Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Физико-химические свойства арбутина и гидрохинона 12
1.2. Арбутинсодержащие растения, обладающие мочегонным действием. Общая характеристика, применение в медицине
1.3. Основные биологические эффекты арбутина и гидрохинона 20
1.4. Побочные эффекты 29
1.5. Выводы по обзору литературы 31
Глава 2. Материал и методы исследования
2.1. Теоретические исследования 33
2.2. Синтез производных арбутина 36
2.3. Изучение фармакологической активности арбутина и его структурных аналогов в экспериментах на животных
2.4. Исследования in vitro 50
2.5. Методы статистической обработки полученных результатов 51
Глава 3. Термодинамические расчеты молекулы арбутина и его структурных аналогов. Термодинамические спектры
3.1, Термодинамические спектры агликоиов арбутина и его производных
Глава 4. Изучение фармакологической активности арбутина 73
3.1. Мочегонная активность арбутина и его структурных аналогов 73
3.2. Особенности фармакодинамики арбутина 82
3.3. Другие фармакологические эффекты арбутина 88
3.3.1. Влияния арбутина и гидрохинона на развитие острого воспаления у крыс
3.3.2. Антиоксидантная активность арбутина и гидрохинона 91
3.3.3. Антимикробная активность арбутина и гидрохинона 100
Глава 4. Обсуждение результатов 106
Выводы 123
Практические рекомендации 125
Список литературы 1
- Арбутинсодержащие растения, обладающие мочегонным действием. Общая характеристика, применение в медицине
- Синтез производных арбутина
- Термодинамические спектры агликоиов арбутина и его производных
- Влияния арбутина и гидрохинона на развитие острого воспаления у крыс
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из актуальных проблем современной фармакологии является поиск новых высокоэффективных и безопасных лекарственных средств [Панчук С., Яблучанский Н., 2002]. Благодаря успехам в области органического синтеза было создано множество лечебных средств. Однако в настоящее время поиск фармакологических веществ ведётся не только среди продуктов химического синтеза, но и среди лекарственного растительного сырья [Кукес В.Г., 2006]. Этому направлению способствует огромный опыт ученых и накопленные знания народной медицины.
Растительные препараты бесспорно имеют ряд преимуществ перед синтетическими, таких как низкая токсичность либо даже отсутствие таковой, относительная мягкость фармакологических эффектов, широта терапевтического действия и, как правило, многонаправленность лечебного воздействия на организм. Работы по поиску активных компонентов в лекарственных растениях и выяснение механизмов их терапевтического действия остаются весьма востребованы в условиях современного состояния фармацевтической и фармакологической науки.
Детальное изучение механизмов водно-солевого обмена привело к совершенствованию методов клинического исследования функции почек и поиску новых веществ, влияющих на клубочковую фильтрацию, реабсорбцию электролитов и воды, образование и экскрецию мочи, поскольку современные диуретики пока не отвечают всем требованиям к этой группе лекарственных средств [Литвинова О.Н., Березнякова М.Е.].
На сегодняшний день применение в клинической практике находят фитопрепараты, обладающие мочегонным действием. Группа растительных диуретиков включает в себя большое число растений разных семейств, но их отличает от современных диуретиков синтетического происхождения постепенное нарастание мочегонного действия и отсутствие потери электролитов. Многие из этих растений в своем составе содержат в большом количестве фенолгликозид арбутин. Известно, что арбутин обладает не только мочегонным, но и противовоспалительным, антиоксидантным, антимикробным свойствами, что дает ему преимущества перед синтетическими диуретиками. Общепринятым является мнение, что в организме арбутин гидролизуется до гидрохинона, который собственно и определяет фармакологические эффекты арбутинсодержащих растений. Однако, арбутин в чистом виде изучался очень мало, в основном были изучены фармакологические эффекты арбутинсодержащих фитопрепаратов. В литературе нет достаточных сведений о том, какое влияние на реализацию лечебного действия растений оказывает арбутин, детально не изучены его фармакологические эффекты, нет экспериментальных подтверждений тому, что арбутин действует через высвобождение гидрохинона, поскольку на сегодняшний день подробные данные о фармакодинамике арбутина и гидрохинона отсутствуют.
Учитывая тот факт, что актуальной задачей современной фармакологической науки является поиск лекарственных веществ, влияющих на выделительную функцию почек, арбутин можно предложить в качестве лекарственного вещества. Однако для этого необходимы сведения о фармакодинамике и фармакокинетике арбутина. Кроме того, эти сведения помогли бы в дальнейшем разработать принципы синтеза новых лекарственных средств с мочегонной активностью на основе гликозидной структуры.
Цель исследования: изучить особенности фармакодинамики арбутина и выявить связь его фармакологических эффектов с электронной структурой.
Задачи исследования
1. Изучить особенности пространственного и электронного строения молекулы арбутина и его синтетических производных, рассчитать термодинамические спектры их активности.
2. Исследовать и сравнить с синтезированными производными диуретическую и салуретическую активности арбутина в эксперименте на крысах. Оценить роль гидроксильной группы в структуре арбутина в обеспечении его диуретической и салуретической активности.
3. Выявить особенности фармакодинамики арбутина при энтеральном и парентеральном путях введения.
4. Оценить противовоспалительную активность гликозида арбутина и его агликона в эксперименте на крысах.
5. Изучить и сравнить антиоксидантную активность гликозида арбутина с его агликоном в экспериментах in vitro и in vivo.
6. Исследовать антимикробную активность арбутина и его агликона в отношении основных возбудителей инфекционных болезней мочевыводящих путей.
Научная новизна исследования. Впервые установлена взаимосвязь между фармакологической активностью и электронным строением арбутина. Показано, что ключевую роль в реализации мочегонного действия в молекуле арбутина играет гидроксильная группировка в пара-положении бензольного кольца агликона и гликоновый сегмент молекулы.
Впервые комплексно изучены основные фармакологические эффекты арбутина.
Впервые изучены фармакодинамические особенности арбутина при различных путях введения в организм. Установлено, что при парентеральном применении, в отличие от энтерального, арбутин не обладает мочегонной и противовоспалительной активностями.
Выявлена зависимость антиоксидантного эффекта арбутина и гидрохинона от концентрации в экспериментах in vitro и диуретического действия от дозы в экспериментах in vivo.
Впервые методами квантовой химии была оценена антирадикальная активность арбутина и гидрохинона.
Научно-практическая значимость. Практическая значимость исследования заключается в экспериментальном доказательстве возможности перорального применения арбутина как мочегонного средства при различных заболеваниях мочеполовой системы. Наряду с этим на основе полученных данных о взаимосвязи между фармакологической активностью и электронным строением арбутина сформулированы опорные предпосылки для создания новой группы мочегонных препаратов с наличием фармакологических преимуществ (незначительные нарушения водно-солевого обмена, постепенное нарастание диуретического эффекта, наличие противовоспалительного и антимикробного действия) перед существующими современными мочегонными средствами.
Данная работа имеет теоретическое значение, поскольку позволяет повысить уровень знаний относительно мочегонного, противовоспалительного, антиоксидантного и антимикробного действия арбутина и гидрохинона, которые входят в состав многих лекарственных растений различных семейств, широко применяемых в терапевтической практике. Полученные данные несут информацию фундаментального характера, которая в будущем поможет объяснить некоторые механизмы биологической активности этих веществ.
Основные положения, выносимые на защиту
-
При энтеральном применении арбутин обладает выраженным мочегонным действием, сопровождающимся увеличением экскреции креатинина и калия, и не является натрийуретиком. В реализацию диуретического действия арбутина существенный вклад вносят гидроксильная группировка в пара-положении бензольного кольца агликона и гликоновый сегмент молекулы.
-
При парентеральном применении арбутин не обладает диуретическим и противовоспалительным действием.
-
Антиоксидантная активность арбутина более выражена в почках крыс; агликона арбутина – в крови крыс. Действие на оксидантно-антиоксидантную систему арбутина и его агликона имеет схожую картину в живом организме и в пробирке.
-
Арбутин не обладает противомикробной активностью в отношении микроорганизмов, специфичных для инфекционных заболеваний мочевого тракта. Гидрохинон оказывает выраженное антибактериальное действие в отношении всех представленных штаммов грамотрицательных микроорганизмов.
Апробация материалов диссертации
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Проблемы развития фармацевтической науки и образования» (г.Томск, 2011г.), I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Ученые Урала и Сибири — развитию отечественной фармации: от синтеза до инновационных лекарственных средств» (г. Новосибирск, 2011 г.), I Всероссийском сибирском медико-биологическом конгрессе (г. Барнаул, 2011 г.), XIII научно-практической конференции «Молодежь – Барнаулу» (г. Барнаул, 2011 г.), ежегодной Всероссийской научно-практической конференции «Наука, образование, медицина» (Самара, 2011 г.), международном молодежном медицинском конгрессе "Санкт-Петербургские научные чтения - 2011" (Санкт-Петербург, 2011), на II итоговой конференции Научного общества молодых ученых и студентов (г. Барнаул, 2012 г.), на IX научно-практической конференции «Молодежь – Барнаулу» (г. Барнаул, 2012 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 5 – в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации
Арбутинсодержащие растения, обладающие мочегонным действием. Общая характеристика, применение в медицине
Брусника обыкновенная - Vaccinium vitis-idaea (L.) принадлежит семейству вересковые (Ericaceae). Лечебное действие брусники обусловлено главным образом фенольным соединением арбутином, содержащимся в листьях, от которого в щелочной среде отщепляется гидрохинон, обладающий, как полагают, сильным антисептическим действием, который в свою очередь, и обуславливает выраженный бактерицидный и мочегонный эффекты. Брусника содержит в своем составе до 9% арбутина. В России отвар и настой листьев широко используют как диуретическое средство при заболеваниях почек и мочевого пузыря (пиелит, цистит, пиелонефрит, моче -и почечнокаменая болезнь), а также в качестве дезинфицирующего и регулирующего азотистый обмен средства при острых и хронических воспалительных процессах в мочеполовой системе, в том числе и при простатите [41J. Кроме того, предполагают, что антисептическое действие листьев брусники обусловлено дубильными соединениями, которые также обладают бактерицидными и противовоспалительными свойствами. Катехиновые вещества уменьшают проницаемость и ломкость капилляров. Показано, что диуретическое действие листьев брусники повышается при одновременном назначении с другими растительными диуретиками (листья толокнянки, почечный чай). Ягоды брусники в эксперименте на мышах оказывают противолямблиозное действие [89].
Черника обыкновенная - Vaccinium myrtillus (L.) принадлежит семейству вересковые (Ericaceae). В ее плодах содержится до 1% арбутина, 7-20% дубильных веществ и в небольших количествах гидрохинон. Она также нашла применение в медицине, используется для лечения желудочно-кишечных заболеваний (гастритов, энтероколитов и др.) в виде настоя или отвара сухих ягод. При диареях, особенно у детей, это одно из незаменимых закрепляющих средств. Свежие ягоды применяют при хронических запорах, пониженной кислотности желудочного сока, дизентерии. Обладает антисептическими свойствами и употребляется при стоматите. Плоды черники улучшают кровоснабжение глаз.
Груша обыкновенная - Pyrus communis L., семейство розоцветные (Rosaceae). Плоды содержат в своем составе 1,4—5,0% арбутина. Применяются в медицине как мочегонное средство, при мочекаменной болезни, оказывают антибактериальное действие. Отвар плодов груши использовали при почечнокаменной болезни и бактериурии. В народной медицине отвар плодов груши употребляли внутрь как вяжущее средство при желудочно-кишечных расстройствах. Сок и настой груши обладают диуретическими свойствами, поэтому их назначают при заболеваниях почек и сердца, при значительном накоплении солей в организме, а также лихорадочных состояниях [59].
Грушанка круглолистная - Pyrola rotimdifolia относится к семейству вересковые (Ericaceae). Она содержит в своем составе до 8% арбутина и до 0,069% гидрохинона. Широко применяется в народной медицине в качестве мочегонного, антисептического, противовоспалительного, кровоостанавливающего средства [75]. Грушанку назначают при хронических болезнях почек и воспалительных заболеваниях мочевого пузыря и мочевых путей с гнойными выделениями, при воспалении предстательной железы и водянке [59].
Багульник болотный - Ledum palustre принадлежит семейству вересковые (Ericaceae). Он содержит в своем составе до 5% арбутина. Применяется при коклюше, подагре, ревматизме, мокнущей экземе, а также как потогонное средство. Наряду с арбутином основным действующим началом препаратов из багульника является эфирное масло, которое при внутрижелудочном введении частично выделяется через слизистые оболочки органов дыхания, оказывая умеренное местнораздражающее действие на слизистые оболочки, усиливая секрецию бронхиальных желез и повышая активность ресничного эпителия дыхательных путей. Препараты багульника оказывают спазмолитическое действие на гладкую мускулатуру бронхов. Суммарный эффект воздействия препаратов багульника на организм человека обусловлен отхаркивающими, обволакивающими и противокашлевыми свойствами. Надо отметить, что багульник возбуждающе действует на высшие отделы центральной нервной системы. При приеме препаратов багульника наблюдается диуретический и дезинфицирующий эффект, обусловленный выделением эфирного масла с мочой через почки и влиянием на мочевыводящие пути этого масла и арбутина [6].
Ортилия однобокая (боровая матка) - Orthilia secunda (L.) относится к семейству грушанковые (Pyrolaceae). Содержит в своем составе до 1,5% арбутина и 0,03% свободного гидрохинона. Растение успешно применяется как дезинфицирующее средство при воспалительных процессах в почках и мочевом пузыре, при циститах, пиелонефритах, при воспалении предстательной железы, геморрое и недержании мочи, аденоме простаты, заболеваниях пищеварительного тракта и нервных расстройствах. Антисептическое и противовоспалительное действие связывают с гидрохиноном, высвобождающимся в организме при гидролизе арбутина и метиларбутина под действием ферментов и кислот [18J.
Зимолюбка зонтичная - Chimaphila umbellata (L.) относится к семейству грушанковые (Pyrolaceae). Содержит в своем составе арбутин в небольшом количестве. Применяется отвары и настои надземной части при пиелите, цистите, энтероколите, заболеваниях почек и сердца, как слабительное, диуретическое, противовоспалительное, при ревматизме, подагре, простатите, болезнях печени, желтухе, диабете, диарее, раке желудка, эпилепсии, грыже у детей, гематурии, при метро- и меноррагиях, мочекаменной болезни [83].
Синтез производных арбутина
Активность ГПО определяли по количеству израсходованного в ферментативной реакции восстановленного глутатиона с гидроперекисью трет-бутила. Концентрация восстановленного глутатиона определялась по поглощению тионитрофенольного аниона (ТНФА), образующегося при взаимодействии SH-групп глутатиона с 5,5-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой (ДТНБК) [70]. Гемолизат крови, приготовленный в соотношении 1:20, в количестве 0,1 мл добавляли к 0,83 мл 4,8 мМ раствора глутатиона в буфере (0,1 М трис-НО-буфер, рН = 8,5, содержащий 6 мМ ЭДТА и 12 мМ азида натрия), инкубировали при 37С в течение 10 мин. Затем добавляли 0,7 мл 20 мМ раствора гидроперекиси трет-бутила и вновь инкубировали в течение 5 мин при 37С. После чего добавляли 0,2 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУК) и центрифугировали при 2500 об/мин в течение 15 мин. К 5 мл 0,1 М трис-НС1-буфера (рН = 8,5) добавляли 0,05 мл полученного супернатанта и 0,05 мл реактива Эллмана (0,01 М раствор ДТНБК в метаноле), инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Оптическую плотность полученного раствора измеряли на фотоэлектроколориметре при длине волны 412 нм, в качестве раствора сравнения использовали дистиллированную воду. Расчет активности глютатионпероксидазы проводили относительно контрольной пробы, которую готовили как описано выше с одним отличием: 100 мкл гемолизата вносили непосредственно перед центрифугированием после вторичного инкубирования: ГПО(ЕД/мгНЬ)= Ек"Е" 2ї47хЮ0; v lib где: ГПО - активность глютатионпероксидазы в ЕД, соответствующих 1 мг гемоглобина; Ек- оптическая плотность в контроле; Е0 - оптическая плотность опытной пробы; 2147 - коэффициент, полученный при построении калибровочной кривой ГПО; НЬ - количество гемоглобина в г/л.
Количество гемоглобина определяли следующим образом: 0,02 мл гемолизата в разведении 1:1 добавляли к 5 мл трансформирующего раствора и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Измеряли оптическую плотность полученного раствора при 540 нм против трансформирующего раствора. Количество НЬ рассчитывали по формуле: НЬ(г/л)=Е„х400; где: Е0 - экстинкция опытной пробы; 400 - коэффициент, полученный при построении калибровочной кривой НЬ. Определение общего антиоксидантного статуса (ОАА) основано на способности гемолизата крови животных подавлять окисление ТВИН-80, индуцированное аскорбатом железа (II), с последующим колориметрическим измерением продуктов окисления ТВИН-80, ассоциированных с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [11]. К 2 мл 1% раствора ТВИНА-80 добавляли 0,1 мл гемолизата (1:10), 0,2 мл 1мМ раствора сульфата железа (II), 0,2 мл 10 мМ раствора аскорбиновой кислоты, плотно укупоривали и инкубировали при 40С в течении 48 часов. Затем в полученную смесь добавляли 1 мл 40% раствора ТХУК и вновь инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин. После чего центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 мин. Полученный супернатант в количестве 2 мл смешивали с 1 мл 0,25% раствора ТБК в 0,13% растворе гидроксида натрия и инкубировали при 100С в течение 15 мин. Затем пробы охлаждали и измеряли их оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при длине волны 532 нм против дистиллированной воды. Расчет общей антиоксидантной активности проводили относительно контрольной пробы, для приготовления которой вместо гемолизата добавляли эквиобъемное количество дистиллированной воды: (F -F ) ОАА (%) = х 100; Ч-где: Ек— оптическая плотность в контроле; Е0 - оптическая плотность опытной пробы.
Состояние оксидантного статуса подопытных животных оценивали по уровню находящихся в жидкой части крови свободно-радикальных прооксидантов (общая прооксидантная активность плазмы), индуцирующих окисление ТВИН-80 [31]. Для этого к 0,2 мл плазмы крови крыс добавляли 2 мл 1% раствора ТВИН-80, плотно укупоривали и инкубировали при 40С в течение 48 часов. Затем к полученной смеси добавляли 1 мл 40% раствора ТХУК и вновь инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин. Затем пробы центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 мин. Полученный супернатант в количестве 2 мл смешивали с 1 мл 0,25% щелочного раствора ТБК. Смесь инкубировали при 100С в течение 15 мин, затем охлаждали и измеряли оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при длине волны 532 нм против дистиллированной воды. Расчет общей прооксидантной активности (ОПА) проводили относительно контрольной пробы, для приготовления которой вместо плазмы крови использовали эквиобъемное количество дистиллированной воды: (F -F ) ОПЛ(%)= xlOO; к„ где: Ек- оптическая плотность в контроле; Е0 - оптическая плотность опытной пробы. Кроме того, о состоянии оксидантного статуса судили по содержанию тиобарбитуратреактивных продуктов (ТБРП), представленных преимущественно малоновым диальдегидом (МДА). Последний образует окрашенные комплексы с тиобарбитуровой кислотой по типу оснований Шиффа и характеризует интенсивность окислительного повреждения биомембран [26]. К 0,5 мл плазмы крови крыс добавляли 0,5 мл дистиллированной воды, 1 мл 30% раствора ТХУК, 0,1 мл 5 М раствора соляной кислоты и 1 мл 0,75% раствора ТБК. Полученную смесь инкубировали при 100С в течение 15 мин, затем охлаждали и центрифугировали при 3000 об/мин в течении 15 мин. Измеряли оптическую плотность супернатанта против контрольной пробы при 535 нм. Контрольную пробу готовили как описано выше, используя вместо плазмы крови дистиллированную воду.
Термодинамические спектры агликоиов арбутина и его производных
Растительные диуретики нередко называют акваретиками, или водными диуретиками, поскольку они выводят из организма преимущественно воду. Считается, что действие растительных диуретиков заключается в основном в повышении гломерулярной фильтрации и увеличении образования первичной мочи вследствие увеличения почечного кровотока и (или) ускорения осмотических процессов в почках [50]. При применении растительных диуретиков, как правило, не наблюдается повышенного выведения ионов калия из организма, и лишь в редких случаях отмечено достоверное увеличение концентрации калия в моче по отношению к контрольному уровню [55, 81, 85]. Мочегонное действие некоторых лекарственных растений связывают с наличием в их составе фенолгликозида арбутина, который, как полагают, действует через высвобождение гидрохинона при гидролизе [58, 80, 163, 172]. Несмотря на то, что фармакологические эффекты арбутина в достаточной мере известны, нет подробных сведений о том, как именно и за счет чего реализуются эти эффекты.
Поскольку механизм действия арбутина связывают с гидролизом его до гидрохинона, целесообразным было сравнить мочегонную активность арбутина и гидрохинона.
Результаты влияния арбутина и гидрохинона на функцию почек крыс представлены нарис. 25, 26 и в таблицах 13, 14, 15.
Примечание: здесь и далее -различия достоверны в сравнении с исходным показателем. Из рис. 25 видно, что при введении арбутина и гидрохинона в дозе 18 мкмоль/кг наблюдалось постепенное увеличение диуреза, статистически значимых значений по сравнению с контролем оно достигало с четвертого по шестой дни введения каждого из веществ. Следует отметить, что такой характер действия свойственен растительным диуретикам.
Однако при повышении дозы веществ до 54 мкмоль/кг диурез статистически значимо увеличивался с первого дня введения и оставался высоким вплоть до окончания эксперимента (рис. 26). Следует заметить, что, несмотря на то, что оба вещества оказали мочегонный эффект, у арбутина он был выше. Так максимальное увеличение образования мочи при введении арбутина было выше контрольного в 5 раз, а гидрохинона в 3 раза. ft
Диуретическая активность арбутина и гидрохинона при внутрижелудочном введении крысам в дозе 54 мкмоль/кг.
По данным табл. 13, в дозе 18 мкмоль/кг наблюдалось неоднозначное влияние на экскрецию креатинина обоих веществ. При введении арбутина экскреция креатинина достоверно увеличивалась в первый и последний дни эксперимента, при введении гидрохинона с пятого дня по седьмой. Иная картина наблюдалась при введении веществ в дозе 54 мкмоль/кг. Арбутин с первого дня и до завершения эксперимента увеличивал экскрецию креатинина в 2-4 раза по сравнению с контролем. Причем это увеличение происходило параллельно с увеличением диуреза. Таким образом, возможно, мочегонное действие арбутина связано с увеличением скорости клубочковой фильтрации, о чем косвенно можно судить по возрастающим показателям креатинина в моче. При введении гидрохинона экскреция креатинина достоверно возрастала только в первый день эксперимента, в остальные дни этот показатель оставался на уровне контрольных значений. Таблица 13. Изменение экскреции креатинина с мочой у крыс при внутрижелудочном введении арбутина и гидрохинона по сравнению с контролем, % Доза 18 мкмоль/кг 1 день 3 день 5 день 7 день Арбутин (п=12) 197 (Р 0,01) 91 50 127 (Р 5 0,05) Гидрохинон (п=12) 25 37 75 (Р 0, 05) 89 (Р 0,05) Доза 54 мкмоль/кг 1 день 3 день 5 день 7 день Арбутин (п=12) 421 (р 0,01) 232 (Р 0,01) 267 (Р 0,01) 171 (Р 0, 01) Гидрохинон (п=12) 140 (Р 0.05) 6 36 16 Как показывает табл. 14, введение исследуемых веществ в обеих дозах не вызывало натрийуретического эффекта. А в некоторых случаях даже снижало экскрецию натрия. Таблица 14. Изменение экскреции натрия с мочой у крыс при внутрижелудочном введении арбутина и гидрохинона по сравнению с контролем, % Доза 18мкмоль/кг 1 день 3 день 5 день 7 день Арбутин (п=12) 43,3 0 23,9 -34,3 (Р 0,05) Гидрохинон (п=12) -п,з -40 (Р 0, 05) 0 31,3 Доза 54 мкмоль/кг 1 день 3 день 5 день 7 день Арбутин (п=12) -37,3 (Р 0,05) 4,5 - 34,3 (р 0,05) 5,9 Гидрохинон(п=12) -46,1 (Р 0. 05) - 49, 6 (Р 0, 05) - 63,4 (Р 0,01) - 54,8 (Р 0, 05) При оценке влияния на выведение калия были получены следующие результаты (табл. 15): арбутин в обоих случаях достоверно увеличивал экскрецию калия с первого дня введения и до завершения эксперимента, Гидрохинон, напротив, не оказывал никакого воздействия на экскрецию калия ни в одной дозе.
Полученные данные свидетельствуют о наличии выраженного мочегонного действия изучаемых веществ. При этом диуретический эффект арбутина превышает таковой гидрохинона в 3-5 раз. Возможно, мочегонный эффект арбутина реализуется через повышение скорости клубочковой фильтрации.
Для экспериментальной оценки роли гидроксильной группы агликона в структуре арбутина были синтезированы некоторые гликозидные производные арбутина с различными агликонами: фенил-p-D-глюкопиранозид и метиларбутин.
Молекула фенил-[3-0-глюкопиранозида сходна по своему химическому строению и пространственной конфигурации природному гликозиду арбутину, проявляющему мочегонную активность, поэтому фенил-P-D-глюкопиранозид взаимодействуя с субстратом аналогичным арбутину образом, возможно, также будет обладать диуретическим действием. Различие в строении данных гликозидов заключается в том, что в молекуле арбутина агликоном является гидрохинон, а у фенил-(3-0-глюкопиранозида - фенол.
Если мочегонная активность синтезированного вещества будет ниже, чем у арбутина, то гидроксильная группировка агликона является ключевой группировкой, повышающей прочность комплекса и увеличивающей аффинитет белка-мишени, что обеспечивает относительно высокую диуретическую активность молекулы арбутина.
Если диуретическая активность фенил-р-О-глюкопиранозида будет выше, чем у арбутина, то тогда свободный гидроксильный радикал арбутина препятствует реализации гидрофобного эффекта при образовании комплекса неполярного фрагмента белка-мишени с неполярным участком гликозида.
Известно, что метиларбутин в растениях часто обнаруживается совместно с арбутином. При гидролизе метиларбутина отщепляется метиловый эфир и также, как у арбутина, освобождает гидрохинон [92, 94]. Если предположение о том, что мочегонный эффект арбутина зависит от высвобождения гидрохинона, верно, то метиларбутин должен оказывать по силе такой же мочегонный эффект, как и арбутин.
Влияния арбутина и гидрохинона на развитие острого воспаления у крыс
Фармакологические исследования арбутина проводили в направлении изучения диуретической, противовоспалительной, антиоксидантной и противомикробной активности.
Известно, что препараты арбутинсодержащих растений могут повышать диурез, увеличивая скорость клубочковой фильтрации, уменьшая канальцевую реабсорбцию почек либо сочетая эти механизмы [91]. Общепринятым предположительным механизмом реализации мочегонного эффекта арбутина считается раздражение эпителия почечных канальцев гидрохиноном, который высвобождается при расщеплении арбутина. Это «дубящее», по сообщению некоторых авторов, действие на белки почечных канальцев и обусловливает слабый, по сравнению с большинством синтетических диуретических средств, эффект [91, 69]. Однако, это представление с позиций современной науки выглядит, на наш взгляд, весьма спорным. Одни ученые приводят данные о том, что арбутин почти полностью всасывается в кишечнике, другие приводят эксперименты, в которых арбутин подвергается действию микрофлоры толстого кишечника, которая, как выяснено ранее, разрушает арбутин до гидрохинона с помощью своих ферментных систем [113, 127]. В таком случае, как нам представляется, гидрохинон, образовавшийся в ЖКТ после гидролиза арбутина, в первую очередь должен был бы оказывать «дубящее» действие на клетки кишечного эпителия, что привело бы к нарушению его функционирования и всасывания гидрохинона. В случае попадания гидрохинона в общий кровоток, опять же, он должен был бы в определенной степени коагулировать белки крови. Предполагать, что активной формой гидрохинона в отношении почек являются его метаболиты, будь то глюкурониды или сульфаты, необоснованно, поскольку в виде водорастворимых солей гидрохинон вообще не способен образовывать прочные связи с белками, т.е. вызывать их коагуляцию.
В нашем исследовании была предпринята попытка оценить связь фармакологической активности арбутина от его электронного строения, что помогло бы раскрыть некоторые стороны действия арбутина.
В результате теоретических расчетов было установлено, что среди комплексов арбутина и его синтетических гликозидных аналогов наибольшей отрицательной энергией Гиббса, а значит и наибольшей прочностью, обладают комплексы метиларбутина с гистидином и триптофаном, а наименьшей прочностью обладают комплексы арбутина с глутаминовой и аспарагиновой кислотами. Подобными расчетами оценивали и процессы комплексообразоваиия агликона арбутина гидрохинона и его окисленной формы - бензохинона. Оказалось, что гидрохинон и бензохинон образуют комплексы с разными аминокислотами. Кроме того, согласно расчетам, энергии комплексообразоваиия арбутина и гидрохинона сопоставимы между собой. Исходя из этого, можно предполагать, что наиболее мощный диуретический эффект будет оказывать метиларбутин, а мочегонный эффект арбутина и гидрохинона должен быть сопоставим. Для подтверждения теоретических расчетов были проведены экспериментальные исследования мочегонной активности изучаемых веществ.
В результате проведенных исследований было установлено, что все изучаемые вещества, за исключением метиларбутина, обладали выраженной диуретической активностью, при этом, мочегонный эффект исследуемых веществ носит дозозависимый характер. Однако, наиболее мощный диуретический эффект наблюдался при введении арбутина. Таким образом, результаты и интерпретация теоретических расчетов, на первый взгляд, не совпадает с экспериментальными данными. Однако, теоретические расчеты также показали, что молекулы арбутина и гидрохинона образуют наиболее прочные комплексы с одинаковыми аминокислотами (аспарагиновой и глутаминовой кислотами), а все остальные вещества с триптофаном, т.е. исследуемые вещества, скорее всего, имеют разные биологические мишени. С этой точки зрения мочегонный эффект наиболее выражено проявляется при взаимодействии вещества с белком-мишеныо, имеющем свободные реакционно-способные группировки аспарагиновой и глутаминовой кислот. Кроме того, как предполагалось из теоретических расчетов, мочегонная активность арбутина и гидрохинона должна быть сопоставима, хотя в эксперименте диуретический эффект арбутина был значимо выше. Это, вероятно, связано с тем, что арбутин имеет гораздо более сложную структуру, чем гидрохинон. Наличие глюкозы в молекуле арбутина, видимо, обеспечивает большую его селективность к белковой мишени, чем гидрохинона. Следует добавить, что в потенциальной мишени арбутина нужно искать центры взаимодействия с лигандом по наличию в них G!u и Asp.
При изучении влияния веществ на водно-солевой баланс было установлено, что введение всех изучаемых веществ не вызывало натрийуретического эффекта. Арбутин и фенил-р-О-глюкопиранозид увеличивали экскрецию калия в 2,5 раза по сравнению с контролем, метиларбутин вызывал калийурез только в 1-ый и 5-ый дни введения, а гидрохинон не влиял на выведение калия.
Таким образом, диуретический эффект арбутина не связан с увеличением экскреции натрия, а соответственно, гипотеза о том, что арбутин действует посредством гидрохинона, который «дубит» почечные канальцы и тем самым препятствует реабсорбции ионов и жидкости из просвета канальцев, не находит своего подтверждения. Поскольку арбутин достоверно увеличивал экскрецию креатинина, то одним из возможных механизмов диуретического действия арбутина можно считать повышение почечного кровотока и, как следствие, увеличение клубочковой фильтрации.
На следующем этапе исследования были проведены фармакодинамические исследования арбутина. Исследования проводили в сравнении с его основным метаболитом гидрохиноном. Интерес представляло сопоставление мочегонной активности арбутина и гидрохинона при энтеральном и парентеральном применении.
