Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Молекулярные механизмы заболеваний сердечно-сосудистой системы и роль флавоноидов для их профилактики и лечения 18
1.1. Молекулярные механизмы заболеваний сердечно-сосудистой системы. Роль гипоксии в развитии ишемических заболеваний сердечно-сосудистой системы 18
Система эндотелия сосудов - структурно - функциональная единица 24
Эндотелиальная NOS и оксид азота 28
Молекулы адгезии и клеточные контакты 34
Эндотелиальные факторы, влияющие на тонус сосудов и факторы свертывания крови 41
1.2. Роль окислительного стресса в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний 46
1.3. Участие флавоноидов в окислительно-восстановительных реакциях и влияние флавоноидов на молекулярные механизмы развития сердечнососудистой патологии 57
Флаваны (флаван-3-олы) 66
Лейкоантоцианы, проантоцианидины и таннины 71
Антоцианидины 75
Флавоны 78
Флавонолы 80
Флаваноны 83
Флаванонолы (дигидрофлавонолы) 85
Изофлавоноиды (3-фенил хромоны) 90
Халконы 93
1.4. Применение флавоноидов при сердечно-сосудистых заболеваниях 95
CLASS Глава 2. Материалы и методы исследовани CLASS я 97
2.1. Объекты исследования 97
2.2. Экспериментальные модели in vitro 102
2.2.1. Модельная система генерации гидроксильного радикала 102
2.2.2. Модельная система генерации супероксиданион радикала 109
2.2.3. Модельная система генерации пероксильных радикалов 111
2.2.4. Оценка хелатирующей способности флавоноидов 117
2.3. Экспериментальные модели in vivo 118
2.3.1. Гипоксия 119
2.3.1.1. Гипобарическая гипоксия 119
2.3.1.2. Гемическая гипоксия 119
2.3.1.3. Гипоксия с гиперкапнией 120
2.3.1.4. Циркуляторная гипоксия 120
Оценка эффективности препаратов при ишемии головного мозга 120
Влияние препаратов на развитие экспериментального инфаркта миокарда (ЭИМ) 122
2.3.2. Капилляро-протекторное действие 123
2.3.2.1. Острая модель повреждения эндотелия капилляров 123
2.3.2.2. Хроническая модель повреждения эндотелия капилляров 125
2.3.3. Гипертезия 126
2.4. Биохимические методы исследования 127
Концентрация гемоглобина 127
Концентрация метгемоглобина 127
Концентрация общего белка 127
Концентрация глюкозы 128
Активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) 128
, Активность аспартатаминотрансферазы (ACT) 129
Активность креатинкиназы (КК) 129
Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) 129
Концентрация восстановленного глутатиона (GSH) 129
Активность супероксиддисмутазы (СОД) 130
Определение каталазной активности 131
4 Концентрация - продуктов, реагирующих с 2'-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП) 131
Концентрация диеновых конъюгатов (ДК) 132
Подготовка гомогенатов головного мозга и миокарда 132
Концентрация лактата (молочной кислоты (МК)) 133
Концентрация пирувата (пировиноградной кислоты -ПВК)) 133
Концентрация свободных адениннуклеотидов (АТФ, АДФ, АМФ) 134
Концентрация гликогена 134
2.5. Физиологические методы исследования 134
Регистрация ЭКГ 134
Регистрация допплерографических показателей 135
Регистрация артериального давления (АД) 136
Исследование поведения крыс в «открытом поле» 138
Исследование поведения крыс в «приподнятом крестообразном лабиринте -ПКЛ» 138
2.6. Морфологические методы исследования 139
2.7. Экспериментальные модели in ovo 141
2.8. Статистическая обработка результатов 143
Глава 3. Исследование антигипоксического действия флавоноид-содержащих экстрактов 144
3.1. Гипобарическая гипоксия 144
3.2. Гемическая гипоксия 152
3.3. Гипоксия с гиперкапнией 156
Глава 4. Эффективность флавоноид-сожержащих экстрактов на экспериментальных моделях инфаркта миокарда и инсульта 162
4.1. Оценка эффективности флавоноид-содержащих экстрактов при ишемии головного мозга 162
4.2. Влияние флавоноид-содержащих экстрактов на развитие экспериментального инфаркта миокарда 177
Глава 5. Механизмы антирадикальной активности флавоноидов 191
5.1. Способность флавоноидов взаимодействовать со свободными радикалами in vitro 191
5.2. Прооксидантные свойства флавоноидов 210
5.3. Взаимодействие флавоноидов с другими антиоксидантами 212
Глава 6. Капилляро-протекторное действие флавоноидов 221
6.1. Исторические аспекты поиска возможных механизмов действия капилляро-протекторной активности флавоноидов 221
6.2. Влияние флавоноидов и аскорбиновой кислоты на eNOS при остром повреждении эндотелия 223
6.3. Влияние флавоноидов и аскорбиновой кислоты на эндотелиальную дисфункцию при сахарном диабете 231
Глава 7. Антигипертензивное действие флавоноид-содержащих экстрактов и таксифолина 242
7.1. Спонтанно гипертензиные крысы как экспериментальная модель артериальной гипертензии 242
7.2. Эффективность растительных экстрактов на крысах линии SHR 248
7.3. Эффективность таксифолина в эксперименте на крысах линии SHR...272
Глава 8. Механизмы действия таксифолина на тонус сосудов 280'.
8.1. Влияние таксифолина на адренергический механизм регуляции тонуса сосудов 281
8.2. Влияние таксифолина на эндотелиальный механизм регуляции тонуса сосудов 288
8.3. Влияние таксифолина на ренин-ангиотензиновый механизм регуляции тонуса сосудов 296
CLASS Глава 9. Обсуждение результатов исследовани CLASS я 304
Выводы 342
Практические рекомендации 342
Приложения 409
- Эндотелиальные факторы, влияющие на тонус сосудов и факторы свертывания крови
- Оценка хелатирующей способности флавоноидов
- Гипоксия с гиперкапнией
- Влияние флавоноидов и аскорбиновой кислоты на eNOS при остром повреждении эндотелия
Введение к работе
Актуальность исследования. Несмотря на внедрение в медицинскую практику новых лекарственных препаратов наблюдается рост числа заболеваний, связанных с ИБС. Проявление сосудистого спазма остается одной из главных причин развития инфаркта миокарда и инсульта, наиболее тяжело протекающих на фоне гипертонической болезни (Информационный бюллетень ВОЗ №317, 2009; Желнов В.В. и др., 2010), которая выявляется у 20-30% взрослого населения промышленно развитых стран мира. В России распространенность гипертонической болезни среди взрослого населения составляет около 40% (Чазов Е.И., 2005; Шальнова С.А. и др., 2006; Аронов Д.М., Лупанов В.П., 2009).
Понимание фундаментальной роли гипоксии и пероксидации в генезе многих сердечно-сосудистых заболеваний стимулировало разработку средств, способных повышать энергопродуцирующие функции клеток. Развитие гипоксии негативно влияет на метаболизм эндотелиоцитов, что способствует дисфункции эндотелия артериальной стенки и развитию атеросклероза, усугубляя течение гипоксии (Пастушенков Л.В., Лесиовская Е.Е., 1995; Лесиовская Е.Е., Пастушенков Л.В., 2003; Макарова М.Н. и др. 2005; Shen W. et al., 2008; Mattioli L. et al., 2009; Olsson E.M. et al., 2009).
Для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы в настоящее время применяется целый арсенал антигипертензивных, антиангинальных и антигипоксических средств, оказывающих влияние на эндотелий сосудов. Эти препараты регулируют образование множества эндотелий-зависимых сигнальных молекул. Таким образом, эндотелий рассматривается не только как полигон, где происходят основные патологические процессы, но и как активный участник, обеспечивающий обратную связь и реагирующий на изменение гомеостаза. Учитывая широко известную способность флавоноидов оказывать капилляропротекторное действие, перспективным является создание эффективных лекарственных препаратов на их основе для коррекции сердечно-сосудистой патологии (Барнаулов О.Д., 2010; Frank J. et al., 2009; Lu et N.al., 2009; Selmi C. et al., 2009; Tinahones et al., 2009).
Первые эпидемиологические исследования, продемонстрировавшие взаимосвязь потребления флавоноидов с заболеваниями системы кровообращения, были проведены в начале 1990-х годов в Затфенском исследовании пожилых (Launer L.J. et al., 1996). В 2003 г в докладе экспертов ВОЗ «Диета, питание и профилактика хронических заболеваний» флавоноиды были отмечены, как один из факторов, снижающих риск развития сердечно-сосудистых заболеваний. Среди фармакологических свойств флавоноидов можно выделить некоторые ведущие, в первую очередь антиоксидантные, кардио- и вазопротекторные, характерные для большинства классов флавоноидов (Makarova M.N. et al., 2007; 2008; Magos G.A. et al., 2008; Patra S.K. et al., 2008; Caldero A.I. et al., 2009; Kilani-Jaziri S. et al., 2009).
Возможными механизмами действия флавоноидов на сосудистое русло является влияние на систему оксида азота (увеличение экспрессии или активация эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS), восстановление основного кофермента eNOS – тетрагидробиоптерина, предотвращение перехода NO в пероксинитрит, а также влияние на эндотелиальные факторы (EDHF, PGI2 и др.)), факторы свертывания крови, внеклеточный матрикс (гиалуроновая кислота, коллаген и др.), молекулы адгезии и клеточные контакты (CD31) (Duarte J. et al., 2001; Tikchonov V.P. et al., 2006; Cho T.M. et al., 2007; Emura K. et al., 2007; Potenza M.A. et al., 2007; Makarova M.N. et al., 2008; Yamamoto M. et al., 2008).
Перечисленные механизмы тесно связаны с регуляцией тонуса сосудов и влиянием на АД. Поэтому применение фитопрепаратов для лечения гипертонической болезни широко представлено в медицине разных стран. Вместе с тем, по-прежнему актуальным является изучение эффективности, механизмов действия и безопасности препаратов природного происхождения.
Цель исследования. Оценка фармакологической активности ряда растительных экстрактов, отдельных флавоноидов и флавоноид-содержащих препаратов на моделях патологии сердечно-сосудистой системы, а также установление механизмов их антиишемического, антигипертензивного и капилляропротекторного действия.
Задачи исследования
-
На моделях гипобарической, гемической и гиперкапнической гипоксии оценить эффективность 26 флавоноид-содержащих экстрактов и определить наиболее перспективные для последующего исследования на моделях циркуляторной гипоксии.
-
На экспериментальных моделях инфаркта миокарда и ишемического инсульта оценить цитопротекторное действие, влияние на энергетический обмен и состояние антиоксидантной системы перспективных флавоноид-содержащих экстрактов.
-
Определить антиоксидантную активность флавоноидов на моделях in vitro и in vivo, оценить возможные проявления синергизма и антагонизма с компонентами эндогенной антиоксидантной системы, а также с экзогенными биологически активными соединениями других классов.
-
На экспериментальных моделях эндотелиальной дисфункции (оксидативный стресс и аллоксановый диабет) оценить капилляро-протекторную активность флавоноидов в комбинации с аскорбиновой кислотой. Установить основные мишени эндотелия, отвечающие за данную активность, и определить перспективные средства для коррекции сосудистых осложнений при сахарном диабете.
-
На модели спонтанно-гипертензивных животных провести сравнительную оценку антигипертензивного действия стандартизированных флавоноид-содержащих субстанций при курсовом применении. Для наиболее перспективных кандидатов установить дозозависимость действия и изучить возможные механизмы регуляции сосудистого тонуса на модели с использованием сосудов хориоаллантоисной мембраны куриных эмбрионов.
-
Материалы по изучению исследованных препаратов представить в ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора с целью получения разрешения на проведение клинических испытаний и последующую регистрацию.
Научная новизна исследования. Дано экспериментальное обоснование профилактического и лечебного применения флавоноидов при гипоксии и ишемии системного и циркуляторного характера (экспериментальный инфаркт миокарда и инсульт). Впервые дана оценка антигипоксического и антиишемического действия с использованием моделей, имеющих разные патогенетические основы, что позволило установить различные механизмы их действия и предложить алгоритм поиска наиболее перспективных лекарственных кандидатов.
Дана комплексная оценка флавоноидов, представляющих различные классы, в отношении их восстанавливающих, антирадикальных и хелатирующих свойств при использовании различных методов инициации свободно-радикального окисления. Разработаны новые методические подходы для оценки антиоксидантной активности лекарственных препаратов, содержащих флавоноиды. Получены новые данные об антиоксидантной активности флавоноидов с учетом их функционального взаимодействия с компонентами эндогенной антиоксидантной системы и другими биологически активными соединениями с учетом проявления синергизма, аддитивности и антагонизма.
На разработанных моделях развития макро- и микроангиопатий изучено влияние флавоноидов и флавоноид-содержащих субстанций на эндотелиальную дисфункцию, которая сопровождалась утолщением интимы сосудов, снижением относительного количества перицитов в эндотелии и выраженности регидности артерий по показателям допплерографии. Установлена взаимосвязь экспрессии маркера межклеточных контактов CD31 и eNOS с выраженностью повреждения сосудистого русла при экспериментальном аллоксановом диабете.
На примере индивидуальных флавоноид-содержащих субстанций и их комбинаций с аскорбиновой кислотой раскрыты основные механизмы действия и мишени вазо- и кардиопротекторного действия этого класса биологически активных соединений.
Впервые на экспериментальных моделях гипертензии с использованием генетически модифицированных животных (SHR) и на хориоаллантоисной мембране куриных эмбрионов с использованием агонистов, запускающих три механизма вазоконстрикции, изучено антигипертензивное действие флавоноид-содержащих субстанций, а также предложены новые методические подходы к оценке механизмов их действия.
Научно-практическая значимость. Получено экспериментальное подтверждение фармакологической эффективности флавоноид-содержащих препаратов при развитии эндотелиальной дисфункции на фоне острого и хронического повреждения эндотелия (ангиопротекторные свойства асковертина). Доказанный синергистический антиоксидантный эффект применения каротиноидов лютеина и зеаксантина совместно с антоцианозидами и проантоцианидинами черники позволил рекомендовать к регистрации препарат черники плоды (порошок). Экспериментально обоснована целесообразность применения флавоноидов и флавоноид-содержащих субстанций в составе комплексных препаратов для лечения ишемической болезни сердца (препарат асковертин) и сахарного диабета 2 типа (препарат арфазетин-Э). Разработаны методические рекомендации для экспериментального исследования препаратов, предназначенных для лечения сахарного диабета и связанных с ним осложнений, для коррекции заболеваний, связанных с эндотелиальной дисфункцией, а также дополнены методические рекомендации по доклиническому изучению антиатерогенных средств.
По результатам работы получены 2 патента, направленные на повышение биодоступности флавоноид-содержащих препаратов: №2351352 от 10.04.2009 г. «Твердая нанокомпозиция для доставки биологически активных веществ» и №2362544 от 27.07.2009г. «Наноэмульсия с биологически активными веществами».
Положения, выносимые на защиту
1. Для экстрактов чаги, хвоща полевого, кедра сибирского, хмеля обыкновенного, ромашки аптечной, родиолы розовой установлено наличие антигипоксических и антиишемических (при экспериментальном инфаркте миокарде и инсульте) свойств. Их эффективность связана с защитой клеток от цитолиза, улучшением энергообеспечения ишемизированных органов, снижением интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) и уровня ацидоза.
2. Флавоноиды и препараты на основе их комбинации с аскорбиновой кислотой обладают выраженными капилляро-протекторными свойствами при экспериментальной острой и хронической патологии сосудистого русла, что связано с запуском механизмов экспрессии eNOS и CD31 в эндотелии сосудов, а также стимуляцией обновления клеточного состава сосудистой стенки.
3. Антиишемическое, антигипоксическое и капилляро-протекторное действие флавоноидов и препаратов на их основе обусловлено антирадикальными, антиоксидантными, мембрано- и цитопротекторными свойствами. Антирадикальная активность флавоноидов существенно зависит от типа радикала, длительности его жизни, реакционной способности и используемой концентрации исследуемых соединений. При применении флавоноидов в качестве лекарственных препаратов необходимо учитывать их установленное функциональное взаимодействие с эндогенными компонентами антиоксидантной системы и другими экзогенными антиоксидантами по типу синергизма, аддитивности или антагонизма.
4. Проведенные исследования позволили установить антигипоксические и антиишемические свойства нового препарата арфазетин-Э, рекомендованного для лечения сахарного диабета 2 типа, антигипертензивные и капилляро-протекторные свойства нового препарата асковертин, которые реализуются по эндотелиальному механизму, а также способность антоцианозидов и проантоцианидинов препаратов черники потенцировать антиоксидантную активность каротиноидов лютеина и зеаксантина.
Реализация результатов работы. Выявленные в ходе работы патофизиологические и фармакологические особенности экспериментального изучения лекарственных препаратов вошли в новую редакцию Методических рекомендаций Фармакологического комитета РФ в отношении новых средств, применяемых для лечения сахарного диабета, обладающих гиполипидемическими и антиоксидантными свойствами.
Результаты работы легли в основу материалов, представленных в Минздравсоцразвития для получения разрешения на клиническое применение препаратов:
- «Черники плоды», порошок, ОАО Завод экологической техники и экопитания «ДИОД». Регистрационное удостоверение №ЛСР – 009445/08 от 26.11.2008.
- Арфазетин-Э, сбор измельченный, пачки и фильтр пакеты, ОАО «Красногорсклексредства». Регистрационное удостоверение №000159/10 от 25.02.2010.
- «Асковертин», таблетки, ОАО Завод экологической техники и экопитания «ДИОД». Регистрационное удостоверение №000031 от 26.01.2010.
Апробация работы. Основные результаты, диссертационной работы, доложены и обсуждены на конференции Общества исследователей препаратов природного происхождения (GA) (Kiel, Germany, 2003); международной конференции “Progress in biotechnology and neurobiology” (Hurgada, Egypt, 2004); 2-ой межрегиональной научно-практической конференции: Питание здорового и больного человека (Санкт-Петербург, 2004); 8-м международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Mikkeli, Finland, 2004); научно-практической конференции с международным участием «Клиническая фармакология в России: достижения и перспективы» (Москва, 2004); 9-м международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2005); 4-ой Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005); 10-м международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2006); 8-м Международном Конгрессе Международного Общества адаптационной медицины (ISAM) (Москва, 2006); конференции Общества исследователей препаратов природного происхождения (GA) (Helsinki, Finland, 2006); конференции «Secondary metabolism in plant cell» (Leiden, Nederland, 2006); 8-ой Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2006); международной конференции общества «Oxygen Club of California» (Santa Barbara, California, USA, 2006); Политехническом симпозиуме молодых ученых (Санкт-Петербург, 2006); 2-ой международной конференции по стрессу (Будапешт, Венгрия, 2007); 12-м международном съезде «Phytopharm» (Санкт-Петербург, 2008); 13-м международном съезде «Phytopharm» (Bonn, Germany, 2009); 57-ой конференции Общества исследователей препаратов природного происхождения (GA) (Geneva, Switzerland, 2009); 14-м международном съезде «Phytopharm» (Санкт-Петербург, 2010); 58-ой конференции Общества исследователей препаратов природного происхождения (GA) (Berlin, Germany, 2010); научно-практической конференции СПбГМА им. И.И. Мечникова «Актуальные проблемы медицины и биологии» (Санкт-Петербург, 2010); научно-практической конференции СПбГМА им. И.И. Мечникова "Метаболический синдром: междисциплинарные проблемы" (Санкт-Петербург, 2010); обществе фармакологов Санкт-Петербурга (Санкт-Петербург, 2011).
Личное участие автора в выполнении исследования
Исследования выполнены на базе кафедр фармакологии и биохимии СПбГМА им. И.И. Мечникова. Автор был инициатором и основным исполнителем всех разделов работы, что выразилось в руководстве и выполнении исследований по оценке эффективности и безопасности препаратов, выполнении фармакологических, биохимических и физиологических исследований.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, шести глав полученных результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложений. Диссертация изложена на 420 страницах стандартного текста, иллюстрирована 96 таблицами, 46 рисунками. В работе использовано 206 отечественных и 655 иностранных источников литературы.
Эндотелиальные факторы, влияющие на тонус сосудов и факторы свертывания крови
Эндотелиальный сосудорасширяющий фактор (EDRF) включает в себя гиперполяризующий фактор (EDHF), NO, и PGI2 (рис. 1.7). Эндотелиальный сосудорасширяющий фактор является наиболее важным из всех факторов, продуцируемых клетками эндотелия сосудов (эндотелина, простагландинов, фактора активации тромбоцитов и т.д.). Вазодилатирующее действие этого комплекса веществ связывают с наличием активного нитроксид-радикала, стимулирующего растворимую гуанилатциклазу, которая в свою очередь повышает уровень цГМФ в гладкомышечных клетках, вызывая их расслабление. В крови EDRF ингибирует активацию, адгезию и агрегацию тромбоцитов. Наряду с этим EDRF тормозит освобождение норадреналина из симпатических нервных окончаний, снижая нейронально вызванное сужение сосудов. EDRF освобождается клетками эндотелия как внутрь сосуда, так и в сторону его гладкомышечной оболочки, обеспечивая, таким образом его комплексное влияние на тромбоциты, гладкомышечные клетки и симпатические нервные окончания.
Обязательным условием образования EDRF эндотелиальными клетками считается увеличение в них внутриклеточной концентрации Са"+, которое может происходить двумя путями. Так, согласно гипотезе А. Luckhoff и R. Busse (1990a,b,c), циркулирующие с кровью вазоактивные вещества (в частности, норадреналин, брадикинин, тромбин) через специфические мембранные рецепторы активируют фосфолипазу С, с помощью которой увеличивается синтез инозитол-1,4,5-трифосфата. Последний мобилизует Са" из внутриклеточных источников, который:
- активируя фосфолипазу А, стимулирует освобождение арахидоновой кислоты и синтез из нее простациклина 12;
открывает кальцийзависимые калиевые каналы, способствуя гиперполяризации мембраны и потенциал-зависимому входу Са"+ в клетку;
- запускает НАДФН-зависимую цепь образования N0 из L-аргинина. Однако более существенным стимулом образования EDRF считается ламинарное напряжение сдвига, под которым понимают продольное напряжение стенки сосуда, обусловленное вязкостным взаимодействием эндотелия с движущейся кровью. Напряжение сдвига зависит от реологических свойств крови и эндотелиального монослоя, а также от локальных векторов напряжения во взаимно движущихся телах. Функциональное состояние эндотелия сильно зависит от напряжения сдвига, подтверждением чему служат управляемые им калиевые и кальциевые каналы в мембране эндотелиоцитов. Открытие калиевых каналов, гиперполяризуя мембрану, обеспечивает потенциал-зависимый вход Са"+ в клетку. Соответственно, блокада кальций-зависимых калиевых каналов подавляет индуцированную сдвигом дилатацию, не влияя при этом на ацетилхолиновую релаксацию сосуда. -В свою очередь активатор калиевых каналов BRL 34915 усиливает и пролонгирует гиперполяризацию мембраны, вызываемую брадикинином.
Эта гиперполяризация сопровождается увеличением выхода EDRF, тогда как деполяризация клеток внеклеточным калием ингибирует его выделение.
Учитывая, что деформационные напряжения в эндотелии возникают не только при ламинарном движении крови вдоль сосуда, но и при его пульсационном растяжении, последнее также считается важным фактором освобождения EDRF.
Выделение EDRF в просвет сосудов носит непрерывный характер, поддерживаемый циркулирующими в крови сосудосуживающими агонистами. Последнее подтверждается опытами на изолированных по Лангендорффу сердцах кроликов, где добавление в перфузат гемоглобина, связывающего EDRF, или биологически инертного монометил-аргинина приводит к снижению коронарной проводимости.
Итак, в эндотелиальных клетках заложен мощный вазодилатирующий механизм, контролирующий вазоконстрикторное влияние многих физиологических
факторов. В связи с этим при повреждении или удалении эндотелия гидродинамические стимулы и гемостатирующие факторы (АДФ, АТФ, серотонин, тромбин, фактор активации тромбоцитов), медиаторы и гуморальные регуляторы (ацетилхолин, норадреналин, брадикинин, ангиотензин-П, вазопрессин, аденозин, гистамин) оказывают прямое сосудосуживающее действие на коронарное русло, тогда как при функционально целостном эндотелии эти реакции меняют знак на обратный или существенно уменьшаются.
Эндотелий зависимый гиперполяризующий фактор (EDHF) выделяется эндотелием при действии агонистов мускарина, например, ацетилхолина. EDHF вызывает гиперполяризацию гладкомышечных клеток артериальной стенки и, соответственно, её релаксацию. G. Edwards и соавторами (1998) было установлено, что EDHF не что иное как К+, который выделяется эндотелиоцитами в миоэндотелиальное пространство стенки артерии при действии на последнюю адекватного раздражителя. В этом процессе задействованы Са + -чувствительные К+-каналы и Na+/K+ АТФ-аза (Edwards G. et al, 1998). По мнению авторов, EDHF наряду с N0 и PGL играет важную роль в регуляции кровяного давления и потока.
Эндотелий-зависимые констрикторные факторы (endothelium-derived constriction factors (EDCFs): PGH2 и TXA2 вызывают деполяризацию гладкомышечных клеток и сужение сосуда (рис. 1.7). Они также вызывают изменение активности протеинкиназ A, G и С (РКА, PKG и РКС). Эти киназы действуют на различные внутриклеточные мишени, регулируют уровень Са"+ и/или непосредственно влияют на активность ионных каналов. В процессе старения синтез эндотелий-зависимых сосудорасширяющих факторов уменьшается, тогда как вклад эндотелий-зависимых факторов констрикции увеличивается. Уменьшение синтеза эндотелий-зависимого N0 и PGb приводит к относительному снижению активности PKA/PKG и увеличению активности РКС, что сокращает мембранную гиперполяризацию и увеличивает сосудистый тонус.
Оценка хелатирующей способности флавоноидов
Один из возможных неферментных путей образования свободных радикалов состоит в одноэлектронном восстановлении молекулярного кислорода ионами двухвалентного железа: Fe2+ + 02 - Fe3+ + 02 Другими механизмами участия ионов железа в биологическом свободнорадикальном окислении являются реакции Fenton и Haber-Weiss (Фридович И., 1979; Qian S.Y., Buettner G.R., 1999). Ионы меди также являясь двухвалентными, могут участвовать в реакциях свободнорадикального окисления наравне с ионами железа (Pankit A.N., Bhave S.A., 2002; Strausak D. et al., 2001). Еще одним металлом, для которого реакции хелатирования с флавоноидами хорошо изучены, является алюминий (А1СЬ). Этот метод применяется для определения суммы флавоноидов по ГФ XI (Муравьев И.А., 1980; Шинкоренко А.Л., Бандюкова В.А, 1977). Он основан на реакции комплексообразования с хлоридом алюминия и отражает наличие флавоноидов, содержащих в положении 3 или 5 гидроксильную группу. При этом образуется 2 типа комплексов с одинаковым соотношением компонентов (на примере кверцетина):
Хелаторы выводят ионы двухвалентных металлов из редокс-циклов, уменьшая содержание этих ионов в организме, и тем самым, препятствуя протеканию окислительных процессов.
Для оценки хелатирующей способности исследуемых образцов нами использована методика предложенная. Brown J.E. и соавт. (1998). Конечная концентрация исследуемых образцов составляла 0,014 мг/мл, FeS04, CuS04 и АІСІз 90 мкМ, в инкубационной системе содержащей 10 мМ трис-HCl буфер, рН 7,4. Спектры поглощения регистрировали с помощью спектрофотометра Shimadzu UV-1700, через 5 мин после добавления металла. Для оценки реверсии образовавшихся комплексов использовали ЭДТА в конечной концентрации 125 мкМ.
Все исследования выполняли в соответствии с Guide for the care and use of laboratory animals. National Academy press. -Washington, D.C. 1996.
Животные содержались в стандартных условиях в соответствии с правилами, утвержденным МЗ СССР 06.07.73 г., по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) и ГОСТ Р 53434-2009. Животных размещали в поли карбонатных клетках, группами, на подстиле; клетки покрыты стальными решетчатыми крышками с кормовым углублением. В качестве подстила использовали древесные гранулы (ООО «Биосфера», Санкт-Петербург, Россия). Животные получали корм «Для содержания лабораторных животных» ПК-120-1, приготовленный по ГОСТ Р 50258-92 в соответствии с нормами утвержденными приказом МЗ СССР №755 от 12.08.77 г. ad libitum в кормовое углубление стальной решетчатой крышки клетки. Животные получали воду, соответствующая ГОСТу "Вода питьевая" 2874-82, в стандартных поилкаххо стальными крышками-носиками, ad libitum.
Животных содержали в контролируемых условиях окружающей среды (20-26С и относительной влажности воздуха 40-70%). Световой режим составлял 12 часов света и 12 часов темноты. Контролировали воздухообмен в помещении путем измерения содержания в воздухе углекислого газа и аммиака. Режим проветривания, обеспечивал около 15 объемов помещения в час, концентрацию СОг не более 0,15 объемных %, аммиака — не более 0,001 мг/л.
Животные: в эксперименте использованы беспородные мыши самцы, массой 20-25 г., полученные из питомника лабораторных животных РАМН «Рапполово», в количестве 880 голов.
Экспериментальная патология. Моделирование острой гипобарической гипоксии проводили в проточной барокамере для лабораторных животных (Виноградов В.М., Урюпов О.Ю., 1985). Условия, имитирующие пребывание на "высоте" обеспечивали за счет выявления порогового разрешения атмосферы. "Подъем" животных осуществлялся на высоту 10 тыс. м. Экспозиция на "высоте" составляла 20 мин. В качестве референтного препарата использовали амтизол (в соответствии Методическими рекомендациями, 1990).
Введение исследуемых веществ. Каждое из исследуемых веществ изучалось в трех дозах одновременно с препаратом сравнения и контрольной группой животных. Все вещества в виде водного раствора вводили животным натощак per os в объеме 0,2 мл/мышь (с помощью специального зонда) на протяжении 5 суток. Животные контрольной группы получали дистиллированную воду в эквивалентном объеме. На»5-ый день исследования вещества и воду вводили мышам за 2 часа до острой гипобарической гипоксии.
Исследуемые показатели. Об эффективности препаратов судили по выживаемости животных в течение 10-20 мин. пребывания "на высоте" (в %) и средней продолжительности их жизни в этих условиях (в секундах) (Виноградов В.М., Урюпов О.Ю., 1985).
Животные: в работе использованы беспородные мыши самцы, массой 20-25 г., в количестве 130 голов и беспородные крысы самцы, массой 200-250 г., в количестве 35 голов, полученные из питомника лабораторных животных РАМН «Рапполово».
Экспериментальная патология. Для моделирования гемической гипоксии использовали натрия нитрит (NaNCb), который вводили в дозе 150 мг/кг внутрибрюшинно.
Введение исследуемых веществ. Исследуемые вещества вводили per OS ежедневно в течение пяти дней в дозе 150 мг/кг веса в объеме 0,5 мл. Последнее введение осуществляли за 2 часа до внутрибрюшинной инъекции натрия нитрита.
Исследуемые показатели. Время выживаемости, концентрация гемоглобина, метгемоглобина и глутатиона, активность глутатион зависимых ферментов, СОД и каталазы, концентрация ТБК-реагирующих продуктов.
Гипоксия с гиперкапнией
Гипоксию с гиперкапнией моделировали в термокамере, где происходит постепенное снижение содержания кислорода и повышение рСОг в воздухе за счет дыхания животных. Регистрировали продолжительность жизни животных, по которой судили об эффективности исследуемых веществ. Флавоноид-содержащие экстракты вводили перорально ежедневно в течение 5 дней. Последнее введение осуществляли за два часа до помещения животных в камеры. В этой серии экспериментов, исследуемые экстракты вводили в дозе 50 и 15 мг/кг. Мышам контрольной группы в то же время и в том же объеме вводили воду. Каждая экспериментальная группа включала по 10 особей. Полученные результаты представлены в таблице 3.5.При этом виде гипоксии, наиболее выраженное положительное действие на длительность жизни мышей (увеличение почти на 50%) оказывал экстракт родиолы розовой, следующими по эффективности оказались экстракты аронии черноплодной и черного листа бадана, под влиянием которых длительность жизни мышей увеличивалась на 31 -32%.
Основными действующими веществами плодов аронии черноплодной считают флавоноиды (рутин, кверцитрин, гесперидин, кверцетин, катехинов: ((-)-эпикатехин, (+)-катехин и незначительные количества галлокатехина, антоцианы (цианидин и его гликозиды, дельфинидин) (Муравьева Д1А., 1991; Блинова К.Ф. и др., 1996; Энциклопедический ..., 1999).- Суммарное содержание флавоноидов в свежих плодах аронии составляет 5-6%. Более 76%о флавоновых гликозидов составляют гликозиды кверцетина, около 10%) -гликозиды кемпферола и 4% - производные изорамнетина (Шапиро Д.К., 1980). Наиболее важная биологическая роль этих соединений - проявление антиоксидантной активности (Kowalczyk Е. et al., 2002; Zheg W., Wang S.Y., 2003). Также указывают на наличие у аронии гипогликемических (Maslov D.L., et al., 2002; Semenov S.V., et al., 2002), противовоспалительных (Borissova P., et al., 1994), гипотензивных свойств (Шапиро Д.К., 1980; Broncel M. et al, 2007; Skoczynska A. et al., 2007; Kulling S.E., Rawel H.M., 2008).
Водные экстракты винограда культурного, хвоща полевого, чаги, ромашки аптечной, кедра сибирского обладали практически одинаковой эффективностью на данной модели, увеличивая длительность жизни животных на 17-25%) по сравнению с контрольной группой. Пренилированные флавоноиды хмеля обыкновенного и шалфея лекарственного обладали практически одинаковой эффективностью и увеличивали длительность жизни мышей на 17 и 25% , соответственно. Водный экстракт календулы лекарственной, а также экстракты зеленого и красного листа бадана толстолистного эффективностью на данной модели не обладали.
Для удобства обсуждения, результаты исследования на 3-х видах системной гипоксии представлены в таблице 3.6.
Необходимо отметить, что экстракты чаги и хвоща оказались наиболее эффективны в отношении всех трех видов гипоксии, поэтому их детальное изучение было продолжено на модели ишемии головного мозга.
Также весьма интересны, оказались эффекты водных экстрактов хмеля, кедра и ромашки аптечной. Выраженный эффект родиолы розовой на гипоксию с гиперкапнией (при снижении р02), позволяет предположить, что механизм его действия связан с индукцией фактора HIF-1, на что есть указания в литературе (Zhang J. et al., 2009). Детальное исследование данных экстрактов было продолжено на модели экспериментального инфаркта миокарда.
Для подтверждения специфической антигипоксической активности обычно используют модели приближенные к клинической патологии. В нашем эксперименте оценку защитного действия флавоноид-содержащих экстрактов проводили, моделируя локальную циркуляторную гипоксию жизненно важных органов - мозга и сердца, путем лигирования сосудов или временного наложения на них зажимов, уменьшающих кровоток и доставку кислорода к отдельным органам. Были изучены флавоноид-содержащие экстракты чаги и хвоща при ишемии мозга, а также хмеля обыкновенного, кедра сибирского, родиолы розовой и ромашки аптечной при экспериментальном инфаркте миокарда.
Следует отметить, что нарушение кровообращения, сопровождающееся гипоксией, особенно опасно для функционирования головного мозга. Частота ишемических нарушений мозгового кровообращения составляет около 70% сосудистых заболеваний мозга, при этом в половине случаев основным патогенетическим фактором является окклюзионное поражение экстракраниальных артерий (Виленский Б.С, 1995; Полховский А.А., 1997).
Стенозирующее поражение сосудов, кровоснабжающих головной мозг, являются одной из причин возникновения инсультов ишемического типа (Верещагин Н.В. и др., 1994; Дривотинов Б.В. и др., 1997; Барнаулов О.Д. и др., 2000). Снижение скорости мозгового кровотока у человека во время ишемии с 55 до 20 мл/100 г/мин. приводит к выраженным клиническим нарушениям и изменениям электроэнцефалограммы (ЭЭГ). При снижении скорости кровотока до 10 мл /100 г/мин. происходят биохимические нарушения, приводящие к гибели нейронов (Кругер Д., 1997). Безусловно, ишемия головного мозга гораздо тяжелее гипоксического воздействия вследствие дефицита не только кислорода, но и субстратов, среди которых важнейшим для мозга является глюкоза. Углеводные запасы в мозге практически отсутствуют, и при полной ишемии глюкозы достаточно лишь на несколько секунд (Kuschinsky W., 1991).
Целью исследования явилось изучение защитной активности сухих водных экстрактов чаги и хвоща полевого в условиях острой ишемии головного мозга и в реперфузионном периоде.
Влияние флавоноидов и аскорбиновой кислоты на eNOS при остром повреждении эндотелия
Н. Si и D. Liu (2008) установили, что генистеин повышает синтез NO в клетках эндотелия аорты человека и пупочной вены за счет увеличения экспрессии eNOS, что способствует снижению артериального давления у крыс с врожденной гипертензией. В свою очередь W.M. Loke и соавторы (2008) при изучении влияния кверцетина, эпикатехина и эпигаллокатехин галлата показали, что только кверцетин и эпикатехин достоверно увеличивают содержание NO в крови у здоровых мужчин, а эпигаллокатехин галлат не оказывает влияния на этот показатель.
Однако M.F. McCarty (2008) указывает, что флавоноиды, по-видимому, не влияют непосредственно на увеличение экспрессии eNOS, а их4 положительное влияние на эндотелий в наномолярных концентрациях, достижимых in vivo, выражается в эффективной нейтрализации пероксинитрит-производных радикалов, что способствует защите кофактора тетрагидробиоптерина, необходимого для проявления активности eNOS.
P.U. Ertug и соавторы (2009) показали, что кверцетин способствует накоплению эндогенного оксида азота в кавернозных телах у мышей.
Катехин, нейтрализуя супероксиданион радикал, и предотвращая снижение синтеза N0, уменьшает влияние ангиотензина II in vitro (Wu L.Y. et al., 2009).
Для оценки капилляро-протекторного действия флавоноидов мы использовали модель in vivo. В качестве эндотелий-повреждающего фактора была использована перекись водорода, которая при попадании в кровеносное русло вызывает системное состояние окислительного стресса, с преимущественным повреждением эндотелия по нескольким механизмам (рис. 6.1): - окисление белков и ферментов, содержащих в своем аминокислотном составе SH- и ОН-группы; - окисление 4-гидроксипролина, входящего в состав коллагена с разрушением коллагена и образованием свободного 5-гидроксипролина; инициирование окисления оксигемоглобина и образования гидроксил-радикала, как наиболее токсичной формы кислорода; - запуск процесса перекисного окисления липидов, входящих в состав мембран эндотелиоцитов; - снижение выработки важнейшего вазодилататора NO, за счет окисления коферментов eNOS.
Еще одной целью работы было установить наличие эффектов синергизма между флавоноидами и аскорбиновой кислотой in vivo. В качестве исследуемых препаратов были использованы: аскорбиновая кислота (АК), комбинация аскорбиновой кислоты с рутином (АР) в соотношении 1:1 и комбинация аскорбиновой кислоты с таксифолином (AT) в соотношении
225 2,3:1- Исследуемые препараты вводились в дозах 50, 100 и 200 мг/кг, аскорбиновая кислота в дозе 140 мг/кг. Исследуемые препараты вводили внутрижелудочно по профилактической схеме в течение 5-ти дней до введения перекиси водорода ежедневно.
Кроме того, цитотоксическое действие перекиси водорода может реализовываться через активацию сывороточных белков системы комплемента. Перекись водорода индуцирует диссоциацию железа из ферритина, а также вызывает деградацию гемовых белков, что, в частности приводит к высвобождению железа из гемоглобина и миоглобина, а в присутствии каталитически активных ионов железа цитотоксическое действие самой перекиси усиливается в 10-1000 раз.
На фоне оксидативного стресса, который в данном эксперименте спровоцирован внутривенным введением перекиси водорода, происходит накопление токсичных продуктов в результате деструкции белков и нуклеотидов, а также ПОЛ. При продолжительном оксидативном стрессе происходит истощение антиоксидантной системы, активация транскрипционных факторов, прежде всего NF-кВ, гиперактивация апоптоза, нарушение синтеза простаноидов и медиаторов свертывания крови (Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., 2000).
В ходе биохимических исследований было показано, что в контрольной группе (без лечения), на фоне внутривенного введения перекиси водорода статистически значимо (на 43,5%) по сравнению с интактной группой увеличивалась концентрация ТБК-РП, что свидетельствует об усилении процессов ПОЛ в результате оксидативного стресса.
При гистологическом исследовании установлено, что воздействие перекиси водорода в концентрации 0,02 М вызывало развитие нарушения проницаемости эндотелия в основном правых отделов сердца. Основным признаком поражения эндотелия было формирование отека в интиме легочной артерии, аорты, эндокарда левого и правого желудочков1 сердца (рис. 6.2). Выраженность этих изменений соответствовала направлению тока крови, в первую очередь повреждались легочная артерия и правые отделы сердца. Еще одним интересным фактом, установленным на данной модели, оказалось увеличение диаметра сосудов эпикарда сердца, хотя по литературным данным ожидаемым результатом должна была быть вазоконстрикция.
При иммуногистохимическом исследовании экспрессии eNOS установлено, что перекись водорода вызывала подавление экспрессии eNOS в тканях сердца, легких и аорты.
