Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
1.1. Структура-лидер в группе петлевых диуретиков 17
1.2. Катион-хлорные транспортеры — как биологические мишени петлевых диуретиков и их роль в водно-электролитном гомеостазе . 21
1.3. Характеристика современных методов оценки и прогнозирования биологической активности 31
1.4. Состояние лекарственного вещества в организме 41
Глава 2. Материалы и методы 51
2.1.Теоретические исследования 51
2.2. Экспериментальные химические исследования 55
2.3. Экспериментальные фармакологические исследования 60
Глава 3. Расчет структуры фуросемида и оценка энергии взаимодействия его функциональных групп с катион-хлорными транс портерами 68
Глава 4. Анализ первичной структуры катион-хлорных транспортеров как белков-мишеней для действия фуросемида 83
Глава 5. Оценка роли карбоксильной группы фуросемида в обеспечении его фармакологической активности 97
5.1. Экспериментальное и теоретическое исследование механизмов фармакологической активности этилового эфира фуросемида 98
5.1.1. Фармакодинамический спектр этилового эфира фуросемида
5.1.2. Сравнительное экспериментальное исследование диуретической активности фуросемида и его этилового эфира 104
5.2. Экспериментальное и теоретическое исследование механизмов фармакологической активности метилового эфира фуросемида 105
5.2.1. Фармакодинамический спектр метилового эфира фуросемида 106
5.2.2. Сравнительное экспериментальное исследование диуретической активности фуросемида и его метилового эфира 113
Глава 6. Оценка роли пространственного строения молекулы фуросемида в обеспечении его фармакологической активности 116
6.1. Фармакодинамический спектр фуросемида 117
6.2. Сравнительное экспериментальное исследование диуретической активности фуросемида и N-ацетамида фуросемида 125
Глава 7. Оценка роли гидрофобного сегмента молекулы фуросемида в обеспечении его фармакологической активности 128
7.1. Фармакодинамический спектр йод-фуросемида 129
7.2. Сравнительное экспериментальное исследование диуретической активности фуросемида и йод-фуросемида 139
7.3. Исследование связи гидрофобных свойств фуросемида и йод-фуросемида с из мочегонной активностью 143
Глава 8. Теоретическое и экспериментальное исследование механизмов фармакологической активности фуросемида при различных рН мочи 147
8.1. Фармакодинамический спектр иона фуросемида 148
8.2. Экспериментальное исследование зависимости доли молекулярной формы фуросемида от значения рН среды 156
8.3. Диуретическая активность фуросемида при различных значениях рН мочи в эксперименте на крысах 161
Глава 9. Исследование закономерностей взаимоотношения «ДОЗА ЭФФЕКТ» для фуросемида 168
Глава 10. Обсуждение результатов 174
Выводы 192
Практические рекомендации 194
Литература
- Катион-хлорные транспортеры — как биологические мишени петлевых диуретиков и их роль в водно-электролитном гомеостазе
- Экспериментальные химические исследования
- Анализ первичной структуры катион-хлорных транспортеров как белков-мишеней для действия фуросемида
- Сравнительное экспериментальное исследование диуретической активности фуросемида и его этилового эфира
Введение к работе
Актуальность проблемы.
За последние годы достигнуты определенные успехи в области создания принципиально новых лекарственных веществ с новым механизмом действия, имеющих свою терапевтическую нишу и открывающих новые возможности в лечение тех или иных заболеваний. Однако поиск новых высоко активных и селективных лекарственных веществ и разработка принципов их проектирования по-прежнему остается одной из наиболее актуальных задач современной фармацевтической и фармакологической науки [Харкевич, 2003; Машковский, 1994]. А в последние годы сформулированы стратегические цели правительства РФ в области производства отечественных лекарств [Путин, 2009].
В настоящее время в создании новых лекарственных средств основную роль играют фундаментальные исследования. Они касаются не только химических проблем (теоретической химии, физической химии, технологии органического синтеза и др.), но и сугубо биологических. Успехи молекулярной биологии, молекулярной фармакологии, генетики и других медико-биологических дисциплин стали существенным образом влиять на такой важный аспект фармакологии, как создание препаратов [Waterston et al., 2003; Venter et al., 2003; Levy et al., 2007].
Известно, что механизм действия, фармакологическая активность и селективность лекарственного вещества напрямую связаны с его химическим, т.е. электронным строением. Молекулярный механизм действия большинства лекарственных веществ заключается в физико-химическом взаимодействии их с биологическими мишенями [Цирельсон, 2000; Шкуматов, 2003].
Ранее предпринималось большое число попыток объяснить роль той или иной функциональной группы молекулы действующего вещества в обеспечении его фармакологической активности. Для этого было организовано много проектов по предсказанию биологической активности основанные как на статистическом анализе частоты встречаемости функциональных групп (PASS) [Поройков, 2004], так и на соответствии определенного набора физико-химических дескрипторов вещества наблюдаемым фармакологическим эффектам при его действии (MATRIX) [Погребняк, 2004]. Помимо этого для объяснения активности широко использовалось трехмерное подобие пространственного строения мишени и лиганда, основанное на принципе «ключа и замка» [Jones et al., 1997; Rarey et al., 1996]. Однако, все же пока еще остаются непонятными глубинные механизмы биологической активности множества действующих веществ. В связи с этим, разработка новых методов и технологий проектирования и оценки биологической активности высокоактивных и высокоселективных лекарственных веществ, а так же поиск закономерностей взаимосвязи «структура-активность», основанных на данных электронного и пространственного строения молекулы лекарства являются актуальными и практически значимы.
Детальное изучение сложных механизмов действия диуретических средств позволило в короткие сроки создать и внедрить в клиническую практику большое число мочегонных препаратов с различными механизмами действия. Однако, современные диуретики пока не отвечают всем требованиям врачей-клиницистов к этой группе лекарственных средств. До сих пор частыми осложнениями диуретической терапии остаются гипокалиемия, гиперурикемия, обратимое ухудшение слуха и другие [Брюханов, 2003; Глезер, 1993].
Учитывая широкое применение мочегонных средств в клинической практике, представляется важным исследовать отдельные стороны механизма действия и некоторых закономерностей фармакологической активности диуретических средств, связанных с их электронным строением. Наиболее интересным объектом исследования представляется фуросемид. В группе петлевых диуретиков он по праву является «структурой-лидером» [Носков, 1999]. Этот препарат находит широкое применение в лечении гипертонической болезни, сердечной недостаточности, нефротического синдрома, цирроза печени и многих других заболеваний, являясь сегодня популярнейшим представителем группы мочегонных средств [Зверев, 2000].
Достижения последних десятилетий в области генетики и молекулярной биологии пролили свет на клеточные механизмы действия многих современных диуретиков. Стало известно, что многие из них прямо взаимодействуют с высокоспециализированными ионными каналами и котранспортерами, в изучении топологии и функциональной роли которых также сделан большой шаг вперед [Gerelsaikhan et al., 2000; Riek et al., 2002].
Учитывая то обстоятельство, что среди современных мочегонных средств нет оригинальных отечественных препаратов, работы по углубленному изучению закономерностей фармакологической активности этой группы лекарственных веществ с целью разработки новых, более отвечающих требованиям клиницистов являются весьма актуальными и практически важными. Данная работа посвящена разработке технологии проектирования лекарственных веществ и определения величины их специфической активности и исследованию особенностей молекулярного механизма действия лекарственного вещества с помощью компьютерного моделирования, поиску взаимосвязи его электронного строения и фармакологической активности в эксперименте, а также созданию на основе полученных данных нового диуретика с заданной мочегонной активностью. В качестве соединения-лидера использован фуросемид, в структуре которого при модификации теоретически обоснованно усиливали или ослабляли целевые свойства.
Цель исследования. Учитывая актуальность вопроса и его современное состояние, была определена цель исследования:
Разработать и апробировать новую технологию проектирования лекарственных веществ и определения величины их специфической активности по результатам расчетов пространственного и электронного строения молекулы действующего вещества с оценкой роли основных функциональных групп и ключевых фрагментов. На примере производных сульфонилбензойной кислоты в эксперименте изучить расчетные изменения фармакологической активности спроектированных молекул.
Основные задачи исследования. В соответствии с намеченной целью были поставлены следующие задачи:
-
Разработать технологию определения величины специфической активности лекарственного вещества на основе модели «заместительного механизма» комплексообразования органических лигандов с белковыми мишенями в водной среде.
-
Изучить особенности пространственного и электронного строения молекулы фуросемида и оценить константы прочности связи с целевыми белками-мишенями, рассчитать термодинамический спектр его активности. Определить ключевые дозы, при которых происходит насыщение основной целевой мишени.
-
Провести структурный анализ катион-хлорных транспортеров, оценив первичные структуры этих белков с учетом влияния специфической сольватации на ключевые функциональные группы. Определить возможные точки взаимодействия фуросемида и ключевых фрагментов белков, рассчитать термодинамические параметры комплексообразования «лиганд-мишень».
-
Построить молекулярную модель комплесообразования диуретика с NKCC2–транспортером на основе полученных данных квантово-химических расчетов фуросемида и структурного анализа первичной структуры катион-хлорного транспортера.
-
Изучить свойства молекулы фуросемида при различных значениях рН среды и в эксперименте оценить его диуретическую и салуретическую активность на фоне различных значений кислотности мочи.
-
Оценить роль карбоксильной группы в структуре фуросемида в обеспечении его диуретической и салуретической активности.
-
Изучить роль пространственного строения молекулы фуросемида, его геометрию и подвижность структуры в обеспечении его диуретической и салуретической активности.
-
Изучить роль гидрофобного сегмента в обеспечении диуретической и салуретической активности фуросемида.
-
Спроектировать новое производное сульфонилбензойной кислоты с большей специфической активностью и сохранением селективности к целевой мишени.
Научная новизна работы. Основное значение работы заключается в разработке новой технологии проектирования лекарственных веществ и определения величины их специфической активности включающий возможность моделирования взаимодействий в системе «лиганд-мишень», количественно связанных с фармакологическими эффектами. А также установлении взаимосвязи электронного и пространственного строения молекулы фуросемида с его фармакологической активностью, выявлении роли ключевых фрагментов молекулы в реализации его диуретической и салуретической активности.
В работе было использовано оригинальное авторское программное обеспечение.
Впервые детально показано различие в диуретической активности молекулярной и ионной форм фуросемида, а так же влияние на нее различных значений рН мочи. Установлено, что именно молекулярная форма диуретика обладает высокой мочегонной активностью.
Впервые показана ключевая роль карбоксильной группы в молекуле фуросемида в обеспечении прочности комплекса «лиганд-мишень» с катион-хлорным транспортером, что вносит основной вклад в диуретическую активность данного соединения.
Впервые показано, что геометрия молекулы фуросемида определяет активность препарата наряду с ключевыми функциональными группами. Изменение пространственного строения молекулы с разрывом внутримолекулярной водородной связи полностью лишает препарат диуретической активности.
Впервые установлено, что фурановый цикл в структуре фуросемида является ключевым гидрофобным сегментом, значительно определяющим активность и селективность молекулы диуретика.
Наряду с этим, выявленные закономерности позволили спроектировать и синтезировать новое производное сульфонилбензойной кислоты с большей диуретической и салуретической активностью, обладающей аналогичным механизмом действия.
Выполненная работа не только предлагает новую технологию для проектирования новых лекарственных веществ и оценки величины их специфической активности и расширяет фармакологическую характеристику фуросемида, показывая связь между химическим строением препарата и его биологическим действием, но несет информацию фундаментального характера. Эти данные существенно расширяют границы нашего понимания природы биологической активности не только изученного диуретика, но и, возможно, целого ряда лекарственных веществ и эндогенных лигандов, имеющих своем электронном строении схожий с фуросемидом набор ключевых фрагментов.
Научно-практическая значимость работы. Практическая значимость работы определяется необходимостью разработки новых вычислительных технологий для целенаправленного синтеза лекарственных средств, а также широким применением фуросемида в клинической практике для лечения большого числа заболеваний, а так же важностью электролитного транспорта в организме, в регуляцию которого вмешиваются петлевые диуретики.
С учетом того, что в работе на практике был применен новый подход к изучению зависимостей «структура-активность», основанный на расчете ключевых термодинамических параметров межмолекулярного взаимодействия лигандов и мишеней в водной среде, можно предположить перспективность применения разработанного метода для дальнейшего углубленного изучения существующих лекарственных веществ, предсказания биологической активности при проектировании новых лекарств, оценки активности при модификации лекарств с целью улучшения их фармакологических характеристик. Использованный в работе метод позволяет радикально изменить подход к разработке новых диуретиков, уменьшив число вариантов модификаций молекул и исключив потенциально неактивные структуры.
Проведенное сравнительное исследование активности фуросемида при различных значениях рН мочи указало на необходимость учитывать этот параметр у пациентов при назначении фуросемида и его аналогов и показало перспективу создания комбинированных средств этого препарата с веществами, способными подкислять мочу с целью модулирования активности диуретика. Такая комбинация позволяет не только снизить терапевтическую дозу препарата, а вместе с тем и выраженность побочных эффектов, но и позволяет использовать подкислитель для профилактики развития фосфатурии. Кроме того, появляется возможность объяснить ряд клинических наблюдений, касающихся различий в эффективности препарата с точки зрения выявленной зависимости его активности от рН мочи.
Спроектированное и синтезированное в ходе исследования новое производное сульфонилбензойной кислоты с улучшенными фармакологическими характеристиками свидетельствует о том, что предложенный оригинальный авторский алгоритм дает возможность отойти от господствующего до сегодняшнего дня метода тотального скрининга, и вплотную подойти к целенаправленному проектированию и синтезу высокоактивных и селективных лекарственных веществ, что при дальнейшей разработке позволит значительно сократить стоимость исследований и сократить путь от набора соединений к целевому лекарственному препарату.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Разработана и экспериментально обоснована новая оригинальная технология проектирования лекарственных веществ и оценки величины их специфической активности.
-
Молекула фуросемида в своем электронном строении содержит несколько полярных функциональных групп, среди которых только карбоксильная группа способна увеличивать прочность комплекса с белковой мишенью посредством образования прочной водородной связи с глутаминовой или аспарагиновой кислотами. Остальные полярные группы способны определять только селективность препарата и поддерживать его растворимость в воде.
-
Все белки семейства катион-хорных транспортеров во 2, 3 и 4 суперфициальных петлях содержат глутаминовую и аспарагиновую кислоты, которые способны образовывать прочные комплексы с карбоксильной группой молекулярной формы фуросемида.
-
Пространственное строение фуросемида и его мочегонная активность в значительной степени зависит о наличия в его структуре внутримолекулярной водородной связи между кислородом карбоксильной группы и водородом аминогруппы.
-
Диуретическая и салуретическая активность фуросемида прямо зависит от величины рН мочи. Только молекулярная форма фуросемида обладает значимой мочегонной активностью. Понижение значений рН мочи увеличивает концентрацию молекулярной формы диуретика в просвете канальца, что открывает перспективу применения фуросемида в комбинации с веществами, подкисляющими мочу. Это позволяет существенно снизить дозу препарата и выраженность его побочных эффектов.
-
Рациональное увеличение площади гидрофобного сегмента молекулы фуросемида существенно увеличивает его диуретическую и салуретическую активность, не меняя при этом селективность препарата в отношении основной целевой мишени.
Материалы внедрения.
Результаты диссертационной работы включены в монографию А.А. Бондарев, И.В. Смирнова, В.В. Удута «Термодинамические основы фармакодинамики».
Получен патент РФ на изобретение (№2416404) «Средство, обладающее мочегонным действием».
Результаты данного исследования, касающиеся закономерностей фармакологической активности и молекулярного механизма действия фуросемида и его производных внедрены в учебный процесс и НИР в ГБОУ Новосибирский государственный медицинский университет, в ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет, в ГБОУ ВПО Алтайский государственный медицинский университет, в ГБОУ ВПО Томский политехнический университет в преподавании органической химии и технологии органического синтеза.
Апробация материалов диссертационной работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на: VI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2005); президиуме СО РАМН (Новосибирск, 2006); 4-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» (Томск, 2006); международной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология» (Томск, 2006); VIII конгрессе молодых ученых и специалистов. «Науки о человеке». (Томск, 2007); III съезде фармакологов России «Фармакология — практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007); конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007); XI научно-практической конференции «Молодежь-Барнаулу» (Барнаул, 2009); научно-практической конференция посвященной 35-летию фармацевтического факультета АГМУ (Барнаул, 2010); I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «СИБИРСКИЙ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС» (Барнаул, 2011); ежегодных научных семинарах кафедры органической химии и технологии органического синтеза ГОУ ВПО ТПУ (Томск, 2005-2011 гг.).
Связь задач исследований с проблемным планом медицинских наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» (№ гос. регистрации 01200600351).
Синтез производных фуросемида и доказательство их строения осуществлялись совместно с лабораторией кафедры органической химии и технологии органического синтеза ГОУ ВПО ТПУ под руководством профессора В.Д. Филимонова.
Публикации. Основные положения диссертации отражены в 32 научных работах, в том числе в 1 монографии, 1 патенте РФ на изобретение, 14 статьях в журналах, рекомендованных ВАК РФ для диссертаций на соискание ученой степени доктора наук.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 287 страницах (включая приложения) машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 7 глав, содержащих результаты собственных исследований, обсуждения результатов, общих выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 145 отечественных и 158 иностранных источников и приложений. Работа иллюстрирована 50 рисунками и 35 таблицами.
Катион-хлорные транспортеры — как биологические мишени петлевых диуретиков и их роль в водно-электролитном гомеостазе
В 1959 г. в лабораториях фирмы «Hoechst» был синтезирован фуросемид, применение которого в клинике началось спустя 5 лет, в 1964 году. Следует отметить, что первый петлевой диуретик этакриновую кислоту синтезировали раньше, чем фуросемид, однако работы над этим препаратом были приостановлены в связи с признанием приоритетными исследований по совершенствованию тиазидов. По химическому строению фуросемид является 5-(аминосульфонил)-4-хлор-2[(2-фуранилметил)] аминобензойной кислотой. Белый кристаллический порошок, нерастворимый в воде [117].
Сразу же после синтеза фуросемида были проведены широкомасштабные исследования по его фармакологии. Вопросы молекулярного механизма действия и фармакологической активности полученного соединения интересовали многих авторов [93,45,48,51]. Накоплена масса данных об особенностях его фармакологической активности в различных органах и системах [56,75,86,87]. Многие ученые существенно приблизились к пониманию закономерностей реализации его эффектов [72], однако почти полвека этот вопрос остается актуальным предметом изучения теперь уже на более высоком методическом уровне. Не смотря на появление в последние годы таких препаратов как буметанид, торасминд, пиретанид, фуросемид с 1964 года остается самым широко применяемым препаратом этой группы мочегонных средств. Его лидирующие позиции на рынке мочегонных препаратов обусловлены не только его фармакологическими характеристиками, но и доступностью для большинства пациентов. Стоимость упаковки таблеток фуросемида в 30-35 раз ниже стоимости таблеток торасемида. Среди диуретических препаратов популярность применения фуросемида можно оценить даже по количеству наименований препаратов-генериков. Их начситывается более тридцати.
На сегодняшний день диуретики являются одной из самых широко применяемых групп лекарственных средств в лечении как острых состояний так и целого ряда хронических заболеваний [35,33]. Многие диуретические средства входят в состав комплексных препаратов для лечения различных сочетанных заболеваний. В большинстве случаев эта группа веществ используется для выведения из организма солей и воды, однако, в последнее время врачи стали широко использовать внепочечные эффекты диуретиков на организм [52]. Широко применяются комбинации фуросемида с другими диуретиками: лазилактон (фуросемид и верошпирон), фрусемен (фуросемид и триамтерен) и препаратами других фармакологических групп, как правило, с гипотензивными средствами. Последние комбинации обоснованы сочетанием в них двух непрямых синергистов для снижения артериального давления крови. Это сочетание позволяет снизить эффективную дозу каждого компонента, тем самым выраженность побочного действия лекарственных веществ [70,71,74].
Часто эта группа препаратов применяется для лечения ряда онкологических заболеваний, нервных и психических нарушений, глаукомы, бронхо-легочного синдрома, бронхиальной астмы, муковисцедоза, воспалительных процессов, в целях профилактики острой горной болезни и синдрома ночного апное [52].
Основными показания для назначения фуросемида являются: отечный синдром различного генеза (при хронической сердечной недостаточности ІІБ-ІІІ стадий, циррозе печени - синдроме портальной гипертензии, отечно-асцитическом синдроме, нефротическом синдроме); почечная недостаточность, нефротический синдром, выраженная гипернатриемия, гиперкальциемия и гипермагниемия; острая л евожел уд очковая недостаточность (сердечная астма, отек легких); отек мозга; артериальная гипертония, в том числе некоторые формы гипертонического криза [52,37,36]. Такой список показаний и сегодня ставит группу петлевых диуретиков, фуросемид, в частности, в разряд наиболее актуальных объектов для различных медико-биологических исследований. Механизм действия фуросемида связан с блокадой реабсорбции ионов хлора и натрия в восходящем колене пегли Генле. Нараду с этим, он увеличивает экскрецию калия, кальция, магния. Препарат воздействует и на извитые канальцы, причем этот эффект не связан с ингибированием карбоангидразы или антиальдостероновой активностью. При этом, проявляется выраженное диуретическое, натрийуретическое, хлоруретическое действие препарата [34,73,76]. Фуросемид является веществом кислотного характера, которое прочно связывается с анионным центром альбуминов, но незначительно связывается с белками тканей. Вследствие этого, фуросемид имеет низкий объем распределения общего количества препарата в устойчивом состоянии, который меньше чем внеклеточный объем жидкости. С уменьшением конценграции альбуминов в плазме уменьшается степень связывания препарата с белками. Элиминация фуросемида частично осуществляется в неизмененном виде через почки (секрецией в канальцы) и частично внепочечными путями. Известно, что у собак глюкуронидация происходит в экстрапеченочных структурах. Заболевания печени не влияют на результирующую внепочечную элиминацию. Есгь сообщения об активной секреции фуросемида в кишечник. У фуросемида известно два метаболита -глюкуронид фуросемида и салюамин [80]. Первый является общепринятым метаболитом, в то время как статус второго как метаболита остается пока спорным. Пресистемный метаболизм фуросемида осуществляется в кишечнике, и его клиренс осуществляется главным образом в почках, хотя другие органы, такие как легкие и печень тоже принимают участие в этом процессе.
Экспериментальные химические исследования
Для сравнительного исследования диуретической активности фуросемида и его производных исследуемые вещества вводили однократно подкожно в 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия. В качестве контроля подкожно вводили 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Через сутки после введения контрольного раствора собирали суточную мочу, измеряли величину диуреза и концентрацию в ней ионов натрия и калия. Полученные результаты считали контрольной величиной выделительной функции почек. Через сутки после контрольного введения подкожно вводили модифицированные производные фуросемида в дозах 5, 10 и 50 мг/кг для определения наличия у полученных веществ диуретической и салуретической активности. После введения производных фуросемида и оценки изменений функции почек животных оставляли под наблюдением до момента восстановления контрольных величин суточного диуреза и экскреции ионов натрия и калия. Затем вводили фуросемид в дозе 5 мг/кг для оценки его мочегонной активности в данной группе крыс. В опытах с применением йод-фуросемида участвовало две группы животных. Первая группа - контрольная, получала фуросемид в дозе 15 мкмоль/кг. Вторая группа получала йод-фуросемид в эквимолярной фуросемиду дозе (15 мкмоль/кг) для оценки диуретической и салуретической активности.
Сравнительное исследование диуретической активности фуросемида при различных значениях рН мочи.
Для сравнительного исследования диуретической активности фуросемида при различных значениях рН мочи было сформировано 4 группы животных по 12 крыс мужского пола. У животных после семидневной выдержки в индивидуальных клетках на стандартной диете собирали мочу и проводили измерение ее рН. В течение последующих семи дней внутрижелудочно с помощью зонда животные получали: контрольная группа — 3 мл чистой водопроводной воды; первая опытная группа 3 мл 5% раствора гидрокарбоната натрия с целью подщелачивания мочи. Известно, что гидрокарбонат натрия применяется как подщелачеватель мочи при лечении мочекаменной болезни у людей [2,60,116]; вторая опытная группа - 3 мл 5% раствора DL-метионина с целью подкисления мочи. Известно, что DL-метионин способствует подкислению мочи и поддержанию рН мочи на физиологическом уровне 6.0 - 6.5, что снижает риск формирования камней в мочевом пузыре [28]; третья опытная группа - 3 мл 5% раствора аскорбиновой кислоты с целью подкисления мочи. Аскорбиновая кислота применяется для подкисления мочи при лечении мочекаменной болезни у животных [63,4,82]. Опытные группы также выдерживались на стандартной диете. После семидневной выдержки в индивидуальных клетках собирали мочу и проводили измерение ее рН. Далее животным опытных групп в качестве контроля вводили подкожно 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия. После определения фоновых значений величины суточного диуреза и экскреции ионов натрия и калия однократно подкожно в 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия вводили фуросемид в дозе 2 мг/кг. Величину суточного диуреза и экскреции ионов натрия и калия определяли через сутки после введения препарата.
Исследование закономерностей взаимоотношения «ДОЗА-ЭФФЕКТ» для фуросемида у крыс. Исследование проведено в осенний период на крысах-самцах. Животные находились в индивидуальных клетках, приспособленных для сбора мочи. В контроле крысам однократно подкожно вводили 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Фуросемид вводили подкожно в 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия последовательно в дозах 0,5, 1, 2, 5, 10, 20 мг/кг. Через сутки после введения очередной дозы производили сбор суточной мочи, измеряя величину диуреза, экскрецию ионов натрия, калия, хлора и креатинина. После введения очередной дозы фуросемида животные выдерживались в клетках вплоть до возвращения оцениваемых показателей до исходных величин. В таком ритме все 6 доз фуросемида были введены в течение 2-х месяцев эксперимента.
Величину диуреза измеряли мерным цилиндром с ценой деления шкалы 0,1 мл. Концентрацию ионов натрия и калия в моче определяли методом фотометрии на пламенном автоматизированном фотометре ПАЖ-3 (Россия). В основе метода лежит измерение оптической плотности пламени, которая изменяется при сгорании некоторых веществ, в том числе ионов натрия и калия. Калибровку прибора осуществляли последовательным введением стандартных растворов ионов Na и К+ в концентрации 500 мг/л, 250 мг/л, 100 мг/л, 50 мг/л. Исследуемые образцы мочи перед измерением разводили дистиллированной водой. Разведение для определения натрия варьировало в ходе эксперимента от 2 до 10 раз, что было обусловлено изменением экскреции электролита. Разведение на калий было постоянным - в 50 раз. Экскрецию натрия с мочой рассчитывали по формуле: г_ДхРхА Mr где Е - экскреция ионов натрия в микромолях; Д - величина диуреза; Р - разведение; А - показание прибора; Mr- молярная масса определяемого иона; Определение рН мочи осуществлялось при помощи ионометра И-130 (Россия). Хлориды определяли колориметрическим методом при помощи диагностического набора (ООО «Витал Диагностике СПб», Россия) на фотоколориметре КФК-3-01 (Россия) при длине волны 492 нм. Метод основан на колориметрическом определении концентрации роданида железа (III). Хлорид-ионы в кислой среде высвобождают из роданида ртути (II) ионы роданида, которые образуют окрашенный продукт с ионами железа (III). Интенсивность окраски образовавшегося роданида железа (III) прямо пропорциональна концентрации хлорид-ионов в пробе. Концентрацию хлоридов (С) в пробе в ммоль/л рассчитывали по формуле: С = — хЮО; где Е — оптическая плотность опытного раствора, Ек — оптическая плотность калибровочного раствора, 100 — концентрация хлоридов в калибраторе, ммоль/л.
Метод определения клубочковой фильтрации (эффективного почечного кровотока). Концентрацию креатинина определяли псевдокинетическим колориметрическим методом по реакции Яффе при помощи диагностического набора «КРЕАТИНИН-12-ВИТАЛ» (ООО «Витал Диагностике Спб», Россия) на фотоколориметре КФК-3-01 (Россия) при длине волны (490-510) нм. Определение креатинина основано на реакции Яффе и принципе Слота: последовательном фотометрическом измерении в щелочной и кислой среде окрашенных продуктов реакции, образующихся при взаимодействии исседуемого образца с пикриновой кислотой. Разность в интенсивности окраски в щелочной и кислой среде прямо пропорциональна концентрации
Анализ первичной структуры катион-хлорных транспортеров как белков-мишеней для действия фуросемида
Известно, что при образовании комплекса диуретик-транспортер, молекулы препарата связываются с экстрацеллюлярной частью макромолекулы транспортера. По данным литературы экстрацеллюлярная часть представлена шестью суперфициальными петлями различной длины. В литературе встречаются неоднозначные данные об участии суперфициальных петель в связывании диуретиков. В NKCC і ответственный за аффинитет к катионам трансмембранный домен ТМ2, к хлору - ТМ4-ТМ7. Фуросемид взаимодействует с ТМ2-ТМ7 и ТМ11-ТМ12 [260], где, как известно, происходит связывание второго иона хлора и полная активация котранспортёра [234]. Связывание диуретика является обратимым, так как повышение концентрации хлора в среде снижает эффективность действия препарата на NKCC [254]. Важным фактом для нашей работы является наличие более высокого аффинитета буметанида к NKCC и существенно меньшего к группе транспортеров КСС. Поскольку выявлено, что концентрация буметанида 10М и меньше является специфичной в отношении NKCC, в то время как в более высоких концентрациях этот диуретик может ингибировать работу КСС и хлорных каналов [178,214,230]. Следует отметить, что в отличии от буметанида, фуросемид в концентрациях 10"3 -10" М, которые блокируют активность NKCC, также значительно ингибирует работу NCC и КСС транспортёров [276]. Это обстоятельство свидетельствует о меньшей селективности препарата к целевой мишени. Фуросемид в концентрации 2 Мм ингибирует транспортную активность КСС(у кроликов) и КССз (у мышей) на 81% и 69% соответственно [188,258].
В результате проведения структурно-функционального анализа химер sNKCCi и huNKCCi ученые выделили 3 области (ТМ 2,4,7) ответственные за кинетические различия между видами транспортеров. Есть данные о том, что кинетика катионного транспорта зависит от изменений аминокислот в ТМ2, а аффинитет к хлору и натрию не зависит от входа 86Rb+ при различных вариантах аминокислотной последовательности [184]. Гликозилирование существенно затрудняет доступ тиазидовых диуретиков к местам их связывания в молекуле протеина. Трансмембранная часть ответственна за связывание и перенос ионов, в то время как концевые части, возможно, обеспечивают его взаимодействие с такими внутриклеточными структурами как цитоскелет и вторичными посредниками [185]. NKCC имеет две изоформы: NKCCi и ЫКССг- NKCCi присутствует во всех типах клеток млекопитающих [211]. NKCC2 локализуется исключительно в почках, точнее в толстом сегменте восходящего отдела петли Генле и в юкстагломерулярной зоне [257]. Изоформы NKCC очень сходны по молекулярной структуре полипептида (до 70%). Следует заметить, что участки связывания ионов и взаимодействия с буметанидом и фуросемидом практически идентичны между NKCCi И NKCC2. В данной работе это обстоятельство позволило предположить наличие также сходства в энергетике процесса взаимодействия диуретика и белка-мишени. Гомология в структуре изоформ между различными организмами также высокая и составляет до 65-80% [229], что позволило считать в исследовании первичных структур белков в отношении влияния диуретиков условно одинаковыми транспортеры различных видов млекопитающих. И в процессе исследования в одной сравнительной таблице оперировать первичными структурами мыши, крысы и человека.
Поскольку кроме NKCC? в почках млекопитающих по всему нефрону и в клубочке еще расположены КСС транспортеры, сравнительной характеристике аминокислотного состава подвергались и эти представители семейства. КСС находится в проксимальных канальцах, тонкой восходящей петле, дистальных извитых канальцах и в кортикальных собирающих протоках.
Молекулярный механизм работы NKCC2 реализуется следующим образом: в толстом сегменте восходящего отдела петли Генле он осуществляет внутриклеточный вход натрия и калий выходит обратно в полость петли через калиевые каналы [283]. Так достигается снижение осмотичности первичной мочи и стимулируется транспорт воды в паренхиму почек, а оттуда - в сосуды. К тому же NKCC переносит ионы хлора в клетку через апикальную мембрану. Далее ионы хлора выходят из клетки через базолатеральную мембрану посредством простой диффузии через хлорные каналы или через специализированный переносчик [191]. Именно этот комплекс процессов и нарушается при образовании прочного комплекса с петлевыми диуретиками. [190,196, 216].
Нами были исследованы первичные последовательности белков NKCC,, NKCC2, NCC, KCQ, KCC2, КССз, КСС4, опубликованные в Национальном центре биотехнологической информации (США) [248] на наличие в них аминокислот, способных образовывать прочные водородные связи с молекулами диуретиков. Такими аминокислотами, как было показано в 3 главе, являются глутаминовая кислота (Glu), аспарагиновая кислота (Asp), гистидин (His), треонин (Thr). В пептидных цепочках на наличие данных аминокислот исследовались все трансмембранные домены и суперфициальные петли между ними. Внутриклеточные фрагменты не брались в расчет в связи с тем, что диуретики с транспортером взаимодействуют экстрацеллюлярно или, возможно, трансмембранно. Более точной информации в литературе не было обнаружено.
Сравнительное экспериментальное исследование диуретической активности фуросемида и его этилового эфира
Как видно из таблицы 26, соотношение экскреции ионов и выделения воды из организма у сравниваемых веществ не имело существенных отличий при применении фуросемида и йод-фуросемида, что свидетельствует об однонаправленном влиянии веществ на транспорт ионов натрия, калия и хлоридов. Это позволяет предположить, что введение атома йода в молекулу фуросемида не повлияло на селективность вновь полученного соединения.
Как уже было сказано ранее, прочность комплекса «лиганд-мишень» в водной среде может обеспечивать два основных механизма: 1) полярная функциональная группа, способная в водной среде к образованию водородной связи с полярными группами белка-мишени, замещая молекулы воды в сольватационной оболочке; 2) гидрофобный эффект от взаимодействия гидрофобных фрагментов молекулы препарата и белка мишени. Это взаимодействие подчиняется ряду известных закономерностей. Чем больше площадь взаимодействия гидрофобных сегментов препарата и белка, тем прочнее образующийся между ними комплекс. Чем выше константа прочности образовавшегося комплекса, тем прочнее связь и, соответственно, сильнее и длительнее эффект. Представленные в предыдущих главах результаты показали, что в молекуле фуросемида ключевую роль в обеспечении прочности комплекса играет карбоксильная группа. Сульфаниламидная группа и аминогруппа более прочные комплексы образуют с молекулой воды и, следовательно, не могут увеличивать активность молекулы. Очевидно, роль последних заключается в обеспечении относительно высокой растворимости вещества воде.
Проведенное нами сравнительное исследование показало, что новое производное сульфанилбензойной кислоты йод-фуросемид обладает более выраженным диуретическим и салуретическим действием в сравнении с фуросемидом у крыс. Поскольку атом йода является гидрофобным и не может взаимодействовать с полярными функциональными группами катион-хлорных транспортеров в почечных канальцах, его роль в повышении активности препарата, вероятно, заключается в увеличении площади гидрофобного сегмента молекулы. Это, в свою очередь, позволяет молекулам образовывать более прочные комплексы и либо в меньшей концентрации блокировать то же число катион-хлорных транспортеров, либо в той же эквимолярной дозе блокировать большее число транспортеров, чем молекулы фуросемида. Наряду с этим, практически идентичные соотношения салуретического и диуретического эффектов исследуемых веществ позволяют с большой долей вероятности предположить, что оба диуретика взаимодействуют с одним и тем же типом белков-мишеней в почечных канальцах, проявляя идентичный механизм диуретического действия, который отличается лишь количественно. Этому не следует удивляться, имея в виду, что более активные петлевые диуретики буметанид и пиретанид, также блокирующие катион-хлорные транспортеры, имеют в своем электронном строении большую чем у фуросемида площадь гидрофобного сегмента при аналогичном наборе полярных функциональных групп и сходной пространственной геометрии молекулы [157,158,159,160,207]. Таким образом, более выраженное по сравнению с фуросемидом диуретическое и салуретическое действие йод-фуросемида указывает на то, что при поиске новых мочегонных средств с большей активностью, наряду с включением высокоактивных полярных групп для повышения прочности комплекса «лиганд-мишень», целесообразно учитывать наличие адекватного гидрофобного эффекта. При этом нельзя исключать то, что введение в молекулу комплементарной полярной группы может увеличить активность модифицируемого соединения в десятки раз. А модификация гидрофобного сегмента за счет значительно более низкой энергетики взаимодействия позволяет более плавно повышать активность вещества, что может иметь практическое значение.
С целью сравнения гидрофобных свойств исследуемых веществ, мы изучили их адсорбцию на активированном угле. Адсорбцию проводили при различных концентрациях веществ и при фиксированном содержании адсорбента. Для полученных значений были рассчитаны и построены изотермы адсорбции (рисунок 38), с учетом одинаково числа мишеней, то есть равных Гсо. Для этих уравнений Г„,=0,477 и константа адсорбции для фуросемида Кф=0,0636, для йод-фуросемида Кйод-ф=0,0908. Суммарное среднеквадратичное отклонение для изотерм адсорбции Id =0.00011. Константа адсорбции для йод-фуросемида больше константы адсорбции фуросемида в 1,43 раза. С учетом близости электронного и пространственного строения, увеличение адсорбционных свойств может быть связано с увеличением гидрофобности молекулы, то есть с увеличением поверхностной активности.
Проведенное нами сравнительное исследование показало, что новое производное сульфанилбензойной кислоты - йод-фуросемид обладает более выраженным диуретическим и салуретическим действием в сравнении с фуросемидом у крыс. Поскольку атом йода не может образовать водородные связи с полярными функциональными группами катион-хлорных транспортеров в почечных канальцах, его роль в повышении активности препарата, вероятно, заключается в увеличении площади гидрофобного сегмента молекулы. Это, в свою очередь, позволяет молекулам образовывать более прочные комплексы с белками-мишенями, либо в меньшей дозе блокировать то же число катион-хлорных транспортеров. Наряду с этим, соотношение салуретического и диуретического эффектов исследуемых веществ позволяет с большой долей вероятности предполагать, что оба диуретика взаимодействуют с одним и тем же типом белков-мишеней в почечных канальцах, проявляя идентичный механизм диуретического действия, который отличается лишь количественно. Следует заметить, что аналогично йод-фуросемиду, более активные петлевые диуретики буметанид и пиретанид, также блокирующие катион-хлорные транспортеры, имеют в своем строении большую чем у фуросемида площадь гидрофобного сегмента при аналогичном наборе полярных функциональных групп и сходной пространственной геометрии молекулы.
