Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1 Примеры создания новых ЛП на основе фармакологически активных метаболитов и их роль в реализации фармакологического эффекта 13
1.1.1 Блокаторы Н]-гистаминовых рецепторов 14
1.1.2 Препараты бензодиазепинового ряда 17
1.1.3 Ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента 19
1.2 Биотрансформация и фармакокинетика препаратов, содержащих морфолиновый цикл 21
1.2.1 Фармакологические свойства препаратов, содержащих морфолиновый цикл 21
1.2.2 Биотрансформация морфолинсодержащих ЛП 27
1.2.3 Фармакокинетика морфолинсодержащих ЛП 42
1.3 Липофильность - один из факторов, влияющих на проникновение лекарственных веществ в мозг 54
Экспериментальная часть 58
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 58
2.1 Материалы 58
2.1.1 Объекты исследования 58
2.1.2 Химические реактивы 59
2.1.3 Аналитическая аппаратура и средства измерений 60
2.1.3.1 Основные аналитические приборы 60
2.1.3.2 Вспомогательные устройства 60
2.1.4 Приготовление растворов для анализа 61
2.1.4.1 Приготовление концентрированных и рабочих стандартных растворов 61
2.1.4.2 Приготовление фосфатного буферного раствора (рН 7,4) 61
2.1.4.3 Приготовление подвижной фазы для хроматографического анализа биологических образцов животных
2.1.4.4 Приготовление буферного раствора для хромато-масс спектрометрического анализа 62
2.1.5 Экспериментальные животные 63
2.2 Методы 63
2.2.1 Введение препарата 63
2.2.2 Способ отбора крови, органов, мочи, кала, эмбрионов, плацент и молока 64
2.2.3 Условия масс-спектрометрического анализа соединения М-11 и его метаболитов в плазме крови крыс 65
2.2.4 Условия количественного определения М-11 и его метаболитов в плазме крови, органах и экскрементах животных с применением метода высокоэффективной жидкостной хроматографии 66
2.2.5 Обработка биологических проб, экстракция М-11 и его метаболитов из биологических образцов 67
2.2.5.1 Подготовка плазмы крови крыс к ВЭЖХ - анализу 67
2.2.5.2 Подготовка органов крыс к проведению хроматографического анализа 68
2.2.5.3 Подготовка мочи и кала крыс к хроматографическому анализу. 68
2.2.5.4 Подготовка эмбрионов, плацент и молока крыс к хроматографическому анализу 69
2.2.6 Построение калибровочных кривых 69
2.2.7 Метрологическая характеристика методик определения соединения М-11 и его основных метаболитов 71
2.2.8 Фармакокинетические параметры, используемые для интерпретации экспериментальных данных 73
2.2.9 Статистическая обработка полученных результатов 75
2.2.10 Условия определения коэффициента распределения афобазола и
соединения М-11 между органической и водной фазами 75
ГЛАВА 3. Биотрансформация соединения М-11
ГЛАВА 4. Фармакокинетика соединения М-11
4.1 Фармакокинетика соединения М-11 после его внутрибрюшинного введения крысам в дозе 25 мг/кг 94
4.2 Тканевая доступность соединения М-11 у крыс 103
4.3 Фармакокинетика соединения М-11 после перорального введения крысам в дозе 25 мг/кг 106
4.4 Абсолютная биодоступность соединения М-11 у крыс 109
4.5 Сравнительный анализ тканевой доступности афобазола и соединения М-11 111
ГЛАВА 5. Экскреция соединения м-11 и его метаболитов с мочой и калом крыс 119
Заключение 124
Выводы 126
Список литературы
- Препараты бензодиазепинового ряда
- Аналитическая аппаратура и средства измерений
- Обработка биологических проб, экстракция М-11 и его метаболитов из биологических образцов
- Фармакокинетика соединения М-11 после перорального введения крысам в дозе 25 мг/кг
Введение к работе
Актуальность проблемы
В современной психофармакологии важной является проблема создания селективных анксиолитиков, сходных по противотревожным свойствам с бензодиазепинами, и при этом не обладающих их гипноседативными, миорелаксантными, амнестическими эффектами, не вызывающих зависимости и синдрома отмены (Середенин С. Б. с соавт., 1998, Briley М., Nutt D.J., 2000). Итогом фундаментальных исследований генетических различий в действии типичных транквилизаторов и анализе механизмов диссоциации их анксиолитического и седативного влияния явился целенаправленный синтез соединения с селективными анксиолитическими свойствами 5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио]-бензимидазола дигидрохлорида, получившего название афобазол (Середенин С. Б. с соавт., 1998, Seredenin S.B., 2003).
Изучена фармакокинетика нового селективного анксиолитика афобазола у крыс (Виглинская А.О., 2007). Установлено, что при различных путях введения афобазол интенсивно биотрансформируется и уже в первые минуты в плазме крови и органах крыс регистрируются значительные концентрации его метаболитов. Неизмененный препарат и его метаболиты определяются в плазме крови и органах животных в течение 3-х часов. При этом показано, что основным продуктом биотрансформации афобазола является метаболит 11 (окисленный по морфолиновому кольцу).
Выявлено, что после введения крысам афобазол и его основной метаболит 11 характеризуются близкими значениями абсолютных величин тканевой доступности в мозге (Виглинская А.О. с соавт., 2010).
Основываясь на полученных данных, можно предположить, что в случае наличия фармакологической активности у метаболита 11, данное соединение внесет соответствующий вклад в реализацию фармакологических эффектов афобазола, а также может служить основой для создания нового оригинального лекарственного препарата.
В ФГБУ “НИИ фармакологии имени В.В. Закусова” РАМН синтезировано соединение М-11 2-[2-(3-оксоморфолин-4-ил)этилтио]-5-этоксибензимидазола гидрохлорид, ранее идентифицированное в качестве основного, активного метаболита афобазола и предложенное для дальнейшего фармакологического и фармакокинетического изучения (Середенин С. Б. с соавт., 2009).
В разработке оригинального лекарственного средства (ЛС) обязательным и необходимым этапом является экспериментальное изучение его фармакокинетики и метаболизма (Жердев В.П., Литвин А.А, 2005, Хабриев Р.У., 2005).
Диссертация выполнена в соответствии с плановой темой НИР ФГБУ “НИИ фармакологии имени В.В. Закусова” РАМН “Изучение механизмов эндо- и экзогенной регуляции функций ЦНС, разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств”. (№ государственной регистрации 01. 2006 06601).
Целью работы явилось экспериментальное изучение биотрансформации и фармакокинетики соединения М-11 (основного активного метаболита афобазола).
Задачи исследования
-
Разработать высокочувствительный и селективный аналитический метод количественного определения соединения М-11 и его метаболитов в биологическом материале с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией.
-
Изучить биотрансформацию соединения М-11 в плазме крови крыс после его перорального и внутривенного введения.
-
Изучить фармакокинетику соединения М-11 в плазме крови и органах крыс после однократного внутрибрюшинного введения.
-
Изучить фармакокинетику соединения М-11 в плазме крови крыс после однократного внутривенного и перорального введения.
-
Определить абсолютную биологическую доступность соединения М-11.
-
Изучить фармакокинетику афобазола и соединения М-11 в системе “мать-плацента-плод”, молочных железах крыс и органах крысят, вскормленных самками, получавших афобазол.
-
Определить коэффициенты липофильности афобазола и соединения М-11 в системе гексан : вода.
-
Изучить экскрецию соединения М-11 и его метаболитов с мочой и калом в эксперименте.
-
По результатам проведенных исследований обосновать перспективу создания пероральной лекарственной формы на основе соединения М-11.
Научная новизна исследования
Впервые исследована биотрансформация и фармакокинетика соединения М-11 (основного активного метаболита афобазола) у крыс, рассчитаны основные фармакокинетические параметры. Обнаружено, что соединение М-11 подвергается слабо выраженной биотрансформации после его непосредственного введения экспериментальным животным по сравнению с афобазолом. По результатам масс-спектрального анализа и встречного химического синтеза были идентифицированы 3 метаболита соединения М-11. Метаболиты – гидроксилированный по алифатическому радикалу, гидроксилированный по бензимидазольному кольцу и сульфоксид соединения М-11 можно условно отнести к основным метаболитам, так как они регистрируются в наибольших количествах.
Соединение М-11 и его метаболиты определяются в плазме крови и органах животных в течение 3-х часов. В результате проведенного исследования установлено, что для соединения М-11 характерна более низкая степень проникновения в орган-мишень мозг и более высокая абсолютная биодоступность по сравнению с афобазолом. Установлено, что соединение М-11 по сравнению с афобазолом значительно интенсивнее проникает в органы и ткани крыс, о чем свидетельствуют величины площадей под фармакокинетической кривой и максимальных концентраций исследуемого соединения.
Практическая значимость исследования
На основании результатов, полученных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией, идентифицированы и синтезированы метаболиты соединения М-11. Полученное высокое значение абсолютной биодоступности подтверждает возможность создания лекарственных форм для перорального применения на основе соединения М-11. Фармакокинетические параметры, установленные в настоящей работе, могут быть использованы для дальнейшего фармакологического изучения соединения М-11.
В результате сравнительного анализа фармакокинетических параметров соединения М-11 и афобазола обоснована перспектива создания на основе изучаемого соединения таблетированной формы нового лекарственного препарата.
Личный вклад автора
Автором самостоятельно разработана методики количественного определения соединения М-11 в биоматериале, проведены исследования по изучению биотрансформации и фармакокинетики соединения М-11 у крыс после разных путей введения, обработаны результаты, сформулированы выводы. При непосредственном участии автора подготовлены публикации по результатам работы.
Положения, выносимые на защиту
-
Разработаны высокочувствительные и селективные методы количественного определения соединения М-11 в биологическом материале с использованием ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-МС/МС.
-
Соединение М-11 обладает более высокой абсолютной и тканевой биодоступностью по сравнению с афобазолом, кроме мозга. Соединение М-11 проникает в молоко кормящих самок крыс, а также через плацентарный барьер.
-
Соединение М-11 подвергается слабой биотрансформации по сравнению с афобазолом в организме крыс после различных путей введения.
-
Неизмененный препарат не определяется в экскрементах крыс.
-
Липофильность соединения М-11 ниже, чем у афобазола.
Апробация работы
Основные результаты работы доложены на: научно-практической конференции ”Достижения клинической фармакологии в России“ (Москва, 2009 г.), ежегодной конференции с международным участием “Фармация и общественное здоровье” (Екатеринбург, 2010 г.),V Международной конференции “Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам” (Москва, 2010 г.), XVI Всемирном съезде фармакологов (Копенгаген, 2010 г.), XI Региональном Конгрессе Европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Санкт-Петербург, 2011 г.), конференции в лаборатории фармакокинетики ФГБУ “НИИ фармакологии имени В.В. Закусова” РАМН (Москва, 2011 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликованы: 3 статьи - в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией, и 5 тезисов - в материалах российских и международных научных конференций. 1 статья принята в печать.
Объем и структура диссертации
Препараты бензодиазепинового ряда
Оптимальным направлением по улучшению профиля антигистаминньгх лекарственных препаратов явилось создание препаратов на основе фармакологически активных метаболитов препаратов второго поколения.
Классические Ні-антагонисты, или первое поколение антигистаминньгх препаратов, являются конкурентными блокаторами Ні-рецепторов, и потому связывание их с рецептором быстро и обратимо. В связи с этим для достижения основного фармакологического действия требуются высокие дозы таких антагонистов, при этом чаще и интенсивнее проявляются их нежелательные побочные эффекты. Кроме того, кратковременность действия требует частого применения препарата в течение суток [82].
Антигистаминные препараты первого поколения в терапевтических дозах оказывают блокирующее действие и на рецепторы других медиаторов, что объясняет спектр их нежелательных побочных эффектов - действие на сердечно-сосудистую систему (ССС), зрение, мочевыводящую систему, желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), центральную нервную систему (ЦНС) [171].
В силу приведенных выше аргументов возникла необходимость создания таких противогистаминных препаратов, которые имели бы высокое сродство к Hi-рецепторам и обладали бы высокой избирательной активностью, не затрагивая рецепторы других медиаторов. Эта цель была достигнута в конце семидесятых годов прошлого века созданием антагонистов Hi -рецепторов нового поколения, которые соответствовали заданным фармакологическим свойствам, надежно блокировали Нгрецепторы и могли быть использованы однократно в сутки. Многие Hi-антагонисты последнего поколения связываются с рецепторами неконкурентно.
Такие соединения с трудом вытесняются с рецептора, чем объясняется продолжительное действие таких препаратов. Препараты второго поколения не имеют побочных действий своих предшественников, в частности, не вызывают или вызывают крайне незначительное седативное действие. Эти препараты вошли в широкую практику врачей-аллергологов и других специалистов, стали весьма популярны во всем мире, в том числе в нашей стране [55].
Широко известен и применяем в России лекарственный препарат лората-дин. Этот препарат назначается однократно в сутки в дозе 10 мг, не оказывает побочных кардиотоксических эффектов и не вызывает седации, разрешен к применению с раннего детского возраста в связи с высоким профилем безопасности. Но лоратадин, как и некоторые другие препараты второго поколения антигистаминных средств, имеет некоторые ограничения по сочетанному применению с другими препаратами (макролиды, кетоконазол и некоторые другие) [102, 180].
Поэтому понадобилось совершенствовать препараты этой фармакологической группы. Большинство из них представляют собой пролекарства, которые в организме человека подвергаются метаболизму, и в результате чего определяются только их продукты биотрансформации, оказывающие основное фармакологическое действие - блокаду Нгрецепторов. Например, препарат лоратадин метаболизируется в печени с образованием активного метаболита дезлоратадина при участии изоферментов цитохрома CYP3A4 и в меньшей степени CYP2D6. Препарат терфенадин также метаболизируется под воздействием изоферментов цитохрома Р450 (ЗА4) в активный метаболит фексофе-надин, который не обладает кардиотоксическим действием. Если по какой-либо причине метаболизм лекарственного средства нарушен, происходит кумуляция неизменённого препарата, который может обладать нежелательными эффектами. Именно это происходит с терфенадином и астемизолом, которые при превышении рекомендованных терапевтических доз или при нарушении метаболизма вследствие поражения печени или сопутствующем приёме препаратов, угнетающих активность ферментов CYP450, участвующих в превращении указанных пролекарств в активные метаболиты, вызывают нарушения сердечного ритма, которые приводят к нежелательным побочным эффектам, вплоть до смертельного исхода [85, 171].
Оптимальным направлением исследований по улучшению профиля анти-гистаминных препаратов явилось создание препаратов на основе фармакологически активных метаболитов препаратов второго поколения. Они должны сохранять все преимущества препаратов второго поколения и не должны обладать побочными действиями на сердечно-сосудистую систему, а также не должны взаимодействовать с лекарственными препаратами, угнетающими систему цитохрома Р450 [98].
Первым антигистаминным препаратом, практически не подвергающемся метаболизму у человека, был цетиризин. Следовые количества метаболита це тиризина появляются в плазме крови через 10 часов. Период полуэлиминации цетиризина у взрослых людей после однократного приёма 10 мг препарата составляет 7-11 часов. У пожилых этот показатель несколько больше, что связано с особенностью функционирования почек [206].
Для цетиризина характерна невысокая величина объема распределения и высокая способность проникновения в кожные покровы. При курсовом лечении постоянная концентрация в плазме крови достигается в течение 3 суток, и при дальнейшем применении не наступает его кумуляция и не изменяется скорость элиминации [206].
Таким образом, для лечения хронических заболеваний, требующих длительного применения препаратов, показано использование антигистаминных препаратов II поколения (лоратадин, цетиризин, эбастин и др.) и лекарственных средств, созданных на основе их метаболитов, которые в литературе нередко называют препаратами III поколения (фексофенадин, дезлоратадин, но-растемизол и др.) [98].
Аналитическая аппаратура и средства измерений
Препараты, содержащие морфолиновый цикл, в зависимости от строения молекул могут проявлять различное фармакологическое действие [26]. В литературе имеются работы обзорного характера по веществам, содержащим морфолиновый цикл. В данных источниках литературы рассматривается фармакологическая активность данной группы соединений. В то же время в литературе не отражены обобщения имеющихся данных, в неполной мере описаны какие-либо эмпирические взаимосвязи фармакологического действия с химическим строением соединения [20, 33]. Как правило, в литературе морфолиновый фрагмент рассматривается не как основная часть молекулы, а как дополнительная или вторичная.
Морфолин легко вступает в различные реакции нуклеофильного замещения, которые приводят к синтезу различных по фармакологическому эффекту соединений. Учитывая данный факт, а также доступность сырья и достаточную простоту исполнения реакций химического синтеза, можно считать поиск лекарственных препаратов в этом ряду органических веществ весьма перспективным [26]. Препараты, содержащие морфолиновый цикл, обладают антимикробным и бактерицидным действием. Современным препаратом, обладающим данными свойствами, является новый антибиотик - линезолид ((5)-А -({3-[3-фторо-4-(морфонил-4-ил)фенил]-2-оксо-1,3-оксазолидин-5-ил}метил)ацетамид).
Линезолид - синтетический антибиотик, используемый для лечения тяжёлых инфекционных заболеваний, вызванных грамположительными бактериями, которые устойчивы к другим антибиотикам. Представитель класса ок-сазолидинонов, линезолид является активным по отношению к большинству грамположительных бактерий, которые вызывают болезни, включая стрептококки, устойчивые к ванкомицину энтерококки и метициллин-резистентный золотистый стафилококк [147].
Gomez-Flores с соавт. количественно подтвердили противобактериальную активность линезолида с помощью метода микродилюции в бульоне [91].
Методом серийных разведений в мясопептонном бульоне изучена проти-вомикробная активность ряда морфолидов замещенных 4-apffii-2-N-морфолино-4-оксо-2-бутеновых кислот. Установлено, что большинство испытанных соединений обладает слабым противомикробным эффектом [24].
В исследовании Байкеновой Г. Г. с соавт. показано, что при определении в жидкой питательной среде методом серийных разведений, морфолиновая соль N-морфолилдитиокарбаминовой кислоты также обладает слабым бактерицидным действием [6].
Аморолфин относится к фармакологической группе противогрибковых препаратов. Аморолфин представляет собой морфолинсодержащее противогрибковое ЛС для местного лечения заболеваний ногтей в форме специального лака [59]. Данный препарат имеет широкий спектр противогрибкового действия. ЛС действует посредством ингибиции двух ферментов: А14-редуктазы и Д-изомеразы, которые участвуют в биосинтезе эргостерола клеточной мембраны [3, 59].
Известны морфолинсодержащие препараты, проявляющие фармакологическую активность при заболеваниях ССС [26]. Характерным примером проявления данного фармакологического эффекта является антиаритмический препарат этмозин. Антиаритмическими и антиишемическими свойствами также обладает синтезированный в ФГБУ "НИИ фармакологии имени В. В. Закусова" РАМН препарат афобазол [28, 43].
На модели хлоридкальциевой аритмии у крыс изучены антиаритмические свойства N-ациламино-1,6,7-замещенных 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-4-спироциклопентан производных и некоторых их аналогов. Обнаружено, что соединения, имеющие в своей структуре морфолиновое кольцо, обладают слабой антиаритмической активностью. В дозе 5 мг/кг они повышают выживаемость животных на 33,3-50,0% [5].
На наркотизированных кошках было изучено влияние на АД амидов 2-(3,3,7-триметил-3,4-дигидроизохинолил-1)этановой кислоты. Среди группы соединений изучалось также влияние третичного амида, образованного из циклического амина - морфолина. Показано, что гидрохлорид данного соединения, обладает гипертензивным эффектом. Также обнаружено, что третичные амиды, образованные именно из циклических аминов (морфолин, пиперидин, гексаметиленимин) проявляют гипертензивное действие [30].
Для лечения стенокардии, профилактики инфаркта миокарда в медицинской практике используется препарат, содержащий морфолиновый фрагмент - молсидомин (этиловый эфир N-карбокси-З-морфолино-сиднонимина). Данный препарат представляет собой пролекарство, которое превращается в процессе метаболизма в печени в 2 активных метаболита, которые высвобождают оксид азота (NO). N0 активирует гуанилатциклазу (ГЦ, цитозольный фермент), способствуя накоплению циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). Это приводит к снижению содержания кальция в цитозоле гладкомышечных клеток и расслаблению гладких мышц.
Толерантность к молсидомину развивается гораздо в меньшей степени, чем к нитратам. Побочные эффекты также выражены в меньшей степени, чем у нитратов [4]. Подробно изучена спазмолитическая активность фенадоксона (6-морфолино-4,4-дифенил-3-гептанон), являющегося производным морфолино-гептанона, которое в 10 раз активнее папаверина [29].
Весьма широко используются морфолинсодержащие препараты для лечения заболеваний центральной нервной системы и стимулирования умственной деятельности [26].
Например, ингибиторы МАО используются для лечения психических расстройств с конца 60-х годов прошлого века [186]. Современным представителем селективных ингибиторов МАО является препарат моклобемид (Ау-рорикс) [136], который также является морфолинсодержащим препаратом. Некоторые клинические исследования показали, что моклобемид обладает свойствами антидепрессанта и слабо действует на сердечно-сосудистую систему у здоровых добровольцев [192].
Известные препараты минаприн (4-метил-Ы-(2-морфолин-4-илэтил)-6-фенилпиридазин-3-амин), бефол (4-хлор-М-(3-морфолинопропил)-бензамида гидрохлорид), являющиеся антидепрессантами, также содержат морфолино-вый фрагмент.
К группе селективных ингибиторов обратного захвата норадреналина (СИОЗН) относятся два лекарственных препарата, которые в своей структуре имеют морфолиновое кольцо - ребоксетин и вилоксазин [84, 179].
Ребоксетин является сильным и высокоселективным ингибитором обратного захвата (03) норадреналина и оказывает лишь незначительное влияние на ОЗ серотонина, а также обладает слабым аффинитетом к мускариновым, Hi-гистаминовым, агадренергическим и D2-дофаминовым рецепторам [196].
Инделоксазин имеет структурное сходство с молекулой афобазола, что, возможно, и определяет столь широкое фармакологическое действие. Данный препарат проявляет основную фармакологическую активность как СИОЗН [198]. Также действует как антагонист NMDA-рецепторов [111]. Усиливает выделение ацетилхолина через косвенное действие на 5-НТ4-рецепторы [199, 200, 201].
Обработка биологических проб, экстракция М-11 и его метаболитов из биологических образцов
Жидкостной хроматограф фирмы "Beckman Coulter" (США), оснащенный помпой - "Beckman System Gold 127 Solvent Module" и УФ-детектором "Beck-man System Gold 166 Detector".
Высокоэффективный жидкостной хроматограф с масс-селективным детектором типа ионная ловушка модели "Agilent 1200 Series LC/MSD Ion Trap" (Agilent, США), оборудованный системой автоматического ввода пробы, внешним источником ионов с ионизацией электроспреем при атмосферном давлении и управляемый компьютером с системой обработки данных "Chem-Station".
Весы лабораторные (ГОСТ 24104-2001) аналитические "AR 2140" (Ohaus, США) с погрешностью взвешивания не более ±0,0001 г, весы лабораторные (ГОСТ 24104-2001) технические "ВАЗІOS" (Sartorius, Германия) с погрешностью взвешивания не более ±0,01 г, мерные колбы на 50,0; 100,0; 250,0 мл (ГОСТ 1770-74), мерные цилиндры объемом 50,0; 250,0; 1000,0 мл (ГОСТ 1770-74).
Шприцы медицинские вместимостью 2,0 и 5,0 мл (ГОСТ 24861-91); дозаторы переменного объема на 100,0; 200,0; 1000,0; и 5000,0 мкл (Eppendorf, Германия) со сменными одноразовыми пластиковыми наконечниками (Ерреп dorf, Германия); рН-метр "Seven Easy S20-K" (Mettleroledo, Швейцария); аппарат для встряхивания жидкости "К-550 GE" (Vortex, США); центрифуга "ОПн-8" (ДАСТАН, Кыргызстан); центрифуга с охлаждением "Sigma 2 - 16" (Wiegand, Германия); ультразвуковая баня "Elmasonic S 40Н" (Elma, Германия); пробирки со шлифами на 5,0; 10,0; и 15,0 мл (ГОСТ 1770-74); бумага фильтровальная "ФБ" (Невалаб, Россия, ГОСТ 12026-76).
Концентрированные матричные растворы афобазола, соединения М-11 и его метаболитов готовили растворением навесок (10,0 мг) каждого соединения в мерной колбе на 100,0 мл дистиллированной водой.
Рабочие растворы готовили последовательным разведением концентрированных растворов до получения необходимой концентрации.
Концентрированные и рабочие растворы хранили в холодильнике при 5С.
Готовили 0,2М раствор гидрофосфата калия растворением навески вещества массой 4,56 г в дистиллированной воды с использованием мерной колбы. Объем раствора доводили до 100 мл.
Готовили 0,2М раствор дигидрофосфата калия растворением навески вещества массой 2,72 г в дистиллированной воде с использованием мерной колбы. Объем раствора доводили до 100 мл.
Буферный раствор готовили смениванием 81 мл 0,2М раствора гидрофосфата калия и 19 мл 0,2М раствора дигидрофосфата калия в сухой мерной колбе.
Значение рН полученного буферного раствора контролировали с помощью рН-метра, предварительно проверенном и откалиброванном по стандартным буферным растворам (ГОСТ 8.134-74 и ГОСТ 8.135-74). Полученный бу ферный раствор дегазировали на ультразвуковой бане, переносили в сухую склянку с хорошо притертой пробкой и хранили при комнатной температуре в месте, защищенном от попадания прямых солнечных лучей. Срок хранения буферного раствора - 1 неделя.
В качестве подвижной фазы для хроматографического анализа биологических образцов использовали смесь ацетонитрила для хроматографии марки УФ и глицинового буфера (рН 3,4).
Навеску глицина массой 3,0 г растворяли в 200 мл воды. К полученному раствору добавляли 5,12 мл 1Н соляной кислоты и доводили полученный объем до 800 мл дистиллированной водой.
Значение рН глицинового буфера контролировали с помощью рН-метра, предварительно проверенного и откалиброванного по стандартным буферным растворам (ГОСТ 8.134-74 и ГОСТ 8.135-74). Полученный буферный раствор дегазировали на ультразвуковой бане, переносили в сухую склянку с хорошо притертой пробкой и хранили в холодильнике при 5С.
К 800 мл глицинового буфера приливали 270 мл ацетонитрила. Полученную подвижную фазу дегазировали на ультразвуковой бане и хранили в холодильнике при 5С.
Навеску ацетата аммония массой 1,54 г переносили в мерную колбу и растворяли в воде деионизованной. Объем раствора доводили до 200 мл. Полученный раствор (концентрация раствора - 0,1М) переносили в склянку с хорошо притертой пробкой и хранили в холодильнике при 5С. Срок хранения полученного раствора - 3 месяца.
Фармакокинетика соединения М-11 после перорального введения крысам в дозе 25 мг/кг
После внутрибрютпинного введения крысам соединение М-11 подвергается биотрансформации, и уже в первые минуты в плазме крови и органах крыс регистрируются его метаболиты. Соединение М-11 определяется в плазме крови и органах животных в течение 3-х часов. Снижение концентраций соединения М-11 носит ярко выраженный двухфазный характер (рис. 4.1-4.7). Время достижения максимальной концентрации (Tmttx) соединения М-11 в плазме крови составило 0,042 часа (2.5 мин), а её величина- 25,87 мкг/мл (табл. 4.1). Максимальные концентрации соединения М-11 в исследуемых органах и тканях наблюдались через 1-5 мин. Метаболит-11 достигал своего максимума в мозге через 5 мин.
Анализ параметров кинетики позволяет заключить, что соединение М-11 быстро выводится из организма, на что указывает значение константы скорости элиминации из плазмы крови, которая составила для исследуемого соединения 2,042 ч"1. Быстрое исчезновение соединения М-11 из организма характеризуется также величинами следующих фармакокинетических параметров: среднее время удерживания в организме - 0,39 ч и период полувыведения вещества из организма - 0,34 ч.
Из материалов таблиц 4.1-4.7 следует, что соединение М-11 выводится из плазмы крови, мозга, печени, селезёнки и почек примерно с одинаковой скоростью (1,695-2,267 ч"1). Значения констант элиминации статистически не отличаются. Соединение М-11 более быстро выводится из умеренно и слабо васку-ляризированных тканей. Абсолютные величины Kei из брыжейки и мышечной ткани составили 2,425 ч" и 2,188 ч" , соответственно, что может быть связано с относительно слабыми липофильными свойствами. Среднее время удерживания соединения М-11 в плазме крови, мозге, печени, селезёнке и почках характеризуются приблизительно одинаковыми величинами.
Таким образом, полученные результаты по изучению фармакокинетики соединения М-11 после его введения внутрибрюшинно позволяют сделать вывод, что исследуемое соединение элиминирует из организма животных с высокой скоростью, на основании чего его можно отнести к группе "короткоживу-щих" лекарственных веществ.
Полученные результаты подтверждаются многочисленными литературными данными по морфолинсодержащим структурам. Так, например, период полувыведения молсидомина составляет 1 ч [160], в случае инделоксазина -2,2 ч [ПО], препарат моклобемид элиминирует из плазмы крови с периодом полувыведения 2-4 ч в зависимости от вводимой дозы [192], период полувыведения афобазола равен 0,53 ч [41].
Материалы данной подглавы опубликованы в следующих печатных работах:
Виглинская, А.О. Фармакокинетика соединения М-11 после внутрибрю-шинного введения крысам [Текст] / А.О. Виглинская, Г.Б. Колыванов, А.А. Литвин, Е.А. Литвин, Д.В. Бастрыгин, Т.Я. Можаева, П.О. Бочков, А.К. Сариев, В.П. Жердев, СБ. Середенин // Клиническая фармакология и терапия: Материалы научно-практической конференции с международным участием "Достижения клинической фармакологии в России". -М., 2009.-№6.-С. 7-8.
Одним из важнейших этапов при проведении фармакокинетических исследований является изучение тканевой доступности новых лекарственных средств. Основным результатом процессов распределения является транспорт лекарственного средства в зону действия и создание достаточной терапевтической концентрации для взаимодействия со структурами, определяющими фармакологический эффект препарата. Основываясь на величинах тканевой доступности в различные органы, возможно количественно определить интенсивность проникновения действующего вещества в периферические ткани и орган-мишень [184].
Распределение соединения М-11 изучали в органах и тканях, отличающихся друг от друга различной степенью кровоснабжения, а также в органах, обеспечивающих элиминацию и в органе - зоне потенциального действия:
Анализ абсолютных величин тканевой доступности соединения М-11 показал, что исследуемое соединение интенсивно распределяется в сильно вас-куляризированиых органах - печени, селезёнке и почках. В то же время их содержание в умеренно и слабо васкуляризированных органах (мышца, брыжейка) - значительно ниже.
Тканевая доступность соединения М-11 в системе «печень - плазма крови» характеризируется величинами 1,19; «селезёнка - плазма крови» - 0,9; «почки - плазма крови» -0,71.
К информативным фармакокинетическим показателям, характеризующим степень проницаемости соединений в ткани организма и способность последних к избирательному захвату фармакологических препаратов из кровяного русла, также относится кажущийся коэффициент распределения (Kd). Наклон фармакокипетической кривой соединения М-11 в плазме крови и мозге крыс характеризуются близкими значениями параметра «Ь», поэтому правомерно рассчитать Kd в моноэкспоненциальных фазах.
Величины коэффициентов распределения соединения М-11 в органах и тканях крыс представлены в таблице 4.8. Коэффициенты распределения для органов, обеспечивающих элиминацию вещества, характеризуются средними величинами и составили для печени - 0,92 - 1,88, для почек - 0,61 - 1,01 (через 0,25 - 1,50 ч после введения препарата). В то же время, для средне- и слабовас-куляризированных органов коэффициенты распределения оказались более низкими. Kd в системе «мышцы - плазма крови» (через 0,25 - 1,50 ч после введения) не превышают 0,55; в системе «брыжейка - плазма крови» - 0,11. Интересно отметить, что самое заметное уменьшение коэффициента распределения наблюдалось в системе «селезёнка - плазма крови» (через 0,25 - 1,50 ч после введения). Коэффициент распределения в данном органе снизился в 4 раза, в то время как коэффициенты распределения в остальных тканях либо были на одном уровне (мозг, мышцы), либо изменения носили не столь значительный характер, как в селезёнке (брыжейка, почки). Самое низкое значение коэффициента распределения наблюдалось в системе «мозг - плазма крови» (через 0,25-1,50 ч после введения) и составило 0,05 после 1,50 часов. Важно также отметить, что в системах «селезёнка - плазма крови» и «брыжейка - плазма крови» наблюдалось снижение величин, характеризующих коэффициент распределения, в то время как для систем «печень - плазма крови», «почки -плазма крови» и «мышцы - плазма крови» наблюдается увеличение данного коэффициента (табл. 4.8), что может служить доказательством наличия небольшой кумуляции соединения М-11 в печени, почках и мышцах.
Известно, что для веществ основного характера, обладающих высокой степенью кумуляции, характерно относительно низкое содержание их в плазме крови, высокая скорость их накопления в тканях, и, как следствие этого, значение кажущего коэффициента распределения значительно выше единицы. Для веществ, обладающих средней степенью кумуляции, значение Кд находится в диапазоне 0,1-1,0 и для веществ с низкой способностью к кумуляции -ниже 0,1 [71].
Таким образом, из полученных нами данных следует, что интенсивность проникновения соединение М-11 в органы и ткани снижается в ряду: печень -селезёнка - почки - брыжейка - мышцы - мозг.
