Содержание к диссертации
Введение
2.Обзор литературы 10
2.1.Легочная гипертензия 10
2.1.1.Классификация легочной гипертензии
2.1.2.Патогенез легочной гипертензии
2.1.3. Патогенез гипоксической формы легочной гипертензии .15
2.1.3.1. Гипоксия 15
2.1.3.2. Виды гипоксий 15
2.1.3.3. Реакция организма на гипоксию.
2.1.4.Гендерные различия в проявлениях легочной гипертензии.. 23
2.2.Эстрогены 24
2.2.1.Эстрадиол: синтез, метаболизм. 24
2.2.2.Основные физиологические функции эстрадиола 29
2.2.3.Роль эстрадиола в регуляции сердечно-сосудистой системы .36
2.3. Влияние эстрадиола на выраженность легочной гипертензии на различных экспериментальных моделях .40
2.3.1. Влияние эстрадиола на проявление монокроталиновой и блеомициновой моделей легочной гипертензии 40
2.3.2. Влияние эстрадиола на проявление гипоксической модели легочной гипертензии. 41
3. Материалы и методы исследования .43
3.1. Деление животных на экспериментальные группы и моделирование гипоксической формы легочной гипертензии , 43
3.2. Проведение билатеральной овариэктомии и введение разных доз эстрадиола и блокатора его ядерных и мембранных рецепторов типа альфа и бета 44
3.3. Плетизмографическое измерение систолического артериального давления в хвостовой артерии животного 45
3.4. Гематологическое исследование крови: определение содержания эритроцитов и концентрации гемоглобина, расчет уровня гематокрита .46
3.5. Проведение острого физиологического эксперимента для регистрации гемодинамических параметров и их реакции на введение вазоактивных веществ с использованием имплантируемых катетеров in vivo 46
3.6. Исследования реактивности изолированных легочных и системных сосудов в ответ на перфузию вазоактивных веществ in vitro .49
3.7. Морфометрические исследования сердца и матки 50
3.8. Биохимические эксперименты 51
3.9. Вещества, использовавшиеся в экспериментах 52
3.10. Статистический анализ 52
4.Результаты .53
4.1.Изучение влияния хронической гипоксии на овариэктомированных и интактных самок крыс популяции Wistar 53
4.1.1. Изучение влияния хронической гипоксии на систолическое давление в правом желудочке и на вес правого желудочка сердца у интактных и овариэктомированных самок крыс популяции Wistar 53
4.1.2. Влияние хронической гипоксии на уровень содержания эстрадиола в плазме крови самок крыс .55
4.1.3. Качественная оценка овариэктомии по массе матки животного 56
4.2.Изучение влияния растворителя пропиленгликоля на регистрируемые параметры сердечно-сосудистой системы при гипоксической форме легочной артериальной гипертензии у овариэктомированных самок крыс популяции Wistar 57 4.3.Сравнительный анализ изучения влияния хронического применения эстрадиола в дозах 15 и 60 мкг/кг на овариэктомированных самок крыс популяции Wistar , подвергавшихся хронической гипоксии в течение 2 недель или содержавшихся в нормоксических условиях 59
4.3.1. Влияние введения экзогенного эстрадиола овариэктомированным самкам крыс при условиях гипоксии или нормоксии на систолическое давление в правом желудочке и на вес правого желудочка сердца. 59 4.3.2.Влияние хронического введения экзогенного эстрадиола овариэктомированным самкам при условиях гипоксии и нормоксии на массу матки животных. 62 4.3.3. Влияние хронического введения экзогенного эстрадиола овариэктомированным самкам при условиях гипоксии и нормоксии на уровни гематокрита, количества эритроцитов и гемоглобина.. 63
4.4. Изучение влияния введения экзогенного эстрадиола в дозах 5 и 15 мкг/кг в день в течение 21 дня и гипоксии в течение 2 недель на овариэктомированных самок крыс популяции Wistar 67
4.4.1. Влияние введения экзогенного эстрадиола и гипоксии на систолическое давление в правом желудочке и на вес правого желудочка сердца. 68
4.4.2. Влияние хронического введения экзогенного эстрадиола и гипоксии на систолическое и среднее артериальное давление. Реакции регистрируемого артериального давления на введении вазоактивных веществ 70
4.4.2.1. Изменение систолического артериального давления. Сравнение показателей,
полученных прямым и непрямым методами регистрации 71
4.4.2.2. Среднее (системное и систолическое) артериальное давление у овариэктомированных самок с хроническим введением эстрадиола при гипоксической форме легочной гипертонии 72
4.4.2.3.Изменения системного среднего артериального давления при внутривенном болюсном введении вазоактивных веществ 73
4.4.3. Влияние хронического введения экзогенного эстрадиола в дозах 5 и 15 мкг/кг на
массу матки .74
4.5.Изучение влияния введения экзогенного эстрадиола в дозах 15 и 60 мкг/кг в день и блокатора эстрадиоловых рецепторов типа и ICI 182,780 в дозе 150 мкг/кг в день в течение 28 дней и гипоксии в течение 2 недель на овариэктомированных самок крыс популяции Wistar 75 4.5.1. Влияние введения экзогенного эстрадиола, блокатора эстрадиоловых рецепторов и гипоксии на систолическое давление в правом желудочке и на вес правого желудочка сердца 76 4.5.2.Реакция среднего системного артериального давления на хроническое введение эстрадиола, блокатор эстрадиоловых рецепторов и гипоксию 77 4.5.3.Изменения системного артериального давления при внутривенном введении вазоактивных веществ .79
4.5.4. Влияние хронического введения эстрадиола в дозах 15 и 60 мкг/кг овариэктомированным гипертензивным самкам крыс на массу матки 80
4.6. Изучение реактивности изолированных сосудов малого и большого круга кровообращения овариэктомированных самок крыс популяции Wistar при хроническом введение эстрадиола и действии гипоксии 82
4.6.1. Дозо-зависимая реакция изолированных легочных сосудов овариэктомированных крыс популяции Wistar, получавших эстрадиол в дозе 15 мкг/кг, на серотонин после воздействия хронической гипоксии .83
4.6.2. Дозо-зависимая реакция изолированных перфузируемых сосудов овариэктомированных крыс популяции Wistar, получавших эстрадиол в дозе 15 мкг/кг, на ацетилхолин после воздействия хронической гипоксии 85
4.6.3. Дозо-зависимая реакция на эстрадиол сосудов овариэктомированных крыс популяции Wistar, хронически получавших эстрадиол в дозе 15 мкг/кг в сочетании с хронической гипоксией 87
5.Обсуждение результатов 90
6.Выводы 99
7.Список используемых в работе сокращений 100
8.Список литературы
- Патогенез гипоксической формы легочной гипертензии
- Влияние эстрадиола на проявление монокроталиновой и блеомициновой моделей легочной гипертензии
- Проведение острого физиологического эксперимента для регистрации гемодинамических параметров и их реакции на введение вазоактивных веществ с использованием имплантируемых катетеров in vivo
- Влияние хронической гипоксии на уровень содержания эстрадиола в плазме крови самок крыс
Патогенез гипоксической формы легочной гипертензии
Легочная гипертензия – заболевание, патогенез которого до сих пор однозначно не определен. Имеющиеся классификации не всегда отражают причины возникновения исследуемого заболевания, однако, свидетельствуют о состояниях разных органов и систем, ассоциированных с исследуемым заболеванием.
У людей, страдающих наследственной формой легочной артериальной гипертензии, в 70 % случаев диагностируются мутации в гене, кодирующем рецептор 2 типа к костному морфогенетическому белку (BMPR2). При измененной функции рецептора к BMPR2 происходит неконтролируемая пролиферация гладкомышечных клеток легочных сосудов. Дальнейшая облитерация легочных сосудов ведет к увеличению внутрисосудистого сопротивления, что говорит о развивающейся легочной артериальной гипертензии (Morrell N.W. и др., 2001). Однако, ввиду того, что данная мутация обладает неполной пенетрантностью (мутировавшие аллели гена фенотипически проявляются в 20 % всей родственной популяции), наследственная легочная гипертензия, не проявляясь, может передаваться через несколько поколений (Sztrymf B. и др.,2007). Кроме того, производят оценку мутации генов рецепторов, относящихся к семейству рецепторов трансформирующих ростовых факторов бета (TGF-) : рецептору типа 2 активинподобной киназы-1(ALK1 – activin receptor kinase-1) и эндолгину (endolgin). Данные рецепторы также участвуют в каскадах, ведущих к пролиферации клеток сосудов (Lebrin F. и др., 2004). Ряд исследователей отмечали ассоциацию мутации оцениваемых рецепторов с наследственной формой легочной гипертензии (Girerd B. и др., 2010; Malhotra R. и др.,2013).
Первичные и вторичные патологические изменения в сосудистой стенке, ведущие к неконтролируемой пролиферации клеток разных слоев сосуда и к сужению его просвета, тем самым к увеличению сосудистого сопротивления и к дальнейшему возможному развитию легочной артериальной гипертензии, наблюдаются при аутоиммунных заболеваниях соединительной ткани, в том числе при системной склеродермии, системной красной волчанке, рематоидном артрите и синдроме Шегрена (Mathai S.C., Hassoun P.M., 2012). Например, при наличии системной склеродермии, легочная артериальная гипертензия является сопутствующим заболеванием в 8-12 % случаев (Mukerjee D. и др., 2003; Hachulla E. и др., 2005).
Шистосомоз (бильгариоз) - заболевание, характерное для тропиков и вызываемое трематодами из рода Schistosoma, может приводить к сужению сосудов и увеличению внутрисосудистого сопротивления в разных артериях и венах организма человека, в том числе повышения сопротивления и, как следствие, давления, в системе воротной вены, что может приводить к возникновению портальной гипертензии. При шистосомозе не только яйца шистосом деформируют сосуды разных кругов кровообращения, но и образующееся воспаление после проникновения личинок через сосудистую стенку играет роль в патогенезе заболевания. В 7,7 % случаев у пациентов, страдающих бильгариозом, легочная артериальная гипертензия диагностируется, как сопутствующее заболевание (Lapa M. и др., 2009). Также легочная гипертензия может быть ассоциирована с портальной гипертензией в 2-6 % случаях выявленного повышенного давления в системе портальных вен (Rodrguez-Roisin R. и др., 2004).
Недостаточность левых отделов сердца может вести к повышению давления в этих отделах и обратной передаче повышенного давления по легочной вене в правый круг кровообращения, что может вызвать легочную гипертензию. Заболевания левых отделов сердца являются наиболее частым состоянием из всех, содержащихся в современной классификации (Таб.1), которому сопутствует патологическое увеличение артериального давления в правом кругу кровообращения, ведущее к возникновению легочной гипертензии (Schmeisser A., Schroetter H., Braun-Dulleaus., R. C., 2013; Oudiz RJ., 2007).
Последствием острых состояний, таких, как тромбоэмболия легочной артерии, также может стать легочная гипертензия, а точнее хроническая тромбоэмболическая легочная гипертензия (Таб.1). Происходит хроническое накопление тромбоэмболических наложений внутри ветвей легочной артерии, приводящее к сужению просвета этих сосудов. Последующая обструкция стенок артерий увеличивает сопротивление сосудов, повышается давление в легочной артерии и растет постнагрузка на правый желудочек (Лапина Т.В., Вишневский А.А., 2007).
Помимо патологических состояний, с которыми может быть ассоциировано исследуемое заболевание, отдельной группой выделено влияние медикаментов и различных токсинов , которые могут потенциально способствовать развитию легочной артериальной гипертензии. В зависимости от количества собранных статистических данных эти факторы разделены на 4 группы (Таб.2).
Токсичное (St John s wort, селективные Курение рапсовое масло ингибиторы обратного захватасеротонина)Химиотерапия Одной из мало исследованных групп легочной гипертензии, выделенной еще в 1998 году на 2 Всемирном совещании в городе Эвиан (Франция), является группа, в которую входит гипертензия сосудов малого круга кровообращения, обусловленная различными патологиями легких. Обструктивные и рестриктивные заболевания легких, как в острой, так и в хронической форме, интерстициальные заболевания легочной системы, а также нарушения дыхания во время сна или же патологии развития дыхательной системы являются состояниями, которым может сопутствовать легочная артериальная гипертензия (Чучалин А. Г., 1999). При этих различных патологиях альвеолярная гипоксия, в основном, является причиной возникновения легочной гипертензии (Chaouat A. и др., 2005; Chaouat A., Naeije R., Weitzenblum E., 2008). Патологии дыхательной системы – достаточно распространенные состояния в современном мире. Например, хронической обструктивной болезнью легких страдают от от 4- 6 % до 10-25 % взрослого населения (Лещенко И. В., Овчаренко С.И., 2003). Однако, патогенез гипоксической формы легочной гипертензии, которая наиболее часто ассоциирована с ними, до сих пор до конца не изучен.
Гипоксия – патологический процесс, возникающий вследствие кислородного голодания клеток. Это состояние, в которое могут быть вовлечены как отдельные ткани и органы, так и весь организм целиком. Помимо патологий в дыхательной системе, гипоксия также может являться результатом нарушения транспорта кислорода из крови в ткани, нарушения способности тканей эффективно использовать кислород или же результатом снижения содержания кислорода во вдыхаемом воздухе (Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н., 2006).
Выделено 7 форм гипоксии, при которых основным механизмом повреждения является нарушение функции митохондриальных ферментных комплексов (Адо А.Д. и др., 2009).
Респираторная гипоксия – вид гипоксии, при котором происходит нарушение функций внешнего дыхания. Данное состояние носит системный характер, недостаточность газообмена в легких при различных (обструктивных и рестриктивных) формах дыхательной недостаточности приводит к гипоксии на организменном уровне. Патологии гуморальной и нервной регуляции дыхания, строения грудной клетки или же дыхательной мускулатуры также могут приводить к возникновению респираторной гипоксии. При данном виде гипоксии характерным диагностическим признаком может служить уменьшение содержания кислорода как в артериальной, так и в венозной крови. В ряде случаев ограничению дыхания соответствует появление гиперкапнии и гипоксиемии (Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н., 2006).
Для циркуляторной гипоксии характерно сохранение уровня кислорода в артериальной крови на неизменном уровне, однако в венозной крови при лабораторном исследовании отмечают снижения уровня кислорода. Данный вид гипоксии возникает после снижения артериального давления и минутного объема крови, ведущих к уменьшению кровоснабжения большинства внутренних органов. Местная циркуляторная гипоксия может вести к таким патологиям, как болезни периферических артерий и ишемический инсульт, а причиной вышеописанных явлений могут быть атеросклеротических изменения сосудов на местном уровне и сужения их просвета. В основе патогенеза кардиомиопатий, ДВС – синдрома, вазогенного, гиповолемического и кардиогенного шоков лежит общая циркуляторная гипоксия (Ашмарин И.П. и др.,2005).
Гемическая гипоксия возникает, когда уменьшается способность гемоглобина связывать кислород и снижается максимально возможное содержание кислорода в крови. Первое состояние может возникнуть при связывании оксида углерода с гемоглобином, в результате чего образуется соединение карбоксигемоглобин. Последний не может связываться с кислородом, таким образом, смертельно уменьшая его транспортировку к тканям. Такими же свойствами обладает метгемоглобин, который образуется в результате воздействия на организм различных, в том числе и лекарственных (например, сульфаниламиды), веществ и также, как и карбоксигемоглобин, не может переносить кислород из крови в ткани. Не только уменьшение уровня гемоглобина в крови из-за его необратимого связывания может стать причиной возникновения гипоксии крови, но и такие гемоглобинопатии, как серповидноклеточная анемия и талассемии, берущие начало на генном уровне, могут служить причиной исследуемой патологии. Нарушения, характеризующиеся уменьшением количества кислорода в крови, могут быть проявлением эритропении. При этом заболевании снижается снижает количество эритроцитов в единице объема крови вследствие того, что увеличивается гемолиз эритроцитов,а интенсивность кроветворной функции костного мозга становится ниже физиологического уровня, уменьшается выброс эритропоэтина (Окороков А.И., 2002).
Конечный фермент дыхательной цепи – цитохромоксидаза, инактивируется цианидами, что приводит к потере способности клетки утилизировать кислород. Ввиду невозможности клетки утилизировать кислород ферментами митохондрий, то есть наличия в одном из первичных звеньев дыхания патологии, можно говорить о первичнотканевой (цитотоксической) гипоксии. При данной патологии в артериальной крови наблюдается нормальное содержание кислорода, а в венозной возрастает его концентрация (Шанин В.Ю., 1998).
Влияние эстрадиола на проявление монокроталиновой и блеомициновой моделей легочной гипертензии
Билатеральная овариэктомия — удаление яичников с обеих сторон. Данное хирургическое вмешательство проводили под анестезией тиапенталом натрия (40 мкг/кг, внутрибрюшинно) у экспериментальных животных, достигших двухмесячного возраста и относящихся к соответствующим группам. Операцию выполняли в условиях, максимально приближенных к стерильным – операционное поле, предварительно побритое триммером для стрижки животных, и стол для проведения хирургического вмешательства обрабатывали 75 % спиртовым раствором, инструменты содержали в спиртово-йодном растворе. Животное раскладывали спиной вверх, лапки крепили к столу пластырем. Доступ к яичникам производили с дорсальной поверхности тела животного. Делали разрез кожного покрова длинной 1,5-2 см, ориентирами служили проекция позвоночного столба по вертикали и середина расстояния от последних реберных дуг животного до тазовых костей по горизонтали. Далее маленькими хирургическими ножницами аккуратно отделяли кожный покров от мышц по горизонтальной линии от разреза в сторону на 1-1,5 см, тем самым осуществляя доступ к точке проекции яичников. Далее, после визуальной оценки, выявляли скопление жира, который начинался примерно через 0,5 см от позвоночного столба по вышеописанной горизонтальной линии, под мышечным слоем. И, отступив от начала жирового прослойки максимум на 0,5 см, осуществляли прокол мышечного слоя и проникали в брюшную полость.
Далее пинцетом через отверстие захватывали жировую ткань светло-белого цвета и легко вытягивали из брюшной полости. Вместе с жировой тканью через отверстие выводили спаянные с ней трубу и яичник. На 0,3 см от места соединения яичника на трубу накладывали лигатуру и отрезали яичник. Далее сушили место ампутации и трубу заправляли обратно в брюшную полость через место прокола, которое зашивали одним швом. После проведения вышеописанного вмешательства с обеих сторон, то есть удаления обоих яичников, пространство между кожным и мышечным покровом санировали, края кожного разреза сопоставляли и зашивали 4-6 швами. Полученный шов обрабатывали йодом. Гипоэстрогению изучали как отдельное состояние организма, так и в сочетании с введением разных доз женского полового гормона эстрадиола. Использовали экзогенный эстрадиол идентичный по своим свойствам эндогенному, вырабатываемому яичниками. Синтетический эстрадиол растворяли в пропиленгликоле (пропан-1,2-диол). Сначала вводили 5 мкг/кг и 15 мкг/кг в день в течение 21 дня подкожно в холку животного. После анализа содержания эстрадиола в организме животного по косвенному признаку-массе матки, выяснили, что данная схема введения синтетического эстрадиола не позволяет воспроизвести физиологический уровень женского полового гормона. Поэтому далее схема изменилась следующим образом: время введения составляло 28 дней, а дозы, использовавшиеся в эксперименте, были 15 и 60 мкг/кг каждый день. Также в сочетании с вводимым эстрадиолом и отдельно использовали блокатор мембранных и ядерных эстрогеновых рецепторов типа альфа и бетта ICI 182,780 (Фулвестрант), растворенный в пропилегликоле, в дозе 150 мкг/кг в день, введение которого также проводили в течение 28 дней.
Принцип плетизмографического метода измерения систолического артериального давления в хвостовой артерии крысы соответствует измерению артериального давления у человека методом Рива-Роччи (Feng M. и др., 2008). Измерение систолического давления у экспериментальных животных во всех сериях исследования проводили 1 раз в неделю. Причем, 2 раза измеряли СистАД перед распределением животных в группы, а в дальнейшем по ходу эксперимента каждую неделю. Перед регистрацией проводили нагревание животного в течение 5-10 мин. Далее животное помещали в плексигласовый домик. На хвост, выведенный наружу, одевали манжетку, следом за ней крепили датчик. Регистрацию СистАД проводили с помощью АЦП ( L-Card) с последующей записью на компьютере. Измерение СистАД проводили от 5 до 10 раз и вычисляли значение величины систолического артериального давления у экспериментальной крысы. Модифицированную программу BioShell (Мурашев A. H., Медведев О. С., Давыдова С. A.,1997) использовалаи в данных экспериментах для регистрации и обработки данных. Частота оцифровки сигнала составляла 512 Гц.
С целью определения содержания эритроцитов и концентрации гемоглобина, а далее расчета уровня гематокрита, производили забор образцов крови у исследуемых самок крыс за сутки до окончания воздействия гипоксии после измерения систолического артериального давления непрямым методом (методика описана выше). Надрезали конец хвоста животного и проводили тремя пальцами от основания хвоста к его кончику без нажима в том случае, если материал для исследования было недостаточно. Кровь в объеме 50 мкл собирали в пробирки Microvette 500 с антикоагулянтом – К3ЭДТА (Starstetd, Germany). Исследование производили на автоматическом гематологическом ветеринарном анализаторе “Гемалайт -1280вет” (“Диксион”, Россия). Принцип определения содержания эритроцитов основан на измерении разности электрического сопротивления, возникающего при прохождении клеток образцов экспериментальных животных через датчик апертуры. Количество красных клеток крови (эритроцитов, RBC) определялось в микропроцессоре прибора, окончательные данные измерения представлялись автоматически. Концентрацию гемоглобина измеряли следующим образом. Добавляли лизирующий раствор в пробу крови, вследствие чего эритроциты быстро выпадали в осадок и происходило освобождение гемоглобина. Клетки лизирующего агента и гемоглобин образовывали смесь, способную поглощать свет с длиной волны 540 нм. Далее производили измерение количества поглощенного света образовавшейся смесью, а также, отдельно, чистым растворителем. Полученные данные сравнивали друг с другом и рассчитывали концентрацию гемоглобина в пробе крови экспериментального животного. Расчет уровня гематокрита (%) производили по формуле : RBC х MCV / 10, где MCV – это средний объем эритроцита, автоматически полученный при определении количества RBC.
Метод записи гемодинамических параметров с использованием имплантируемых катетеров in vivo включал в себя непрерывную регистрацию параметров сердечно-сосудистой системы, таких как системное артериальное давление (САД), среднее правожелудочковое давление (СПЖД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС), у наркотизированых экспериментальных животных. Для чего под уретановым наркозом (1,2 г/кг, внутрибрюшинно) в бедренную артерию и правый желудочек через яремную вену вводили катетеры. А также, для последующего введения вазоактивных веществ, вживляли катетер в бедренную вену (Рис.10). Бедренные катетеры изготавливали заранее из полиэтиленовых трубочек : толстой PE-50 (наружный диаметр 1 мм, внутренний диаметр 0,6 мм) и более тонкой PE-10 (наружный диаметр 0,6 мм, внутренний диаметр 0,3 мм). Отрезок более толстой трубочки в катетере для артерии представлял собой всей длины полученного катетера, в сравнении с для вены. Катетер для имплантации в правый желудочек представлял собой кусочек трубочки PE-50 с чуть загнутым концом, который загибали пинцетом и опускали сначала в чашку с горячей водой, потом –с холодной .
Для герметичного соединения двух трубочек, их надевали на тонкую проволоку и нагревали над струей воздуха, идущего от горячего паяльника. Когда края двух трубочек начинали плавиться, их соединяли вместе и крепко зажимали двумя пальцами. Получившийся катетер проверяли на герметичное соединение двух его частей: набирали в шприц дистиллированной воды, закрывали один конец катетера зажимом, а во второй через иголку шприца вводили жидкость, которая заполняла катетер и не вытекала наружу через место спайки. Установка для регистрации гемодинамических параметров прямым методом посредством имплантируемых катетеров состоит из двух датчиков давления, (отдельно для снятия данных по давлению в бедренной артерии и в сердце) (Statham USA); усилитель потенциалов; аналого-цифровой преобразователь (L-Card, модель E 14-140) и компьютер, на который записывали зарегистрированные параметры. Данные каждой крысы хранили в отдельных файлах. Для регистрации и обработки данных использовалась модифицированная программа BioShell (Мурашев A. H., Медведев О. С., Давыдова С. A.,1997) с частотой оцифровки сигнала составляла 512 Гц. Датчики, используемые для регистрации среднего системного давления и систолического давления в правом желудочке, калибровали системой, состоящей из ртутного манометра для измерения давления, резиновой груши и буферной емкости. Острый физиологический эксперимент начинали с катетеризации бедренной вены. Наркотизированное животное размещали на операционном столике спинкой вниз. На внутренней стороне бедра выщипывали шерсть, далее делали разрез 3-4 см кожного покрова. Стеклянными крючками аккуратно отделяли вену, под нее подводили пинцет, который перекрывал кровоток браншами. Под пинцет подводили лигатуру и, не завязывая крепко, размещали ближе к медиальному концу выделенной части сосуда. Ножницами делали разрез на сосуде, вводили катетер на глубину 1,5-2 см, лигатуру, обхватывающую сосуд и находящийся в нем катетер, крепко завязывали. Далее производили катетеризацию артерии по подобной методике. Отличия состояли в следующем : количество лигатур выросло до 3 штук, и они располагались: две на медиальном конце выделенной бедренной артерии и одна на латеральном; катетер использовали специальный для артерии; глубина проникновения катетера в сосуд составляла 6-7 см. После имплантации катетеров в бедренные вену и артерию производили присоединение дистальных концов катетеров к установке для регистрации САД и ЧСС. И, под контролем данных параметров, производили проведение катетера в правый желудочек сердца через яремную вену. Для этого над правой ключицей экспериментальной крысы выщипывали шерсть, делали разрез 1 см параллельно вертикальной оси животного, латеральнее от места проекции трахеи на 1,5 см. Стеклянными крючками аккуратно разделяли жировую ткань и мышечный слой, определяли яремную вену, дифференциальным отличием которой служило ее дальнейшее расположение под ключицу. После выделения из окружающих тканей, под нее продевали пинцет, бранши которого перекрывали кровоток. Под бранши продевали три лигатуры. Первой перевязывали конец выделенного сосуда, наиболее отдаленный от сердца. Две остальные оставляли не завязанными на противоположном конце. Ножницами делали разрез стенки сосуда посередине выделенного участка. Далее вставляли сердечный катетер в отверстие на сосуде и вводили под ключицу, приподнимая вверх сосуд за не завязанные лигатуры. Как только катетер проходил под ключицу, одну из лигатур не туго завязывали, последнюю оставляли не закрепленной. Дальнейшее движения катетера внутрь осуществляли медленным движением, направляя трубочку левее, к сердцу. Появлявшееся биение катетера, ощущавшееся рукой, говорило о том, что он находится в правом предсердии экспериментального животного. Немного затрудненное прохождение катетера в последние 0,5 см свидетельствует о прохождении его через сердечный клапан и проникновении в правый желудочек сердца. В конце оперативного вмешательства две лигатуры, находящиеся ближе сердцу на выделенном отрезке яремной вены, крепко затягивали, не травмируя и не перетягивая сосуд и находящийся в нем катетер. На места имплатации катетеров крепили вату, смоченную физиологическим раствором.
Проведение острого физиологического эксперимента для регистрации гемодинамических параметров и их реакции на введение вазоактивных веществ с использованием имплантируемых катетеров in vivo
Было показано, что при хроническом введении эстрадиола в дозах 15 и 60 мкг/кг овариэктомированным самкам крыс , содержащимся в условиях нормального уровня кислорода (Ов/ Е2 – 15 не Гип и Ов/ Е2 – 60 не Гип) , не наблюдали увеличения систолического давления в правом желудочке в сравнении с группой контроля, получавшей растворитель (Ов/ к не Гип), которое составляло 45,1 ± 1,1 , 44,2 ± 1,6 и 44,1±0,7 мм рт.ст., n = 8 , n = 8 и n = 7, соответственно. Полученные данные говорят о том, что введение эстрадиола в нормоксических условиях не влияло на величину систолического артериального давления в правом желудочке сердца (Рис.15).
Проведение сравнения систолического давления в правом желудочке у нормоксических овариэктомированных животных, получавших эстрадиол в разных дозах, и групп овариэктомированных крыс, получавших аналогичные вещества, но подвергавшихся действию гипоксии в течение 2 последних недель инъекций, выявило достоверное увеличение исследуемого параметра в гипоксических группах (Ов/ Е2 – 15 и Ов/ Е2 – 60 vs Ов/ Е2 – 15 не Гип и Ов/ Е2 – 60 не Гип ; 54,8 ± 1,2 и 52,8 ± 1,4 vs 45,1 ± 1,1 и 44,2 ± 1 мм рт.ст., n = 9 и n = 10 vs n = 8 и n = 8, cоответственно, p 0,001 и p 0,01) (Рис.15). При сравнении двух контрольных групп, получавших растворитель и подвергавшихся гипоксии (Ов/ к ) или содержавшихся в нормальных условиях (Ов/ к не Гип), отличий не обнаружили (44,1±0,7 и 46,3±1,4 мм рт.ст.,
Рисунок № 15. Величина систолического артериального давления в правом желудочке сердца овариэктомированных самок крыс популяции Wistar, подвергавшихся воздействию хронической гипоксии в течение 2 недель и введению эстрадиола в дозах 15 и 60 мкг/кг в день (Ов/ Е2 – 15 и Ов/ Е2- 60) , а также крыс, содержавшихся в нормальных условиях и также получавших эстрадиол в дозах 15 и 60 мкг/кг в день (Ов/ Е2 – 15 не Гип и Ов/ Е2- 60 не Гип). Группы овариэктомированного гипоксического и нормоксического контролей , получавших растворитель : Ов/к и Ов/к не Гип. @- достоверное увеличение систолического артериального давления в правом желудочке в Ов/ Е2 – 15 в сравнении с Ов/к (p 0,01); - достоверное увеличение систолического артериального давления в правом желудочке в Ов/ Е2 – 15 в сравнении с Ов/ Е2 – 15 не Гип (p 0,001);# - достоверное увеличение систолического артериального давления в правом желудочке в Ов/ Е2 – 60 в сравнении с Ов/к (p 0,05): -достоверное увеличение систолического артериального давления в правом желудочке в Ов/ Е2 – 60 в сравнении с группой Ов/ Е2 – 60 не Гип (p 0,01).
Таким образом, вводимый в течение 28 дней экзогенный эстрадиол овариэктомированным самкам крыс в дозах 15 и 60 мкг на кг в сочетании с двухнедельной гипоксией (Ов/ Е2 – 15 и Ов/ Е2 – 60) приводит к увеличению систолического давления в правом желудочке на 21,5 % и на 19 % в сравнении с овариэктомированными крысами, получавшими те же дозы эстрадиола, но содержавшихся в нормальных условиях (Ов/ Е2 – 15 не Гип и Ов/ Е2 – 60 не Гип). Между группами контроля, подвергавшихся гипоксии (Ов/ к ) и содержавшихся в нормальных условиях (Ов/ к не Гип), отличий не обнаружили. Исходя из полученных в этой серии данных по изменению величины СПЖД, можно было бы говорить о том, что хроническое введение эстрадиола в сочетании с хроническим гипоксическим воздействием способствует развитию гипоксической формы легочной гипертензии у овариэктомированных самок крыс популяции Wistar, а эстрадиол, вводимый в условиях нормоксии, не вызывает развитие исследуемого заболевания.
При изучении другого симптома развития ЛГ было выявлено достоверное увеличение относительного веса правого желудочка у групп овариэктомированных крыс, получаших эстрадиол и подвергавшихся действию гипоксии в сравнении с крысами, получавшими аналогичные дозы женского полового гормона и содержавшиеся в условиях с нормальным содержанием кислорода (Ов/ Е2 – 15 не Гип и Ов/ Е2 – 60 не Гип) на 18 % и 15 % (Таб.5).
Таблица № 5. Данные по индексу веса правого желудочка крыс, получавших эстрадиол в разных дозах и содержавшихся в условиях гипоксии и нормоксии. Экспериментальные группы Относительный вес правого желудочка (ПЖ/вес животного 10000) - достоверное отличие от Ов/ к не Гип (p 0,01), # - достоверное отличие от Ов/ Е2 – 15 не Гип (p 0,01), @ - достоверное отличие от Ов/ Е2 – 60 не Гип (p 0,05), $ - достоверное отличие от Ов/ к не Гип (p 0,05), &- достоверное отличие от Ов/к (p 0,05). Расшифровка групп в таблице соответствует группам на рисунке № 15. При анализе двух контрольных групп овариэктомированных самок крыс, содержавшихся в разных условиях, выявили, что относительный вес правого желудочка достоверно вырос в группе крыс , подвергавшихся хроническому гипоксическому воздействию и составил 5,3 ± 0,19 vs 4,5 ±0,11 (n = 8 vs n = 7, p 0,01) (Таб.5). Также выявили достоверное увеличение исследуемого параметра в гипоксических группах, получавший эстрадиол, в сравнении с их собственным нормоксическим контролем (Ов/ Е2 – 15 vs Ов/ Е2 – 15 не Гип, p 0,01; Ов/ Е2 – 60 vs Ов/ Е2 – 60 не Гип, p 0,05). При действии гипоксии эстрадиол в дозе 15 мкг/кг увеличивает относительный вес правого желудочка в сравнении с контрольными гипоксическими крысами (Ов/ к vs Ов/ Е2 – 15, p 0,05). На основании полученных данных можно говорить , что гипоксия не зависимо от вводимых веществ увеличивает исследуемый параметр, а хронически поступающий в организм овариэктомированных самок крыс эстрадиол в наименьшей дозе (15мкг/кг) под действием гипоксии увеличивает относительный вес правого желудочка в сравнении с их гипоксическим контролем (Таб.5).
.Влияние хронического введения эстрадиола овариэктомированным самкам при условиях гипоксии и нормоксии на массу матки животных.
При сравнении групп крыс, содержавшихся в условиях нормоксии, выявили, что эстрадиол, вводимый овариэктомированным самкам крыс ежедневно в течение 28 дней, достоверно увеличивал массу матки в дозах 15 и 60 мкг/кг в день в сравнении с группой контроля, которая получала растворитель (315 ± 18 и 339 ± 13 vs 154 ± 25 мг, n=8 и n=8 vs n = 7 , p 0,01 и p 0,01) . Оценивая массу матки у овариэктомированных групп крыс, подвергашихся действию гипоксии и получавших эстрадиол в дозах 15 и 60 мкг/кг , выявили достоверное увеличение исследуемого параметра в группах, получавших эстрадиол в сравнении с группой контроля, которое составило 298 ±22 и 334 ± 19 vs 188 ± 16 мг, n=9 и n=10 vs n = 8, p 0,01 и p 0,01. Гипоксия не влияла на массу матки в группах, получавших эстрадиол в одинаковых дозах (Рис.16) .
Влияние хронической гипоксии на уровень содержания эстрадиола в плазме крови самок крыс
Проводя эксперименты по перфузии ацетилхолином в возрастающих концентрациях от 10-9 до 10-5 М изолированного сегмента подколенной артерии групп, подвергавшихся гипоксии и хронически получавших инъекции эстрадиола в дозе 15 мкг/кг, и контроля отметили достоверное увеличение сосудорасширительной реакции на перфузию концентрацией ацетилхолина (10-5 М) в группе, получавшей эстрадиол в дозе 15 мкг/кг, по сравнению с контролем (Ов/ Е2- 15 и Ов/к, - 58,5 ± 5,1 vs - 88,2 ± 9 %, дельта , n=10 и n= 12, р 0,05) (Рис.30).
На основании полученных данных можно говорить о том, что при перфузии ацетилхолином изолированного сегмента легочного сосуда наблюдалась тенденция к уменьшению эндотелий-зависимого расширения в группе гипоксических животных, хронически принимавших эстрадиол. В то время, как при перфузии изолированных подколенных артерий исследуемых групп выявили достоверное увеличение реакции на перфузию ацетилхолином в дозе 10-5 М у групп овариэктомированных гипоксических самок крыс, получавших эстрадиол в дозе 15 мкг/кг, на 51 % в сравнении с контролем. (Ов/ Е2- 15 и
Рисунок № 30. Доза-зависимая реакция изолированного сегмента подколенной артерии на перфузию ацетилхолином в возрастающих концентрациях у овариэктомированных группы контроля и животных, хронически получавших эстрадиол в дозе 15 мкг/кг (Ов/к, черная линия, и Ов/ Е2- 15,красная линия). - достоверное увеличение в группе Ов/ Е2- 15 vs Ов/к при перфузии ацетилхолином в концентрации 10-5 М (р 0,05).
Таким образом, хронически вводимый эстрадиол в дозе 15 мкг/кг потенциирует увеличение сосудорасширительной реакции изолированной подколенной артерии овариэктомированных гипоксических самок крыс на ацетилхолин в концентрации 10-5 М в сравнении с группой гипоксического контроля.. Однако, при перфузии легочной артерии 3-его порядка наблюдали тенденцию к обратному эффекту: уменьшению сосудорасширительной реакции в ответ на ацетилхолин после хронического применения экзогенного эстрадиола овариэктомированным гтпоксическим самкам по сравнению с гипоксическим контролем. То есть наблюдали разнонаправленный эффект хронического применения эстрадиола на реактивность изолированных сосудов большого и малого круга кровообращения у овариэктомированных гипоксических самок крыс популяции Wistar.
Дозо-зависимая реакция на эстрадиол сосудов овариэктомированных крыс популяции Wistar, хронически получавших эстрадиол в дозе 15 мкг/кг в сочетании с хронической гипоксией.
При перфузии изолированных сосудов эстрадиолом (в возрастающих концентрациях 10-7, 3 10-6 , 10-6, 10-5М), который вызывает эндотелий-зависимое расширение сосудов, было выявлено различие в реактивности сосудов малого и большого круга кровообращения между группами овариэктомированных гипоксических самок крыс, хронически получавшими эстрадиол и группой гипоксического контроля (Рис.31).
Дозо-зависимая реакции легочных сосудов 3-его порядка на перфузию эстрадиолом в возрастающих концентрациях у овариэктомированных групп, получавшей эстрадиол в дозе 15 мкг/кг и контрольной,подвергавшихся гипоксии (Ов/ Е2- 15,красная линия, и Ов/к, черная линия). - достоверное уменьшение в группе Ов/ Е2- 15 vs Ов/к при перфузии эстрадиолом в концентрации 3 10-6 М (р 0,05).
Перфузия возрастающими концентрациями эстрадиола легочной артерии 3-его порядка у группы овариэктомированных гипоксических самок крыс, хронически получавших эстрадиол, вызывала достоверное уменьшение этой реакции при концентрации эстрадиола 3 10-6 по сравнению с гипоксическим контролем, которое составило 56% (- 20,6 ± 7,3 vs -46,6 ± 7,3, дельта%, n=10 и n=7, р 0,05) (Рис.31).
При других концентрациях эстрадиола достоверных отличий между исследуемыми группами обнаружено не было, однако надо отметить, что наблюдалась тенденция к уменьшению реакции на перфузию эстрадиолом в концентрациях 10-6, 10-5М у овариэктомированной гипоксической группы крыс, получавшей экзогенно хронически эстрадиол в дозе 15 мкг/кг, в сравнении с группой гипоксического контроля.
При перфузии возрастающими концентрациями эстрадиола изолированного сегмента подколенной артерии наблюдали увеличение реакции при концентрации 10-5М у группы, хронически получавшей эстрадиол, в сравнении с гипоксическим контролем, ( -78 ± 7,6 vs 49,5
Рисунок № 32. Дозо-зависимая реакция подколенной артерии на перфузию эстрадиолом в возрастающих концентрациях у овариэктомированных гипоксических контрольной группы и животных, хронически получавших эстрадиол в дозе 15 мкг/кг(Ов/к, черная линия, и Ов/ Е2-15,красная линия). - достоверное увеличение в группе Ов/ Е2- 15 vs Ов/к при перфузии эстрадиолом в концентрации 10-5 М (р 0,05). .
Таким образом, хроническое применение эстрадиола на фоне двухнедельной гипоксии наряду с появлением легочной гипертонии у этих животных вызывает разнонаправленное изменение реактивности сосудов малого и большого круга кровообращения на эстрадиол, что наблюдается при перфузии изолированных сегментов сосудов. В легочных сосудах наблюдается уменьшение эндотелий-зависимого расширения на эстрадиол, а в сосудах большого круга кровообращения – потенциирование этой реакции, что может являться одной из причин разнонаправленного изменения системных реакций артериального давления.
Диагностическими признаками легочной гипертензии являются увеличение систолического давления в правом желудочке и гипертрофия правых отделов сердца. Несмотря на наличие большого количества неинвазивных методов, например, компьютерной томографии и магнитно-ядерного резонанса, которые по совокупности позволяют судить о наличии ЛГ (Kreitner K.F., 2014), “золотым стандартом” установления наличия заболевания у людей является инвазивный и достаточно травматичный метод: катетеризация правого желудочка с дальнейшей оценкой давления внутри него в покое и при физической нагрузке (Schannwell C.M., Steiner S., Strauer B.E., 2007; Kovacs G. и др., 2009).
Тяжесть поражения малого круга кровообращения при моделировании разных форм легочной гипертензии у крыс , как и у людей, однозначно определяется путем измерения давления внутри правого желудочка. Исследование дополняет определение индекса относительного веса правого желудочка, то есть посмертная оценка веса последнего относительно всего сердца, части его отделов или веса экспериментального животного (индекс ПЖ) (Umar S. и др., 2011; Lahm T. и др., 2012).
В настоящем исследовании при моделировании гипоксической формы легочной гипертензии самкам крыс популяции Wistar, путем их периодического помещения в условия гипобарической гипоксии (5000 м над уровнем моря, содержание кислорода – 10 %) в течение 14 дней (McCulloch K.M., Docherty C., MacLean M.R., 1998), выявили увеличение систолического давления в правом желудочке и относительного веса правого желудочка сердца у экспериментальных крыс в сравнении с их возрастным контролем (Ковалева Ю.О. и др., 2012). Зафиксированный факт соответствует литературным данным о моделировании гипоксической формы легочной гипертензии и патологических изменениях, характеризующих данное заболевание (Toba M. и др., 2014). Согласно существующим литературным данным самый активный из женских половых гормонов эстрадиол способен оказывать протективное действие на сердечно-сосудистую систему человека и животных, запуская эндотелий-зависимые каскады через мембранные рецепторы, что приводит к расслаблению гладкомышечных клеток, расширению сосудов и уменьшению сосудистого сопротивления (Chakrabarti S., Morton J.S., Davidge S.T., 2013).Исходя из этого, мы предположили, что при предварительном удалении основного источника эндогенного эстрадиола – яичников, степень заболевания моделируемой ГФЛГ у самок крыс должна увеличиться. Овариэктомия при других формах ЛГ приводила к ухудшению состояния экспериментальных животных (Tofovic S.P., 2010). Однако, у гипоксических овариэктомированных самок крыс произошло как уменьшение СПЖД, так и уменьшение индекса ПЖ, в сравнении с их овариэктомированным нормоксическим контролем (Ковалева Ю.О. и др., 2012). Выявленный факт говорит о том, что эстрадиол не только не оказывает протективного эффекта, как ожидалось, но и демонстрирует обратное, негативное воздействие на степень развития гипоксической формы легочной гипертензии. Данных по комплексной оценке развития гипоксической формы легочной гипертензии, то есть оценке ее как по СПЖД, так и по индексу ПЖ, и связи их с влиянием эстрадиола у самок крыс в литературе мало. Более десяти лет назад исследователи выявили, что эстрадиол оказывает протективное влияние на организм самки крысы при моделировании гипоксической формы легочной гипертензии на основании того, что овариэктомия при ГФЛГ увеличивала индекс ПЖ. Однако, СПЖД у экспериментальных животных не измеряли (Resta T.C., Kanagy N.L., Walker B.R., 2001). Единственная работа, в которой исследователи выявляют протективные свойства Е2 относительно ГФЛГ и оценивают заболевание по наличию основных патологических изменений: увеличению СПЖД и индекса ПЖ, была проведена в 2013 году в Китае (Xu D. и др., 2013). Однако, модель гипобарической гипоксии, применяемой в этом случае, принципиально отличается от нашей: несмотря на аналогичный уровень содержания кислорода в камере – 10 %, продолжительность гипоксии составляла на 7 дней более (21 день), а также воздействие гипоксии было непрерывным. При нашей модели экспериментальные животные помещались в барокамеру на 10 часов в течение светового дня. Сравнивать данные, полученные при использовании разных способов воздействия гипоксии на экспериментальных животных, не представляется корректным.
Подбирая дозы введения экзогенного эстрадиола, мы ориентировались на наши данные об изменении содержания эстрадиола в плазме крови самок с ГФЛГ с сохраненными яичниками. Было показано, что у этих животных содержание эстрадиола возрастает в два раза (Ковалева Ю.О. и др., 2012). Хронически вводя разные дозы экзогенного эстрадиола, мы измеряли его содержание в плазме крови, Однако, фармакокинетика оказалась настолько сложной, что эти измерения не позволили нам корректно оценить изменение содержания эстрадиола в плазме крови экспериментальных животных. Поэтому качественным критерием оценки уровня содержания эстрадиола в организме овариэктомированных самок был выбран вес матки -основного органа-мишени действия этого гормона (Zhao Q. и др., 2013).
