съезде общества медицинских генетиков (Уфа, Россия, 2005), 4-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, Россия, 2006), ХV Всемирном конгрессе по фармакологии (Пекин, Китай, 2006), 3-м Российском конгрессе фармакологов (Санкт-Петербург, Россия, 2007), Международной конференции по изучению наркотиков (Берлин, Германия, 2007), XXVI Всемирном Конгрессе по Нейропсихофармакологии (Мюнхен, Германия, 2008), 9-м Всемирном Конгрессе по Биологической Психиатрии (Париж, Франция, 2009), 1-м Российском Конгрессе по наркологии (Москва, Россия, 2009), 5-й Международной Конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, Россия, 2010), XVIII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, Россия, 2011), 11-й Региональной конференции Европейской Коллегии по Нейропсихофармакологии (Санкт-Петербург, Москва, 2011), 7-м Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2011), 24-й Международной конференции Европейской Коллегии по Нейропсихофармакологии (Париж, Франция, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 54 работ, в том числе 16 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 36 тезисов в материалах российских и международных конференций, 2 патента РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 335 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 41 таблицей, 53 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (глава I), экспериментальной части (главы II-VI), заключения, выводов, списка литературы и приложения. Библиографический указатель включает 45 отечественных и 808 иностранных источников.
Современная фармакотерапия тревожных расстройств
При первичном обращении за помощью 8-13% пациентов общей медицинской практики удовлетворяют критериям данного заболевания [413], при этом частота встречаемости отдельных панических атак достигает 22,7% [403]. Панические расстройства тесно связаны с увеличением риска формирования алкогольной и табачной зависимости, развитием депрессий [668], соматических заболеваний [396], [178] и общей смертности [668], [720].
Постановка диагноза «обсессивно-компульсивное расстройство» (ОКР) основана на наличии в анамнезе обсессий и/или компульсий. Навязчивые, удручающие мысли и образы усиливают тревогу, в то время как реализация компульсивных побуждений, повторяющихся, целенаправленных ритуальных актов, направленных на нейтрализацию или предотвращение эмоционального дискомфорта, снижает тревогу [91]. Несмотря на то, что МКБ-10 классифицирует ОКР как тревожное расстройство, ряд специалистов рассматривает данную патологию как спектр связанных заболеваний, включающий соматоформные расстройства, импульсивные расстройства личности и гиперкинезы [264]. По оценкам специалистов, распространенность заболевания в общей популяции составляет около 1-3% [658]. Нарушение функционирования серотонинергической системы и особенно гиперчувствительность постсинаптических 5-НТ рецепторов позволили выдвинуть серотонинергическую гипотезу патогенеза ОКР [852], в подтверждение которой были получены многочисленные клинические данные [285], [509]. Исследования последних лет сфокусированы на взаимодействии между серотонинергической и дофаминергической системами, а также на роли нейрональной дисфункции в области базальных ганглиев в развитии обсессивно-компульсивных расстройств [228].
Существует несколько теорий, позволяющих составить концептуальную основу посттравматического стрессового расстройства (ПТСР), результата острого переживания, вызывающего чувство страха, беспомощности или ужаса [77], [58]. Во-первых, условно-рефлекторная модель, которая включает ассоциативную связь между аверсивным событием, психофизиологическим ответом и «кодированием» в памяти с одной стороны, и последующей непроизвольной активацией памяти в форме симптомов ПТСР [616]. Во-вторых, биологическая теория, основанная на доклинических и нейроэндокринных исследованиях, демонстрирующих постоянную излишнюю активацию ЦНС, нарушение регуляции обмена глюкокортикоидов и неэффективную модуляцию системы, ответственной за противодействие стрессу [173]. В-третьих, психонейроанатомическая модель, согласно которой травматические воспоминания изначально «кодируются» как законченная детально продуманная информация, которая впоследствии трансформируются в автобиографические или эпизодические воспоминания [140]. Хотя ни одна из моделей не объясняет этиологию ПТСР, они представляют современный уровень понимания проблемы, достаточный для обоснования существующих терапевтических подходов и разработки новых средств для фармакотерапии ПТСР [53], [638].
В развитие тревожных расстройств, наряду с индивидуально-личностными особенностями субъекта и средовыми влияниями [224], [452] большую роль играет генетическая предрасположенность, о чем свидетельствуют многочисленные семейные и близнецовые исследования [566], [747], [562], [512]. Так, риск возникновения социофобий и панических расстройств у ближайших родственников пробандов в несколько раз больше, чем у контрольной группы [229], [331]. Высокий уровень конкордантности у монозиготных близнецов по сравнению с дизиготными близнецами свидетельствует о значимости биологического фактора в развитии социофобий, генерализованных тревожных расстройств и панических расстройств [400], [717], [331].
Достигнуты определенные успехи в поиске биологических маркеров, которые в перспективе могли бы быть использованы для ранней диагностики и фармакотерапии нарушений эмоционально-стрессовых реакций. Так, риск формирования чувствительности к социальным тревожным расстройствам может определяться полиморфизмами двух генов-кандидатов: транспортера серотонина (SLC6A4) и катехол-о-метилтрансферазы (КОМТ, СОМТ) [272], [528].
ГТР ассоциируются с коротким S аллелем гена транспортера серотонина 5-HTTLPR [839], полиморфизмом гена МАОА [673], а также с генами, связанными с коморбидными депрессивными расстройствами, включая BDNF, СОМТ, DAT, FKBP5 и CRHR1 [142]
В обзоре Pauls et аі.представленьї данные ассоциативных исследований более 80 генов-кандидатов, задействованных в патофизиологии обсессий [608]. На сегодняшний день наиболее убедительные результаты получены в отношении связи полиморфизма транспортера серотонина 5-HTTLPR и обсессиями соматического характера [407].
Рассмотрено более 350 генов-кандидатов при изучении панических расстройств. В таблице 1 представлены некоторые результаты исследований, описывающие характер взаимодействия между разными системами ПР. Несмотря на противоречивые результаты, наиболее убедительные доказательства ассоциативной связи получены для полиморфизмов генов МАОА[673], КОМТ [663] и ХЦК2-рецептора [516].
Антагонисты ХЦК-рецепторов
Установка для теста «открытое поле» О наличии анксиолитического действия судили по выявлению активирующего эффекта на двигательную активность у животных с «пассивным» типом эмоционально-стрессовой реакции (ЭСР) при предварительном исключении психостимулирующего действия на установке "Optovarimex". 2.3.2.1.2. Тест «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ)
Методика, предложенная известным психофармакологом S. File (1984), считается общепринятой в настоящее время для оценки анксиолитического действия соединений [10]. Сущность методики заключается в анализе соотношения реакции страха животных в незнакомом пространстве и высоты с одной стороны, и поисковой активности в новой обстановке с другой.
Установка ПКЛ состоит из двух открытых рукавов (30 х 5 см ) и двух закрытых рукавов (30 х 5 х 15 см3), которые расходятся от общей центральной платформы (5 х 5 см ). Установка, смонтированная из дерева, покрашенного белой матовой краской, и прозрачного пластика (стенки), приподнята на высоту 60 см над полом [492].
Животных помещали на центральную платформу в сторону открытых рукавов. В течение последующих 300 сек фиксировали как традиционные пространственно-временные параметры, так и широко используемые в последнее время этологические показатели [353]. Измеряли время нахождения в открытых, закрытых рукавах и на центральной площадке в % [например, (время в открытых рукавах/общее время наблюдения)х100], число заходов в открытые, закрытые рукава и в центр лабиринта в % [например, (число заходов в открытые рукава/общее число заходов в рукава)х100]. Этологические показатели включали частоту вертикальных стоек с опорой на стенки, число наклонов головы на открытых рукавах ("head-dipping"), распростертые позы внимания (или "stretched attend р08Шгез",исследовательская поза, при которой тело животного вытягивается в определенном направлении, а затем возвращается в исходное положение без совершения движения в данном направлении) и число актов груминга. Более того, в зависимости от места проявления в лабиринте распростертые позы (РП) дифференцировали на защищенные и незащищенные, при этом закрытые рукава и центральную платформу рассматривали в качестве защищенных областей и вычисляли как процент защищенных РП [(защищенные РП/общее число РП)х100] [353].
Установка ПКЛ для крыс сконструирована из дерева, окрашенного в темный цвет, и имела следующие характеристики: длина каждого из 4-х рукавов лабиринта - 50 см, их ширина - 15 см; высота бортиков 2-х противоположных закрытых рукавов - 15 см; центральная площадка - 15x15 см; лабиринт приподнят над полом на высоту 75 см. Каждое животное помещали в центр лабиринта в начале тестирования на 300 сек. В процессе тестирования регистрировали следующие показатели: время нахождения в открытых рукавах; число заходов в открытые рукава; число заходов в закрытые рукава; время нахождения в центре; число заходов в центр; число вертикальных стоек;
Анксиолитическое действие оценивали по увеличению времени нахождения и числа заходов животных в открытые рукава лабиринта. 2.3.2.1.3. Тест «конфликтная ситуация»
Работа выполнена на установке, представляющей собой модификацию Vogel s - теста, разработанной в лаборатории психофармакологии ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН [30], которая используется для оценки анксиолитических эффектов транквилизаторов. «Конфликт» создавался путем столкновения питьевой мотивации и электроболевого раздражения [791]. С этой целью через 24 часа после лишения доступа к воде животных для выработки навыка взятия питья из поилки (тренировка) помещали в индивидуальные камеры с предоставлением доступа к поилкам с водой. При этом автоматически регистрировали число ненаказуемых взятий воды в течение 10 мин. На следующий день, т.е. через 48 ч после начала депривации, эту процедуру повторяли, но через 10 сек после первого взятия питья на поилку и электродный пол камер подавали электрический ток так, что каждое взятие воды или этанола становилось наказуемым. Автоматически регистрировали число наказуемых взятий воды в течение 10 мин.
Анксиолитический эффект оценивали по увеличению числа наказуемых взятий воды по сравнению с контрольной группой.
Спонтанную двигательную активность (СДА) мышей изучали на приборе "Optovarimex" (Columbus Instruments, США). СДА фиксировали автоматически в течение 10 минут с помощью инфракрасных датчиков. Полученная величина двигательной активности была суммарной для трех испытуемых животных. Увеличение СДА по сравнению с контрольной группой свидетельствовало об активирующем действии изучаемых соединений.
Для оценки нарушения координации движения, походки и равновесия использовали тест «вращающийся стержень». На горизонтальный стержень диаметром 2 см и скоростью вращения 5 оборотов в минуту помещали мышей и фиксировали время удерживания на стержне. Неспособность животных сохранять равновесие на стержне в течение 120 сек под влиянием изучаемых веществ рассматривали как проявление нарушения координации движений.
Радиолигандный метод
Для изучения рецепторных взаимодействий ГБ-115 нами совместно с С.Б.Середениным разработан научный протокол исследования, осуществленный в сотрудничестве с компанией Сегер (Франция).
На культуре клеток в опытах in vitro изучены параметры связывания соединения ГБ-115 в концентрациях 10 4М-10"12М с рецепторами, отобранными в качестве кандидатов для исследования, исходя из рабочих гипотез, основанных на анализе структуры и/или фармакологических эффектов препарата (таблица 12).
Изучено также взаимодействие ГБ-115 с другими подтипами опиоидных рецепторов. Установлены следующие параметры рецепции: 1С5о = 1,3 10"4 М, Ki = 5,5 10"5 М, пН = 0,4 (д-опиоидные рецепторы) и 1С5о = 1,7 10"4 М, Ki = 1,0 10"4 М, пН - 0,8 (52-опиоидные рецепторы).
Таким образом, наибольшее сродство ГБ-115 установлено для bb3, КОР и ХЦК) -рецепторов.
Следующий этап исследования был посвящен функциональному анализу клеточных ответов. По уменьшению содержания цАМФ выявлены агонистичные свойства ГБ-115 по отношению к КОР (ЕС50 = 1,6-10"4) (рис.24).
Установлено, что ГБ-115 блокирует эффекты фрагмента бомбезина Вп6_14, агониста bb3 рецептора, препятствуя изменению внутриклеточного содержания Са2+ (1С5о = 3,7-10"5М) (рис.25). Как антагонист ГБ-115 проявляет себя и по отношению к ХЦК г рецепторам, препятствуя повышению уровня цАМФ агонистом ХЦК,-рецепторов XUK-8S (1С50 = 7,3- 10"5М) (рис.26).
На рисунках данные представлены в процентах от контрольного специфического ответа агониста ((специфический ответ/контрольный специфический ответ агониста)х100), полученного в присутствии ГБ-115. Бомбезиновый ЬЬз рецептор человека - белок, состоящий из 399-ти аминокислот [257], который имеет 95% идентичность аминокислотной последовательности с рецепторами макаки резус [675], 80% с bb3 рецепторами крысы и 92% с рецепторами мыши. У приматов bb3 рецепторы обнаружены в больших количествах в ЦНС, особенно в структурах, которые связаны с эмоциями и поведением, гипоталамусе, гипофизе, миндалине и хвостатом ядре [675].
В настоящее время патофизиологическая роль bb3 рецепторов остается неясной. Их активация зарегистрирована при легочных заболеваниях, расстройствах ЦНС, а также при росте и дифференцировке опухолевых клеток у человека. Исследования на мышах-нокаутах по гену bb3 рецептора свидетельствуют об их вовлеченности в поведенческие реакции, включая зоосоциальное поведение [832]. Имеются сообщения о значении ЬЬз рецепторов в модуляции эмоциональных состояний [374].
Клеточный ответ bb3 рецепторов опосредуется фосфолипазой С и активацией каскада инозитол-1,4,5-трифосфата с последующей мобилизацией клеточного кальция [669]. Кроме того, активация bb3 рецепторов также приводит к стимуляции МАР-киназного и тирозинкиназного сигнальных путей [805].
В литературе основные данные по реализации тревожного ответа приведены в отношении ХЦК2-рецепторов, однако не исключено участие и ХЦКі-рецепторов. Так, известно соединение IQM-95,333 [80], антагонист ХЦКі рецепторов, обладающее сходным с ГБ-115 анксиолитическим профилем. Имеются данные и о противотревожной активности антагониста ХЦКі рецепторов девазепида [325]. Поэтому, учитывая полученные в настоящей работе данные о взаимодействии ГБ-115 с ХЦКі рецепторами, нельзя исключить, что его анксиолитическое действие может быть связано с блокадой ХЦКі рецепторов.
Как упоминалось ранее в обзоре литературы, помимо активации нерецепторных тирозинкиназ, митоген-активируемых протеинкиназ и фосфатидилинозитол-3-киназного пути трансдукции, одним из возможных каскадов передачи сигнала для ХЦК і-рецепторов является активация аденилилциклазы с образованием цАМФ [574].
К-опиоидные рецепторы, функционально отличающиеся от ц- и 5-опиоидных рецепторов, были открыты в 70-х годах XX века [518]. Первые агонисты КОР проявляли выраженные анальгетические свойства на моделях висцеральной боли, которые сохранялись при разнообразных экспериментальных условиях независимо от вида животных (мыши или крысы), органов-мишеней (двенадцатиперстная кишка, толстая кишка, желчный пузырь, брюшина), природы повреждающего агента (растяжение или химическое раздражение), анестезированных или находящихся в сознании животных, типа боли (основной или воспалительной), а также химической природы к-агонистов [697], [384], [674] [391]. Изученные соединения не вызывали эйфории, угнетения дыхания и нарушений функций ЖКТ.
Стимуляция КОР, связанных с Gj-белками рецепторов, приводит к угнетению синтеза аденилилциклазы [627] и тока Са [746], что позволило оценить клеточный ответ по изменению содержания цАМФ. Современными исследованиями доказана роль КОР в активации ERK (extracellular signal-regulated kinase), JNK (Jun Nerminal kinase) и p38 МАРК сигнальных каскадов [101], [147].
Таким образом, выявленные рецепторные взаимодействия и клеточные ответы определили необходимость расширения спектра фармакологических исследований. Представленные результаты исследований опубликованы в соавторстве с Т.А.Гудашевой и С.Б.Середениным [432].
Изучение механизма анксиолитического действия ГБ-115 в опытах in vivo
Согласно статистическим исследованиям, резкое прекращение длительного приема анксиолитиков бензодиазепинового ряда сопровождается у 0,5-7,0% людей синдромом отмены, который характеризуется, в первую очередь, появлением повышенной тревожности [482]. Предполагается, что высокий уровень тревоги в этих условиях может быть связан с увеличением содержания нейропептида ХЦК в ЦНС. Возрастание количества ХЦК-8 рецепторов во фронтальной коре и гиппокампе у крыс на фоне отмены диазепама позволяет рассматривать активацию ХЦК системы как важное патогенетическое звено в механизме формировании синдрома отмены ЦНС [312], [319]. В данном фрагменте работы изучено влияния соединения ГБ-115 на индуцированную отменой транквилизаторов бензодиазепинового ряда тревожную реакцию у крыс в опытах in vivo.
Эксперименты выполнены на крысах-самцах линий MR/ MNRA весом 210-260 г. Феназепам в дозе 2,0 мг/кг, в/б, и воду дистиллированную (плацебо) вводили 1 раз в сутки в течение 21 дня.
Поведение контрольных животных (вода дистиллированная) и влияние ГБ-115 в дозах 0,025 и 0,5 мг/кг, в/б, оценивали в тесте ПКЛ через 15 мин после введения вещества и через 24 часа после последней инъекции феназепама.
Как ранее показано, инбредные крысы MR/MNRA отличаются по реакции на эмоциональный стресс [21]. В настоящей работе межлинейных различий в формировании тревожного состояния в ответ на отмену бензодиазепинов в тесте ПКЛ не выявлены. На рис.48А и 48Б показано, что у контрольных животных на фоне отмены феназепама развивается анксиогенная реакция по сравнению с крысами из группы «плацебо» (р 0,05). Установлено, что ГБ-115 в дозе 0,025 мг/кг не изменяет поведения MR/MNRA крыс через 24 ч после отмены феназепама. Дипептид в дозе 0,5 мг/кг достоверно увеличивает основные показатели - время в открытых рукавах и число заходов в открытые рукава лабиринта (рис.48А, 48Б). Показано, что в изученных дозах ГБ-115 не влияет на время нахождения в центре ПКЛ и общую двигательную активность животных, что свидетельствует о противотревожном характере действия ГБ-115.
Данные представлены как M±SEM; , -р 0,05, р 0,01 статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой, ANOVA, тест Даннетта; в каждой группе по 7-8 животных.
Эксперименты выполнены на беспородных крысах-самцах весом 220-260 г. Поведение животных оценивали в тесте ПКЛ через 48 ч после последней инъекции диазепама дозе 4,0 мг/кг/день, в/б, в течение 30 дней. ГБ-115 в дозе 0,1 мг/кг, в/б, вводили однократно за 15 мин до тестирования в ПКЛ; в качестве препарата сравнения использовали анксиолитик афобазол в дозе 5,0 мг/кг, в/б, однократно за 30 мин до тестирования в ПКЛ; растворитель (несущий раствор) использовали в качестве «контроля». Группе «плацебо» вводили растворитель в течение 30 дней в том же режиме, что и диазепам.
При оценке поведения беспородных животных после отмены диазепама отмечали анксиогенную реакцию, выражающуюся в сокращении времени пребывания в открытых рукавах лабиринта (в 3,5 раза) и уменьшении числа заходов в открытые рукава (в 3,7 раза), в тенденции к сокращению числа выходов на центральную площадку и числа наклонов головы по сравнению с группой плацебо (таблица 32), что согласуется с опубликованными ранее данными [241].
Распростертые позы 6,5±0,5 9,4±2,3 4,4±0,9 4,4±0,6 Данные представлены как M±SEM; -р 0,05 статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой согласно непараметрическому критерию Манна-Уитни; п - число животных в группе.
Изучение анксиолитической активности ГБ-115 в дозе 0,1 мг/кг через 48 ч после отмены диазепама показало, что ГБ-115 при однократном системном введении купировал индуцированную отменой диазепама тревогу у беспородных крыс, увеличивая время пребывания (р 0,01) и число заходов (р 0,05) в открытые рукава (таблица 32). Не оказывая влияния на общую двигательную активность и сокращая число распростертых поз, ГБ-115, в отличие от афобазола, статистически значимо увеличивал (р 0,05) направленную исследовательскую активность (число наклонов головы) по сравнению с абстинентными животными, что свидетельствует о противотревожных свойствах ГБ-115.
Таким образом, совокупность полученных данных об анксиолитических свойствах ГБ-115 в условиях повышенного уровня тревоги, индуцированного различными «абстинентными» состояниями, согласуется с ранее опубликованными сообщениями о способности антагонистов ХЦК-рецепторов купировать анксиогенные реакции, характерные для синдрома отмены психоактивных веществ.
. Влияние ГБ-115 на синтез и метаболизм моноаминов в отдельных структурах мозга у крыс при моделировании синдрома отмены диазепама в опытах ex vivo Эксперименты выполнены на беспородных белых крысах-самцах массой 180-210 г. в начале эксперимента. Проявление синдрома отмены диазепама регистрировали через 48 ч после прекращения введения диазепама в дозе 4,0 мг/кг, в/б, 30 дней. Соединение ГБ-115 в дозе 0,1 мг/кг, в/б, вводили однократно за 20 мин до декапитации крыс. Контрольные животные получали водно-твиновый раствор.
При исследовании влияния ГБ-115 на содержание биогенных аминов и их метаболитов во фронтальной коре, гиппокампе, гипоталамусе и стриатуме наиболее значимые изменения выявлены в стриатуме.
При отмене диазепама статистически значимо уменьшалось содержание ДА (-22,4%), ДОФУК (-22,2%) по сравнению с контрольной группой; выявлено падение концентрации ДА (-20,3%) и увеличение содержания НА (+333,3%), а также достоверное увеличение индексов обмена ДА, ДОФУК/ДА (+14,2%) и (ДОФУК+ГВК)/ДА (+18,2%), по сравнению с животными, получавшими диазепам в течение 30-ти дней (группа «диазепам) (таблица 33).
Известно, что активность дофаминергической системы повышается при стрессовом воздействии слабой и средней интенсивности [244], [163] и снижается при сильном и/или хроническом стрессе, способном вызывать выраженное угнетение поведения [507]. Совокупность поведенческих, физиологических и нейрохимических проявлений, составляющих синдром отмены бензодиазепинов, безусловно, соответствует понятию «сильного стресса» [14], [15].
