Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Фикотоксины: общее описание и классификация 11
2.2. PSP токсины 13
2.3. ASP токсины 27
2.4. DSP токсины 34
3. Обоснование направления исследований 42
4. Материалы и методы исследования 46
4.1. Исследование содержание фикотоксинов в морепродуктах
4.2 Методы определения фикотоксинов 50
4.3 Экспериментальные исследования на животных 51
4.4. Метод исследования влияния домоевой кислоты на апоптоз
4.5 Статистическая обработка результатов 55
5 Результаты собственных исследований 57
5.1 Разработка метода обнаружения, идентификации и количественного определения ДК в моллюсках
5.1.1 Методы пробоподготовки и ВЭЖХ анализа ДК в морепродуктах
5.1.2 Приготовление и хранение стандартных растворов 5 8
5.1.3 Экстракция домоевой кислоты из образца 59
5.1.4 Очистка экстракта 61
5.1.5 Идентификация и количественное определение ДК в очищенном экстракте методом ВЭЖХ
5.2 Изучение частоты и уровня контаминации различными группами фикотоксинов морепродуктов
5.2.1 Изучение частоты и уровней контаминации морепродуктов PSP-токсинами
5.2.2 Изучение частоты и уровней контаминации морепродуктов DSP-токсинами
5.2.3 Изучение частоты и уровней контаминации морепродуктов ASP-токсинами
5.2.3.1 Изучение влияния домоевой кислоты на клетки глии головного мозга
5.3 Оценка риска для здоовья населения, связвнного с загрязнением морепродуктов фикотоксинами
6. Заключение 100
7. Выводы 107
8. Список литературы 109
- PSP токсины
- Исследование содержание фикотоксинов в морепродуктах
- Методы пробоподготовки и ВЭЖХ анализа ДК в морепродуктах
- Изучение частоты и уровня контаминации различными группами фикотоксинов морепродуктов
Введение к работе
В последние годы в питании населения России все большее место занимают рыба и морепродукты. В соответствии с разработанными в Минэкономразвития России макроэкономическими показателями развития экономики страны и повышения благосостояния населения, рост среднедушевого потребления рыбных товаров по оптимистическому сценарию может составить за 2003-2010 годы около 35%. При этом в структуре океанического рыболовства более быстрыми темпами будет возрастать о.бъем добычи нерыбных объектов промысла, удельный вес которых увеличится с 4,2% в 2003 г. до 10,6% в 2010 г [Ильясов СВ., 2004]. По данным маркетингового исследования компании "АМИКО" рынок морепродуктов является сегодня одним из самых динамично растущих среди всех сегментов продовольственного рынка России. Ежегодный рост рынка морепродуктов составляет 30-40% [Маркетинговое исследование рынка морепродуктов и морских деликатесов, 2007]. Являясь источником высококачественного белка и микроэлементов [Тутельян В.А. с соавт., 2002], морепродукты одновременно могут содержать и опасные вещества, одними из которых являются фикотоксины. Фикотоксины представляют собой группу токсинов, продуцируемых некоторыми видами водорослей, микроводорослей и цианобактериями, многие из которых являются начальным звеном пищевой цепи и служат источником пищи для многих морских животных, в том числе моллюсков и некоторых видов рыб и ракообразных, часть из которых имеет промысловое значение [FAO, 2004; Орлова Т.Ю. 2005].
Являясь природными контаминантами морепродуктов, фикотоксины представляют несомненную опасность для здоровья населения. Эти вещества могут вызывать выраженные как острые отравления, сопровождающиеся специфичной для различных групп фикотоксинов клинической картиной, так
и отдаленные эффекты, в том числе канцерогенез [White J., et al 2003; White J., et al 2003; Foodborne Poisonings and Toxicity., 2006].
Ежегодно во всем мире регистрируются отравления фикотоксинами, некоторые из которых заканчиваются летальным исходом [Van Dolah F.M. 2000]. Наиболее часто отравления происходят при употреблении в пищу двустворчатых моллюсков - мидий, гребешков, устриц и различных ракушек [Stewart J.E. and Subba Rao D.V., 1997; FAO., 2004]. При этом установлено, что технологическая обработка не приводит к полной деконтаминации продукта [Lawrence J.F. et al., 1994; Indrasena W. M., Gill T. A., 2000; FAO., 2004; Stommel E.W., Watters M.R. 2004].
Отсутствие официально зафиксированных случаев отравления в нашей стране, по-видимому связано с неосведомленностью медицинского персонала о возможности отравления фикотоксинами при употреблении в пищу морепродуктов, неспецифичностью клинической картины отравления при поступлении малых доз токсинов, а также отсутствием утвержденных лабораторных методов исследования, позволяющих провести дифференциальную диагностику интоксикации.
Обращает на себя внимание тот факт, что в ряде случаев опасны не только острые отравления фикотоксинами, но и хроническое поступление малых доз данных контаминантов, что связано наличием у некоторых из них (DSP-токсины) канцерогенных свойств [Maynes J.T. et al., 2001]. В связи с этим представляется актуальным изучение механизмов действия фикотоксинов, что позволит более достоверно оценивать риск для здоровья населения, связанный с поступлением фикотоксинов в организм человека.
Несмотря на то, что во многих странах мира уже организован мониторинг за загрязнением гидробионтов фикотоксинами [FAO., 2004], в России еще не сформирована нормативная и методическая база в отношении этих контаминанов.
В целях обеспечения безопасности морепродуктов необходимо всестороннее изучение проблемы контаминации их фикотоксинами, а также оценка риска поступления этих веществ с рационом. Обязательным элементом системы контроля контаминации фикотоксинами морепродуктов является методическая база. Таким образом, актуальным и необходимым является разработка методов обнаружения, идентификации и количественного определения фикотоксинов.
Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы является модификация и унификация метода обнаружения, идентификации и количественного определения ДК в морепродуктах и оценка риска для здоровья населения, связанного с загрязнением некоторыми фикотоксинами морепродуктов.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
1) Оптимизировать основанный на ВЭЖХ метод обнаружения,
идентификации и количественного определения ДК и апробировать и
адаптировать основанные на ИФА скрининговые методы определения PSP- и
DSP-токсинов в морепродуктах.
Изучить содержание фикотоксинов групп PSP, ASP и DSP в морепродуктах.
Рассчитать нагрузку и оценить риск для здоровья населения, связанный с загрязнением PSP, DSP и ASP морепродуктов, с целью обоснования гигиенических нормативов.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ
Разработан метод обнаружения, идентификации и количественного
определения ДК в моллюсках с использованием высокоэффективной
жидкостной хроматографии, характеризующийся хорошей
воспроизводимостью и надежностью (предел обнаружения 0,5 мкг/г).
Впервые в России изучено содержание ASP-, PSP- и DSP-токсинов в морепродуктах как промышленного вылова (отечественного и импортного производства), так и любительского вылова (отечественные). Установлена высокая частота контаминации исследованных образцов PSP-токсинами (83,8%). Частота загрязнения морепродуктов ДК и DSP-токсинами была значительно ниже (5,67% и 24,3% соответственно), однако, уровни содержания DSP в ряде образцов превышали пороговые значения.
Проведены расчет нагрузки и оценка риска для здоровья населения, связанного с загрязнением PSP-, DSP и ASP-токсинами морепродуктов промышленного и любительского вылова.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Разработаны МУК 4.1. 2229-07 «Определение домоевой кислоты в морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии». -М: Роспотребнадзор, 2007.
Разработаны MP 01.015-07 «Экспресс-определение сакситоксина в моллюсках с помощью тест-системы «RIDASCREEN FAST PSP (Saxitoxin)», производства фирмы R-Biopharm AG, Германия.». - М.: ФГУЗ Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007.
Разработаны MP 01.016-07 «Экспресс-определение окадаиковой кислоты в моллюсках с помощью тест-системы «DSP-Check», производства фирмы Parapharm Laboratories Co., Ltd, Япония» - M.: ФГУЗ Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007.
Разработан допустимый уровень содержания фикотоксинов групп PSP (паралитический яд моллюсков), ASP (амнестический яд моллюсков) и DSP (диарейный яд моллюсков) в нерыбных объектах промысла (моллюски, ракообразные). Дополнение в СанПиН 2.3.2.1078-01 - М.: Федеральная
служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2008.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
PSP токсины
Отравления PSP-токсинами описаны в литературе начиная с 1793 года, когда пострадала команда капитана Георга Ванкувера в Британской Колумбии [Tasker R.A. et al., 1991.]. Ежегодно происходят около 2000 случаев отравления людей PSP-токсинами и около 15% всех случаев приводят к летальному исходу [Van Dolah F.M. 2000]. Основными продуктами, употребление которых приводит к интоксикации, являются двустворчатые моллюски, особенно мидии и съедобные ракушки [Stewart J.E. and Subba Rao D.V., 1997; FAO., 2004]. Также в литературе описаны случаи накопления токсинов в крабах и лобстерах [FAO., 2004; Oikawa Н. et al., 2004; Oikawa Н. et al, 2005; Ciminiello P, Fattorusso E., 2006; Jiang TJ., Niu Т., Xu Y.X., 2006]. При этом установлено, что тепловая обработка приводит к лишь к частичной деконтаминации продукта [Lawrence J.F., Maher М., Watson-Wright W., 1994; FAO., 2004].
PSP-токсины в количестве 120 - 180 мкг способны вызвать отравления средней тяжести, а в дозе 400 - 1060 мкг -летальный исход [Shellfish toxins in food. A Toxicological review., 2001]. В России случаи отравления PSP-токсинами, ассоциированные с употреблением в пишу вареных мидий, имели место в Камчаткой области. Так, в 1973 г. произошло отравление моллюсками школьников в трех районах Петропаловска. Заболели дети в возрасте 7-16 лет, наиболее тяжело заболевание протекало у 2 больных, которые употребили по 20-25 мидий. Через 3 часа один больной скончался, а у другого появились симптомы тяжелой дыхательной недостаточности с развитием коматозного состояния. Отмечались и другие аналогичные случаи, в том числе отравление, связанное с употреблением мидий, членов экипажа плавбазы «Алеут» в Олюторском заливе [Куренков И.И., 1974; Раев М.Л., Тощенко Е.Г., Антипьева О.А. с соавт., 1975; Ошурков В., 1990].
Проявления отравления PSP варьирует от чувства онемения и легкого покалывания в области губ до летального исхода. Обычно покалывание губ, десен и языка развивается через 5-30 минут после приема пищи, содержащей PSP-токсины. В среднетяжелых и тяжелых случаях к этим ощущениям последовательно присоединяется онемение кончиков пальцев кистей рук и стоп, которое в течение 4-6 часов распространяется на руки, ноги и шею. Это сопровождается резким затрудненим движений, нарушением функции черепно-мозговых нервов; реже наблюдаются гастроинтестинальные симптомы, которые проявляются в виде тошноты, рвоты, диареи и болей в животе. Сознание пострадавших остается ясным. При тяжелом отравлении развивается паралич мышц тела, кардиоваскулярный шок и нарастающая дыхательная недостаточность. В случае летального исхода смерть наступает в результате развития дыхательной недостаточности в течение 2-12 часов с момента отравления. При благоприятном течении симптомы наблюдаются в течение трех дней, хотя мышечная слабость может сохраняться достаточно длительное время [International Programme on Chemical Safety., 1984; Isbister G.K., Kiernan M.C., 2005; Коновалова H.B. 2006; Foodborne Poisonings and Toxicity., 2006].
Фикотоксины, входящие в группу PSP, являются одними из сильнейших нервно-паралитических ядов, известных человечеству, получившие свое название по синдрому вызываемого ими отравления. Токсины данной группы являются производными тетрагидропурина [Sleno L. et al., 2004]. В настоящее время выделяют более 24 форм PSP, обладающих способностью к взаимопревращению в метаболических реакциях [Strichartz G., 1981; Sivonen К., Jones G., 1994; Lassus P. et al., 1994; Oshima Y. 1995].
Токсины группы PSP синтезируются некоторыми морскими микроводорослями динофлагеллятами (Alexandrium spp., Gymnodinium catenatum и Pyrodinium bahamense), относящимися к группе динофитовых водорослей [Harada, Т., Oshima, Y. & Yasumoto, Т. 1982; Hall S., et al 1990; Shumway S. E. 1990; Taylor, F. J. R. 1984]. Однако в последние годы было установлено, что PSP-токсины синтезируются и некоторыми видами цианобактерий - Cylindrospermopsis raciborskii, Lyngbya wollei, Anabaena circinalis, Aphanizomenon flos-aqua [Pereira P. et al., 2000; Ferreira F.M., et al., L 2001; Lagos N et al., 1999; Costa LA., et al., 2006; Pomati F., et al., 2006.; Pomati F., et al., 2004]. Имеются также данные о синтезе PSP-токсинов красными морскими водорослями (Rodophyta) Yania sp и некоторыми эубактериямии, выделенными из токсичных динофлагеллят [Kotaki Y., et al., 1983; Gallacher S., et al., 1997; Gallacher S., Smith E.A. 1999; Kodama M., et al, 1990].
Сапрофитные бактерии, выделяемые из динофлагеллят признаны их симбионтами [Gallacher S., Smith Е.А., 1999]. В литературе обсуждается возможность влияния бактерий на рост и токсичность динофлаггелят. Так, было установлено, что клетки A. catenella, содержащие бактерии, погибают быстрее, чем клетки, обработанные антибиотиками. При сравнении токсичности двух групп динофлагеллят (содержащей бактерии и аксенической) определено, что аксенические клетки A. catenella способны продуцировать токсины, но в меньшем количестве, что было подтверждено при биотестировании на мышах [Uribe P., Espejo R.T. 2003].
На рост динофлагеллят оказывают влияние условия окружающей среды (особенно температура воды, соленость и содержание фосфора), а также доступность питательных веществ [Taroncher-Oldenburg G,5 Kulis D.M., Anderson D.M. 1999]. ,
Распространение по пищевой цепи При определенных условиях окружающей среды количество микроводорослей в морской воде может резко увеличиваться. Микроводоросли, включая токсичные виды, являются начальным звеном пищевой цепи [Орлова Т.Ю., 2005]. Адгезия клеток этих микроводорослей приводит к образованию так называемых флоккулятов, или «морского снега», которые оседают на морское дно и служат дополнительным источником пищи для придонных животных. Таким образом, обеспечивается быстрое поступление токсина к придонным организмам. Кроме того, флоккуляты, благодаря увеличению своих размеров по сравнению с отдельными клетками микроводорослей, могут служить кормом для более крупных морских животных и рыб [Van Dolah F. М. 2000]. Накопление в организме гидробионтов токсинов группы PSP часто регистрируется во время, так называемых, «красных приливов», когда вода у берегов окрашивается в кроваво-красный цвет [Королев А.А., 2006]. Этим термином называется одна из разновидностей вредоносного цветения водорослей (ВЦВ), при котором происходит резкое увеличение количества токсичных микроводорослей, в том числе динофлагеллят, в воде (от 10 и более клеток/литр) [International Programme on Chemical Safety. 1984]. Моллюски, имеющие промысловое значение (мидии, устрицы, гребешки и съедобные ракушки), питание которых осуществляется путем фильтрации, способны аккумулировать PSP-токсины до уровней, летальных для человека [Marine Biotoxins 2004; Орлова Т.Ю. 2005]. Однако, накопление токсинов может происходить и вне «красных приливов» и быть связанным с потреблением моллюсками цист динофлагеллят, находящихся на дне моря [Ciminiello Р, et al 2000; International Programme on Chemical Safety, 1984].
Исследование содержание фикотоксинов в морепродуктах
Различные образцы морепродуктов промышленного вылова (отечественного и импортного производства), отобранные в торговой сети г. Москвы и г. Екатеринбурга, и гидробионты любительского вылова, отобранные в прибрежных водах Японского моря. Всего изучен 21 вид морских гидробионтов: промышленный вылов - 10 видов, из числа которых 81,0% представлены двустворчатыми моллюсками, любительский - 14 видов из которых наибольший процент составляли двустворчатые моллюски (гребешки, мидии, съедобные ракушки)—37,5% и ракообразные - 20%о, 42,5%) - брюхоногие и головоногие моллюски, иглокожие и оболочники.
Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам ТИНРО за предоставление образцов морепродуктов, выловленных в Японском море. В торговой сети были отобраны следующие образцы морепродуктов (138 образцов): - гребешок (некоторые образцы с икрой), (не подвергнутые термической обработке); - мидии (вареномороженые); - крабы (вареномороженые); моллюск Hokkigai (съедобная ракушка Spisula solidissima) (образцы прошли термическую обработку); - устрицы (образцы не подвергнуты термической обработке); - осьминоги (не подвергнутые термической обработке); - креветки (вареномороженые); - кальмары (не подвергнутые термической обработке); - лобстер (вареномороженый); - каракатица (не подвергнутая термической обработке) (табл.7). Отбор проб проводился в соответствие с требованиями ГОСТ 7631-85 «Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний».
Из числа всех морепродуктов наибольшее их количество было произведено в России (26 образцов), в Нидерландах (16 образцов), Дании (15 образцов), Новой Зеландии (15 образцов) и Таиланде (8 образцов). Морепродукты других стран (Великобритания, Германия, Япония, Бельгия, Франция, Вьетнам, Италия, США, Испания. Ирландия) были представлены в количестве до 5 образцов. Распределение образцов морепродуктов по месту их производства представлены на рисунке 5. В некоторых образцах (1 образец мидий, 1 - краба, 1 - креветок) в процессе пробоподготовки были отдельно выделены внутренние органы; в 3 образцах гребешков отдельно была проанализирована икра. В Японском море были выловлены следующие виды гидробионтов: двустворчатые моллюски (мидии, модиолус длиннощетинистый, спизула сахалинская, корбикула японская, анадара Броутона, гребешок приморский), брюхоногие моллюски (нептуния складчатая, букцинум Баяна, букцинум Веркрюзена, трубач), а также серый морской еж, кукумария японская, трепанг дальневосточный, углохвостая креветка, креветка медведка, кальмар Бартрама, командорский кальмар, асцидия и камчатский краб. Всего 40 образцов морепродуктов (табл. 6). Все образцы не подвергались термической обработке и были заморожены непосредственно после вылова. В ходе исследования в части образцов были выделены и исследованы внутренние органы. Таблица 6.
С целью определения содержания токсинов группы PSP и DSP были использованы наборы для конкурентного иммуноферментного анализа. Достоинствами данного метода является быстрота выполнения анализа, простота пробоподготовки, высокая чувствительность и достаточная специфичность.
Фикотоксины группы PSP определяли с помощью тест-системы «RIDASCREEN FAST PSP (Saxitoxin)», производства фирмы «R-Biopharm AG», Германия. Принцип работы данной тест-системы основан на методе конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами. Поставляемый в комплекте набора планшет сенсибилизирован антителами «захвата», специфичными к антителам к сакситоксину.
Исследуемые и стандартные образцы, препарат, содержащий антитела к сакситоксину и препарат, содержащий конъюгат сакситоксина с ферментом, дозируются в лунки активированного планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы сакситоксина и молекулы конъюгата сакситоксина с ферментом, конкурируя между собой, связываются антителами к сакситоксину. В то же самое время при инкубации происходит иммуносорбция этих антител на поверхность лунок планшета за счет их взаимодействия с антителами «захвата» на поверхности. Далее, путем промывки планшета, из лунок удаляются свободные молекулы конъюгата.
После промывки планшета в его лунки дозируется раствор, содержащий субстрат и хромоген. В процессе инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы конъюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. После определенного времени развития данной реакции, в результате которой хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется «стоп-реагент», при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.
Методы пробоподготовки и ВЭЖХ анализа ДК в морепродуктах
Для определения ДК в образцах морепродуктов были воспроизведены четыре описанных в литературе метода пробоподготовки и ВЭЖХ анализа ДК в морепродуктах [Hatfield C.L. et al, 1994; АОАС Official Method 991.26., 1999; Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach 35 LMBG Untersuchung von Lebensmitteln Bestimmung von Domoinsaure., 2002; Quilliam M.A., 2003]. 1) Методика, предложенная Quilliam M.A. (2003) предполагает экстракцию ДК из измельченной ткани моллюска (4,0 г) путем гомогенизации с 16 мл смеси метанол-вода (1:1), центрифугирование полученного экстракта и очистку надосадочной жидкости на патронах твердофазной экстракции (3 мл 500 мг силикагеля с привитыми четвертичными аммониевыми группами). При помощи одного патрона проводится очистка 5 мл надосадочной жидкости. В качестве раствора для промывания патрона используется водный раствор ацетонитрила (1:9). Для элюирования ДК используется цитратный буфер. В качестве мобильной фазы используется 10% раствор ацетонитрила, закисленный при помощи трифторуксусной кислоты (1,0 мл ТФУ добавляется віл раствора ацетонитрила). Режим элюирования - изократический, со скоростью потока 1 - 1,5 мл/мин. 2) В методике, предлагаемой в «Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach 35 LMBG Untersuchung von Lebensmitteln Bestimmung von Domoinsaure», 2002, основным отличием от методики, предложенной Quilliam М.А. на этапе пробоподготовки является изменение соотношения гомогената (5,0 г) и экстрагирующей смеси метанол-вода (1:1) (15 мл), а также этап нагревания смеси после гомогенезации в закрытом сосуде при 60-70С в течение 15 минут. При этом твердофазная экстракция не проводится. 3) По методике опубликованной в АО АС ДК экстрагируется из измельченной ткани моллюска 0,1М раствором соляной кислоты путем кипячения в течение 5 минут. Далее полученный раствор охлаждают, центрифугируют и фильтруют. Твердофазная экстракция также не проводится. 4) В методике, предложенной C.L. Hatfield et al. (1994) для промывания патрона вместо 10% раствора ацетонитрила был использован 0,1М раствор хлорида натрия в 10% растворе ацетонитрила, а элюирующий раствор заменен на 0,5 М раствор хлорида натрия в 10% растворе ацетонитрила.
Для приготовления стандартных растворов навеску кристаллической ДК (фирма TOCRIS «Bioscience», США) массой 5 мг помещали в мерную колбу объемом 25 мл, доводили до 25 мл смесью ацетонитрил-вода (1:9) и тщательно перемешивали до полного растворения вещества. В результате получали раствор с концентрацией токсина 200 мкг/мл (стандартный раствор I). Далее 2 мл этого раствора помещали в мерную колбу и доводили смесью ацетонитрил-вода (1:9) до 25 мл. Тщательно перемешивали. Концентрация полученного раствора составляла 16 мкг/мл (стандартный раствор И). Описанную процедуру повторяли еще два раза, получая растворы с концентрацией 1,28 мкг/мл (стандартный раствор III) и 0,1024 мкг/мл (стандартный раствор IV).
Как показали проведенные исследования, наибольшая степень экстракции наблюдалась при использовании смеси метанол-вода (1:1), составляющая в среднем 97,6% Существенно более низкие величины извлечения были получены при использовании смеси метанол-вода 1:1 (рН=2,5) с нагреванием до t=70C и, особенно, при кипячении с соляной кислотой (0,Ш) и экстрагировании метанолом. Таким образом, на основании полученных результатов исследований, в качестве смеси, обеспечивающей наибольшую степень экстракции домоевой кислоты из образцов моллюсков была предложена используемой смесь метанол-вода (1:1.
В ходе проведенной работы была изменена масса навески образца и объем экстракционной смеси, которые были уменьшены на 25%, что позволило сократить расход растворителя. При этом степень извлечения не изменилась. Средняя степень извлечения (10 образцов) при экстракции ДК из 3,0 г. измельченной навески путем гомогенизации с 12,0 мл смеси метанол-вода (1:1) составила 94,8%, а при экстракции из 4,0 г. навески 16,0 мл смеси метанол-вода (1:1) - 97,6%.
Изучение частоты и уровня контаминации различными группами фикотоксинов морепродуктов
В последнее десятилетие в Российской Федерации отмечается рост потребления морепродуктов, при этом ассортимент этих продуктов постоянно увеличивается. До недавнего времени они в основном были представлены продуктами импортного производства, но за последние годы наблюдается увеличение производства и отечественных морепродуктов. Так, в Баренцевом море происходит увеличение популяции камчатского краба, в регионе Дальнего Востока, Черного и Балтийских морей имеются плантации по разведению мидий и российские изготовители этой продукции уже выходят на международный рынок. При этом при поставке этой продукции в другие страны от российских изготовителей требуют документы, подтверждающие, что содержание токсинов в морепродуктах в каждой партии соответствует принятым международным нормативам, как это предусмотрено во многих странах мира. Однако, в Российской Федерации до сих пор отсутствуют официально утвержденные методы определения фикотоксинов в морепродуктов и гигиенические регламенты их содержания в этой группе продукции. Так как исследования в этом направлении в России до недавнего времени не проводились и фактически не имеется данных о содержании этих веществ в морепродуктах, это увеличивает риск возможности отравлений фикотоксинами. Кроме того, врачи практически не знают этой группы ядовитых веществ и клинической картины отравлениями ими, что не позволяет заподозрить отравления фикотоксинами. Поэтому, возможные случаи отравлений фикотоксинами часто не идентифицируются или они попадают в группу отравлений неустановленной этиологии. В то же время, как отмечено выше, в литературе описаны единичные случаи отравлений, имевших место на Сахалине и Камчатке в 70-е годы прошлого века [Куренков И.И., 1974; Раев М.Л., Тощенко Е.Г., Антипьева О.А. с соавт., 1975; Ошурков В., 1990]. Анализ мировой литературы также показывает, что отравления фикотоксинами постоянно регистрируются в странах Европы, Америки, Японии и Австралии [FAO., 2004]. Так, по данным различных авторов, в мире ежегодно регистрируется более 2000 случаев отравлений сакситоксином (PSP-токсин), при этом около 15% всех зарегистрированных случаев приводят к летальному исходу [Van Dolah F.M. 2000]. Еще больше регистрируется отравлений, связанных с окадаиковой кислотой (DSP-токсин). Так, только в Европе ежегодно отмечается значительное число случаев отравлений эти токсином, иногда захватывающие по нескольку сотен людей одновременно, но летальные исходы наблюдаются чрезвычайно редко [Torgersen Т, et al., 2005]. В тоже время, участие окадаиковой кислоты в процессах канцерогенеза, как показано в ряде исследований [Maynes J.T. et al., 2001], существенно увеличивает канцерогенный риск, что требует принятия соответствующих управленческих решений. Так как термическая и кулинарная обработка морепродуктов не позволяет в достаточной мере разрушить DSP-токсины, то практически единственным способом, регулирующим их поступление в составе рационов питания, является жесткое контролирование их содержания в морепродуктах. Что касается домоевой кислоты (ASP-токсин), то отравления этим токсином встречается редко, и они носят, в основном, спорадический характер. В то же время отравления домоевой кислотой протекают достаточно тяжело и их последствия существенно влияют на качество жизни.
Одновременно многими авторами высказывается предположение, что не все случаи отравлений токсинами морепродуктов регистрируются в мире. Это связано с тем, что очень много случаев отравлений протекает с довольно легкой клинической симптоматикой, когда больные не обращаются за помощью к врачу. Более того, отравления окадаиковой кислотой, характеризующееся наличием в клинической картине тошноты, диареи и болями в животе, не всегда настраивает врача на установление диагноза отравлений DSP-токсинами и поэтому такие случаи могут не фиксироваться. Учитывая то, что сакситоксин является одним из самых токсичных соединений, его определение в каждой партии морепродуктов входит в систему обязательного мониторинга во многих странах.
Одновременно следует указать на то, что в ряде образцов морепродуктов, в том числе полученных из торговой сети, наблюдаются достаточно высокие уровни содержания PSP-токсинов (300-600 мкг/кг), однако они не превышали нормативов, установленных в ряде зарубежных стран (800 мкг/кг продукта).
Вместе с тем, можно было изначально предположить, что содержание PSP-токсинов будет различаться между его уровнями во внутренних органах и в съедобной мышечной части. Действительно, при анализе данных оказалось, что PSP-токсины обнаруживались в 95,7% исследованных образцов внутренних органов: среднее содержание токсинов при этом составило 276,2 мкг/кг, а медиана - 236,8 мкг/кг. В тоже время в съедобной мышечной части морепродуктов сакситоксин обнаруживался в 82% случаев при средней концентрации 140,0 мкг/кг и медиане - 118,0 мкг/кг (рис. 16). В съедобной мышечной части гидробионтов максимальное содержание сакситоксина (536,8 мкг/кг) обнаружено в мышечной ткани гребешка, любительского вылова, а максимальное содержание токсина во внутренних органах было выявлено у креветки медведки (757,9 мкг/кг), также любительского вылова.
В среднем, по группе образцов морепродуктов промышленного вылова, содержание PSP-токсинов составило 133,9 мкг/кг (разброс от менее 50 до 524,0 мкг/кг). При этом важно отметить, что основная масса образцов содержала токсины в концентрации до 200 мкг/кг: PSP-токсины не обнаружены в 15,8% образцов (менее 50 мкг/кг), 68,6 % образцов содержали токсины в концентрации от 50 до 200 мкг/кг, 12,9 % - в концентрации от 200 до 400 мкг/кг, 2,7 % образцов - в концентрации 400-600 мкг/кг (рис.17). 2,70%
Среднее содержание PSP-токсинов в мышечной части образцов промышленного вылова составило 126,9±91,7 мкг/кг. Максимальное содержание PSP-токсинов, составившее 524,0 мкг/кг, было обнаружено в образце филе гребешка импортного производства.
В связи с полученными данными представляло интерес проанализировать содержание PSP-токсинов в отдельных группах морепродуктов. Были также отдельно проанализированы уровни PSP-токсинов в двустворчатых моллюсках, которые обычно употребляются в пищу целиком (в мидиях и устрицах), и отдельно в моллюсках, у которых наиболее часто в пищу идет мышечная часть - в гребешках и моллюсках рода Hokkigai.
