Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 10
1.1 Современные представления о боли и нестероидных противовоспалительных
препаратах 10
1.2 Современные представления о производных тиадиазола 23
1.2.1 Особенности химической структуры производных тиадиазола 23
1.2.2 Ингибиторы карбоангидразы из группы производных тиадиазола 27
1.2.3 Противомикробные и противогрибковые средства из группы производных тиадиазола 33
1.2.4 Противовоспалительные и обезболивающие средства из группы производных тиадиазола 37
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 43
2.1 Материалы исследования 43
2.2 Методы исследования 47
2.2.1. Оценка острой токсичности новых производных тиадиазола 47
2.2.2 Оценка ульцерогенности новых производных тиадиазола 49
2.2.3 Оценка обезболивающей активности новых производных тиадиазола в тесте горячей пластины у мышей 49
2.2.4 Оценка обезболивающей активности новых производных тиадиазола на модели химического раздражения брюшины у крыс 50
2.2.5 Оценка противовоспалительной активности новых производных тиадиазола на модели острого экссудативного воспаления у крыс 52
2.2.6 Оценка противоаллергической активности на модели активной кожной анафилаксии у мышей 53
2.2.7 Оценка жаропонижающей активности новых производных тиадиазола 54
2.2.8 Статистические методы анализа 55
Глава 3 Оценка острой токсичности и ульцерогенности новых производных тиадиазола 56
3.1 Оценка острой токсичности новых производных тиадиазола 56
3.2 Оценка ульцерогенной активности производных тиадиазола 62
ГЛАВА 4 Оценка обезболивающей, противовоспалительной, противоаллергической и жаропонижающей активности новых производных тиадиазола 71
4.1 Оценка обезболивающей активности новых производных тиадиазола в тесте горячей пластины у мышей 71
4.2 Исследование обезболивающей активности новых производных тиадиазола на модели химического раздражения брюшины . 74
4.3 Исследование противовоспалительной активности новых производных тиадиазола. 75
4.4 Исследование противоаллергической активности производных тиадиазола на модели активной кожной анафилаксии у мышей. 77
4.5 Оценка жаропонижающей активности новых производных тиадиазола 81
ГЛАВА 5 Обсуждение результатов исследования 84
Выводы 98
Научно - практические рекомендации 99
Список использованных сокращений 99
Список литературы 100
- Особенности химической структуры производных тиадиазола
- Противовоспалительные и обезболивающие средства из группы производных тиадиазола
- Оценка обезболивающей активности новых производных тиадиазола на модели химического раздражения брюшины у крыс
- Исследование обезболивающей активности новых производных тиадиазола на модели химического раздражения брюшины
Особенности химической структуры производных тиадиазола
Актуальной проблемой современной медицины является повышение эффективности лечения пациентов с болевым синдромом.
Боль представляет собой неприятное ощущение и эмоциональное переживание, формирующееся в центральной нервной системе и связанное с действительным или возможным повреждением тканей или описываемое в терминах такого (IASP). Боль всегда носит субъективный характер, причем выраженность неприятных ощущений не имеет прямой причинно-следственной связи с объемом повреждения тканей, то есть только по выраженности боли не всегда можно судить о серьезности состояния больного [50, 60].
Общеизвестно, что боль является наиболее частым симптомом, сигнализирующим о повреждении тканей, внутренних органов и его устранение обычно сопровождается исчезновением боли. Вместе с тем в практике нередко отмечаются ситуации, при которых идентификация и устранение причины повреждения тканей не приводит к исчезновению боли. Боль из симптома, выполняющего физиологическую сигнальную функцию, трансформируется в патогенный фактор, не только вызывающий неприятные ощущения и эмоциональные переживания, но и нарушающий функцию многих органов и систем. В этих случаях речь идет о хронической боли.
В основе формирования боли лежат различные патогенетические механизмы, определяющие тип боли: ноцицептивная, невропатическая, психогенная, смешанная.
Острая боль часто носит защитный характер, предупреждая об опасности для организма человека. Как правило, острая боль имеет ноцицептивный характер, связана с активацией болевых рецепторов, соответствует степени тканевого повреждения и длительности действия повреждающих факторов. Ноцицептивные болевые синдромы возникают в результате активации ноцицепторов при травме, воспалении, ишемии, чрезмерном растяжении тканей. Хроническая боль нередко носит невропатический характер. Согласно определению экспертов Международной ассоциации по изучению боли (IASP) к невропатической боли относят боль, возникающую вследствие первичного повреждения или дисфункции нервной системы (IASP Press, Seattle, 1994). Клинически невропатическая боль характеризуется комбинацией так называемых негативных и позитивных симптомов. Согласно современным представлениям под невропатической болью понимают боль, возникающую вследствие прямого повреждения или болезни соматосенсорной системы (NeuPSIG of IASP – Eur. J. Pain, 2007). Клинически это проявляется частичной или полной потерей чувствительности (в том числе и болевой) с одновременным возникновением в зоне иннервации поврежденного участка периферической или центральной нервной системы неприятных, зачастую ярко выраженных болевых ощущений.
В основе развития первичной гипералгезии лежит феномен сенситизации ноцицепторов (повышение чувствительности ноцицепторов к действию повреждающих стимулов) [80]. Симптомы первичной гипералгезии могут быть обнаружены не только в коже, но и в мышцах, суставах, костях и внутренних органах [50].
Вторичная гипералгезия возникает в результате повышения возбудимости ноцицептивных нейронов в структурах ЦНС (центральная сенситизация). Патофизиологической основой сенситизации ноцицептивных нейронов дорсальных рогов спинного мозга является длительное деполяризующее влияние глутамата и нейрокининов, выделяющихся из центральных терминалей ноцицептивных афферентов вследствие интенсивной постоянной импульсации, идущей из зоны поврежденных тканей [43]. Причинами повреждения периферической нервной системы могут быть нарушение углеводного обмена при сахарном диабете, авитаминозы, травмы нервов, интоксикации, инфекции (герпес зостер) и онкологические заболевания. Наиболее частыми причинами повреждения структур ЦНС являются травмы спинного и головного мозга, инсульты, демиелинизирующие заболевания (рассеянный склероз) и сирингомиелия.
Психогенная боль возникает вне зависимости от соматических, висцеральных или нейрональных повреждений и в большей степени определяется психологическими и социальными факторами. «В чистом виде» встречается редко, крайне трудна для диагностики, поскольку у пациента возможно одновременное наличие психических, скелетно-мышечных и других неврологических расстройств.
Хроническая боль наиболее часто носит смешанный характер, имея в своем патогенезе ноцицептивный, невропатический и психогенный компоненты.
По данным Европейского эпидемиологического исследования, частота хронических неонкологических болевых синдромов в странах Западной Европы составляет 20%, т. е. каждый 5-й взрослый европеец страдает хроническим болевым синдромом [43]. Проблема хронической неонкологической боли из-за большой распространенности и многообразия форм стала настолько важной, что во многих странах для лечения пациентов с острыми и хроническими болевыми синдромами были созданы специализированные противоболевые центры и клиники. Среди хронических болевых синдромов наибольшее распространение получили боль при заболевании суставов, боль в спине, головная боль, невропатическая боль [5, 69, 80].
Противовоспалительные и обезболивающие средства из группы производных тиадиазола
Значение LD50 для новых производных тиадиазола определяли при внутрибрюшинном введении мышам методом В.Б. Прозоровского и М.П. Прозоровской (1980) [61]. В опытах по оценке острой токсичности использовали белых неинбредных мышей обоего пола массой 20,1±0,9г.
Вещества, ЛХТ1-10 ЛХТ3-10, ЛХТ10-10, ЛХТ12-10, ЛХТ14-10 испытывали в дозах по 7, 14, 28, 56, 112 мг на мышь (соответственно 320, 640, 1280, 2560, 5120 мг/кг). Логарифмы значений этих доз отличались на 0,3. Исследуемые соединения в указанных дозах вводили подопытным животным однократно внутрибрюшино.
Общая продолжительность наблюдения за животными составила 14 дней. В первый день после введения препарата подопытные животные находились под непрерывным наблюдением. Регулярно фиксировали общее состояние животных, состояние шерстного покрова, потребление воды и пищи. В каждой группе учитывали число смертельных исходов в течение всего срока наблюдения. По результатам эксперимента рассчитывали значение LD50 по таблице «Средние эффективные дозы и их ошибки при разных последовательностях реакций и разных экспериментальных дозировках» [61].
Класс токсичности исследуемых соединений определяли методом И.В.Березовской (2003) [6] в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76 в зависимости от значения LD50 (таблица 2.2).
В дальнейших исследованиях все новые производные тиадиазола вводили подопытным животным в дозе 1/10-1/20 LD50. 2.2.2 Оценка ульцерогенности новых производных тиадиазола
Ульцерогенность новых производных тиадиазола оценивали при внутрижелудочном введении в течение 4-х дней (в виде водных суспензий с 1% слизью крахмала) крысам, лишенным пищи за 16 часов до опыта. На 5-й день животных забивали (под легким эфирным наркозом), извлекали желудки, рассекали их по малой кривизне и промывали в изотоническом растворе натрия хлорида для удаления содержимого. Проводили визуальную оценку состояния слизистой оболочки желудка с использованием лупы, определяя степень деструктивного поражения (количество кровоизлияний и эрозий на одно животное). Ульцерогенность новых соединений оценивали по значению индекса Паулса. Индекс Паулса (ИП) - интегральный показатель масштабов деструкции в желудке, определяли по формуле:
Кроме того, подсчитывали суммарную протяженность деструкций (точечных геморрагий, эрозий, полосовидных поражений) [66]. Макроскопическое морфологическое описание желудка подопытных крыс проводили в 6 сериях опытов: 1. Внутрижелудочное введение ЛХТыо в течение 4-х дней в дозе 41,3 мг/кг; 2. Внутрижелудочное введение ЛХТ3.10 в течение 4-х дней в дозе 41,4 мг/кг; 3. Внутрижелудочное введение ЛХТю-ю в течение 4-х дней в дозе 44,94 мг/кг; 4. Внутрижелудочное введение ЛХТ12.ю в течение 4-х дней в дозе 38,36 мг/кг; 5. Внутрижелудочное введение ЛХТм-ю в течение 4-х дней в дозе 41,36 мг/кг. 6. Внутрижелудочное введение индометацина (препарат сравнения) в течение 4-х дней в дозе 50 мг/кг. В каждой серии опытов использовали по 8 животных. 2.2.3 Оценка обезболивающей активности новых производных тиадиазола в тесте горячей пластины у мышей Скрининг обезболивающей активности новых производных 1,3,4 50 тиадиазола проводили с использованием модели горячей пластины у мышей [67]. Эксперименты выполнены с использованием белых неинбредных мышей обоего пола весом 20±2 г. Болевую реакцию вызывали помещением животного на горячую пластину температурой 55С, регистрировали наступление время порога болевой чувствительности (проявления признаков боли у подопытных животных – подпрыгивание, писк) [65].
Контроль – однократное внутрибрюшинное введение изотонического раствора натрия хлорида за 30 минут до помещения животного на «горячую пластинку»; 2. Однократное внутрибрюшинное введение диклофенака натрия в дозе 50 мг/кг (препарат сравнения) за 30 минут до помещения животного на горячую пластину; 3. Однократное внутрибрюшинное введение ЛХТ1-10 в дозе 44,9 мг/кг за 30 минут до помещения животного на горячую пластину; 4. Однократное внутрибрюшинное введение ЛХТ3-10 в дозе 45 мг/кг за 30 минут до помещения животного на горячую пластину; 5. Однократное внутрибрюшинное введение ЛХТ10-10 в дозе 48,9 мг/кг за 30 минут до помещения животного на горячую пластину; 6. Однократное внутрибрюшинное введение ЛХТ12-10 в дозе 41,7 мг/кг за 30 минут до помещения животного на горячую пластину; 7. Однократное внутрибрюшинное введение ЛХТ14-10 в дозе 44,9 мг/кг за 30 минут до помещения животного на горячую пластину. В каждой серии опытов использовали по 10 животных.
Оценка обезболивающей активности новых производных тиадиазола на модели химического раздражения брюшины у крыс Эксперименты по моделированию химического раздражения брюшины проводили на белых беспородных крысах массой 200±15 г. Болевую реакцию индуцировали внутрибрюшинным введением крысам уксусной кислоты в дозе 300 мг/кг. Наблюдение за подопытными животными проводили в течение 1 часа после введения уксусной кислоты. Крыс, у которых не возникала реакция корчения (характерные движения животных, включающие сокращения брюшных мышц, чередующиеся с их расслаблением, вытягиванием задних конечностей и прогибанием спины), в экспериментах не использовали. В дальнейших экспериментах использовали животных с положительной реакцией корчения.
Было отмечено, что при использовании уксусной кислоты в концентрации 3% положительная реакция корчения возникала у всех подопытных животных, тогда как при применении 1% раствора уксусной кислоты у отдельных подопытных животных реакция корчения отсутствовала. В связи с этим для моделирования химического раздражения брюшины использовали модифицированный метод с использованием 3% раствора уксусной кислоты [66]. Исследуемые соединения вводили подопытным крысам внутрибрюшинно за 30 минут до введения уксусной кислоты. Каждое подопытное животное помещали в стеклянный контейнер, регистрировали общее число приступов экстензорных судорог (корчей) в течение 1 часа. Оценку обезболивающей активности на модели химического раздражения брюшины у крыс проводили для новых производных тиадиазола, которые были наиболее эффективны при термическом болевом раздражении у мышей и обладали наименьшей ульцерогенностью. Проведено 4 серии опытов, в которых оценивали число специфических ноцицептивных реакций (корчей) при внутрибрюшинном введении уксусной кислоты: 1. Контроль – однократное внутрижелудочное введение изотонического раствора натрия хлорида за час до внутрибрюшинного введения уксусной кислоты; 2.
Оценка обезболивающей активности новых производных тиадиазола на модели химического раздражения брюшины у крыс
Учитывая тот факт, что нестероидные противовоспалительные средства наряду с обезболивающей активностью проявляют в различной степени выраженности противовоспалительный эффект, на следующем этапе экспериментального исследования изучали влияние новых производных тиадиазола на течение острого экссудативного воспаления у крыс.
Острое экссудативное воспаление у крыс вызывали субплантарным (под подошвенный апоневроз) введением 0,1 мл 2 % раствора формалина в заднюю правую лапу. Противовоспалительную активность исследуемых соединений оценивали в процентах угнетения отека. В качестве препарата сравнения использовали кетопрофен. Новые производные тиадиазола и кетопрофен вводили подопытным животным внутрижелудочно за 1 час до индукции отека формалином в дозе 1/20 LD50. Животные группы контроля получали изотонический раствор натрия хлорида.
Было выявлено, что при субплантарном введении раствора формалина у подопытных крыс развивается выраженный отек лапы, о чем свидетельствует достоверное увеличение ее объема. Отмечено, что максимальный отк лапы (пик воспаления) у животных группы контроля развивался через 2 часа после введения формалина, при этом объем лапы у подопытных крыс увеличивался в среднем на 26,5% (р 0,05). Следует отметить, что и через 24 часа после введения формалина объем лапы у подопытных животных контрольной группы был в среднем на 13,5% больше, чем до введения флогогенного фактора (таблица 4.3).
В сериях опытов с использованием кетопрофена (23 мг/кг) выраженность формалин-индуцированного отека лапы крыс была в среднем на 14% меньше, чем в контроле. Новые производные тиадиазола ЛХТ3-10 (20,7 мг/кг) и ЛХТ10-10 (19,2 мг/кг) при формалиновом отеке лапы у крыс действовали несколько слабее, чем кетопрофен (23 мг/кг). В сериях опытов с введением этих соединений выраженность воспалительной реакции была в среднем на 8% меньше, чем в контроле (у подопытных крыс с формалиновым отеком лапы, получавших изотонический раствор натрия хлорида). Достоверных различий в эффектах ЛХТ3-10 и ЛХТ10-10 при формалиновом отеке лапы у крыс обнаружено не было. Таблица 4. 3 – Выраженность формалинового отека лапы у крыс при внутрибрюшинном введении кетопрофена и новых производных тиадиазола
Исследование противоаллергической активности производных тиадиазола на модели активной кожной анафилаксии у мышей.
В связи с тем, что в патогенезе ряда воспалительных заболеваний существенное значение имеет аллергический компонент, при оценке фармакологической активности новых производных тиадиазола исследовали их эффекты при экспериментальных аллергических реакциях немедленного типа. Известно, что анафилаксия имеет не только общие, но и местные проявления. Местные проявления анафилаксии возникают в результате воздействия аллергена на ограниченные участки сенсибилизированных органов и тканей. Эти реакции могут возникать на коже, слизистых оболочках желудочно-кишечного тракта, носа, бронхиального дерева у иммунизированных организмов в условиях как активной, так и пассивной сенсибилизации. Наиболее применимой экспериментальной моделью местной анафилаксии является реакция активной кожной анафилаксии, возникающая при внутрикожном введении антигена сенсибилизированным животным.
Исследование влияния новых производных тиадиазола на развитие местной анафилактической реакции осуществляли на модели активной кожной анафилаксии у мышей. Подопытных животных сенсибилизировали овальбумином по описанной выше методике. В качестве препарата сравнения использовали глюкокортикостероид преднизолон (один из наиболее активных антианафилактических препаратов). Исследуемые соединения вводили внутрибрюшинно в дозе 1/20 LD 50 за 20 минут до внутрикожного введения аллергена.
Анализ результатов экспериментов по оценке противоаллергической активности показал, что производные тиадиазола ЛХТ3-10 и ЛХТ10-10 обладают способностью уменьшать выраженность реакции активной кожной анафилаксии у мышей. Было выявлено, что у подопытных мышей, сенсибилизированных овальбумином, при внутрикожном введении антигена (овальбумина) на 21-й день латентного периода сенсибилизации развивалась местная аллергическая реакция. Визуально кожная анафилаксия проявлялась окрашиванием участка кожи в синий цвет, что было связано с выходом красителя (Эванса синего) из кровеносного русла в очаг аллергического поражения в месте внутрикожного ведения аллергена. В контроле диаметр окрашенных участков кожи у всех подопытных мышей превышал 3 мм, что свидетельствовало о наличии высокого уровня сенсибилизации.
Исследование обезболивающей активности новых производных тиадиазола на модели химического раздражения брюшины
В связи с этим на следующем этапе экспериментального исследования оценивали влияние ЛХТ3-10 и ЛХТ10-10 на течение острого экссудативного воспаления у крыс. Было показано, что исследованные производные тиадиазола уменьшали выраженность формалин-индуцированного отека лапы крыс. Эффективность соединений была на уровне препарата сравнения кетопрофена. Полученные данные согласуются с результатами других исследований, показавших наличие противовоспалительной активности у производных тиадиазола, и подтверждают предположение о том, что новые производные тиадиазола ЛХТ3-10 и ЛХТ10-10 можно отнести к группе нестероидных противовоспалительных средств.
Обращает на себя внимание и тот факт, что новые производные тиадиазола ЛХТ3-10 и ЛХТ10-10 при внутрибрюшинном введении мышам проявили противоаллергическую активность, уменьшая выраженность реакции активной кожной анафилаксии соответственно в 1,8 раза и 1,7 раза по сравнению с контролем. Возможно, это связано с наличием в структуре ЛХТ3-10 и ЛХТ10-10 остатков органических кислот, обладающих антиоксидантной активностью. Известно, что многие антиоксиданты из группы органических кислот и их комплексных соединений обладают выраженной противоаллергической активностью. Предполагается, что противоаллергическая активность антиоксидантов связана с тем, что при аллергии наряду со специфическими иммунологическими нарушениями, развиваются и метаболические сдвиги [11, 12]. В частности, наблюдаются активация реакций свободно радикального окисления на фоне понижения активности антиоксидантных систем, изменения уровня мембранных липидов, в том числе фосфоинозитидов и их метаболитов, биогенных аминов, арахидоновой кислоты и эйкозаноидов [79]. Среди производных органических кислот с антиоксидантными свойствами наиболее изучены противоаллергические эффекты сукцинатсодержащих соединений. Известно, что янтарная кислота подавляет перекисное окисление липидов, повышает активность супероксиддисмутазы, увеличивает соотношение липид-белок, улучшает структуру и функцию мембраны клеток. Модулирует активность мембраносвязанных ферментов, рецепторных комплексов, что способствует их связыванию с лигандами, сохранению структурно-функциональной организации биомембран, транспорта нейромедиаторов и улучшению синаптической передачи. Янтарная кислота усиливает компенсаторную активацию аэробного гликолиза и снижает степень угнетения окислительных процессов в цикле Кребса в условиях гипоксии с увеличением уровня аденозинтрифосфорной кислоты и креатинфосфата, активирует энергосинтезирующую функцию митохондрий [32].
Считается, что прямое введение янтарной и других органических кислот в организм малоэффективно из-за их относительно низкой проницаемости через гистогематические барьеры. Больший интерес для практической медицины представляют соли и другие производные органических кислот. В работах ряда исследователей было показано наличие противоаллергической активности у натрия и калия сукцината, дихолина сукцината, сукцинатсодержащего производного 3-оксипиридина (мексидол) и др. Возможно, для реализации противоаллергической активности новых производных тиадиазола кроме их антиоксидантной активности за счет остатков органических кислот имеет значение и тот аспект, что кольцо тиадиазола является тем липофильным центром, который повышает биодоступность исследованных соединений. Кроме того, в механизме противоаллергического действия новых производных тиадиазола существенную роль может играть наличие у них противовоспалительной активности, угнетение ЦОГ и снижение уровня эйкозаноидов. Известно, что метаболиты арахидоновой кислоты являются медиаторами не только воспаления, но и аллергии.
Учитывая тот факт, что нестероидные противовоспалительные средства кроме обезболивающего и противовоспалительного действия обладают жаропонижающей активностью, было изучено влияние новых производных тиадиазола на гипертермическую реакцию у крыс, вызванную введением пирогенала. Известно, что механизм жаропонижающего действия НПВП обусловлен их влиянием на синтез простагландинов. Простагландины группы E, увеличивая концентрацию цАМФ в гипоталамусе, способствует повышенному поступлению кальция в клетки и их активации. В результате увеличивается теплопродукция и снижается теплоотдача за счет стимуляции сосудодвигательного центра и сужения периферических сосудов. Ингибируя синтез простагландинов группы E, антипиретики тормозят его активирующее влияние на образование цАМФ, что приводит к уменьшению теплопродукции и увеличению теплоотдачи. Кроме того, действие указанных препаратов частично определяется их ингибирующим влиянием на синтез эндогенных пирогенов в полиморфноядерных фагоцитах, моноцитах и ретикулоцитах. Было выявлено, что новые производные тиадиазола ЛХТ3-10 и ЛХТ10-10 при пероральном применении до введения пирогенного фактора предупреждали повышение температуры тела у подопытных крыс. Выраженность жаропонижающей активности исследуемых соединений соответствовала эффектам кетопрофена в этом отношении.
Таким образом, результаты проведенных экспериментов позволили выявить среди новых производных тиадиазола соединения ЛХТ3-10 и ЛХТ10 10, обладающие обезболивающей, противовоспалительной, противоаллергической и жаропонижающей активностью. По своей обезболивающей, противовоспалительной и жаропонижающей активности новые производные тиадиазола не уступали соответственно диклофенаку натрия и кетопрофену.
