Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Распространение энтеровирусов в воде 11
Глава 2. Методы концентрирования энтеровирусов из воды различных водных объектов 17
2.1. Метод мембранной фильтрации и его применение в микробиологических исследованиях
Глава 3. Материалы и методы 35
3.1. Модельные микроорганизмы 35
3.2. Материалы и объекты исследования 36
3.3. Методы исследования 39
3.4. Статистическая обработка результатов. 41
3.5. Разделы исследований 43
Глава 4. Изучение эффективности раз личных мембранньгх фильтров в отношении выделения вирусов из воды в режиме микрофильтрации 44
4.1 . Изучение сорбции вирусов на позитивно-заряженных мембранных фильтрах изготовленных на различной сырьевой и технологической основе с различными модификациями 44
4.2.Изучение элюции вирусов с мембранных фильтров изготовленных на различной сырьевой и технологической основе 51
Глава 5. Оценка эффективности различных фильтрующих мембранных модулей для выделения энтеровирусов из воды различных водных объектов 62
5.1.Оценка эффективности аналитического мембранного устройства - АМУ 1 в отношении концентрирования энтеровирусов из воды 62
5.2. Оценка эффективности фильтрационной установки типа АФ-142 «К» в отношении концентрирования вирусов из воды 65
5.3.Оценка эффективности проточного мембранного фильтрующего модуля МФМ 0142 с тангенциально-радиальным движением жидкости в отношении концентрирования вирусов из воды 68
5.3.1. Оценка эффективности мембранного фильтрующего модуля МФМ 0142 в отношении концентрирования вирусов из нативных вод 76
Глава 6. Разработка метода концентрирования энтеровирусов из воды различных водных объектов с использованием мембранной фильтрации в режиме микрофильтрациина МФМ 0142 87
Глава 7.Апробация разработанного метода в натурных условиях 93
Глава 8. Сравнительная оценка методов концентрирования энтеровирусов в воде 97
Глава 9.Обсуждение полученных результатов. 104
Выводы 116
Список литературы. 119
Приложение 141
- Метод мембранной фильтрации и его применение в микробиологических исследованиях
- Изучение сорбции вирусов на позитивно-заряженных мембранных фильтрах изготовленных на различной сырьевой и технологической основе с различными модификациями
- Оценка эффективности фильтрационной установки типа АФ-142 «К» в отношении концентрирования вирусов из воды
- Оценка эффективности мембранного фильтрующего модуля МФМ 0142 в отношении концентрирования вирусов из нативных вод
Введение к работе
Актуальность проблемы:
Проблема обеспечения населения России доброкачественной питьевой водой - безопасной в эпидемическом отношении, является одной из актуальных в системе предупредительного санитарно-эпидемиологического надзора. Это обусловлено общим ухудшением состояния поверхностных водоисточников в результате продолжающегося постоянного воздействия хозяйственно-бытовых сточных вод, поступающих водоёмы без необходимой очистки и обеззараживания и являющихся основным источником вирусного загрязнения водных объектов (Г.Г. Онищенко, 2005; Ю.А. Рахманин, 2005; А.Е. Недачин и соавт., 2005),
Благодаря достижениям отечественной санитарной вирусологии, в последние годы установлена широкая циркуляция вирусов в объектах окружающей среды, выявлена тесная связь между их содержанием в питьевой воде и заболеваемостью населения кишечными вирусными инфекциями.
Отсутствие до настоящего времени мер специфической профилактики в отношении кишечных вирусных инфекций диктует необходимость совершенствования неспецифических мер, ограничивающих циркуляцию вирусов в объектах окружающей среды. Важнейшей составной частью неспецифических мер профилактики является предупредительный эпидемиологический надзор за состоянием водных объектов, контроль за эффективностью работы очистных сооружений и водопроводных станций по санитарно-вирусологическим показателям.
В настоящее время в документах водно-санитарного законодательства- СанПиН 1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические
требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества», СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод», СанПиН 2.1.2.1188-03 «Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества» -основным требованием, предъявляемым к качеству воды, является полное отсутствие вирусов в единице контролируемого объема водного объекта.
Для контроля питьевой воды по этому показателю необходимо наличие методического обеспечения, дающего возможность осуществления быстрой, адекватной и, что очень важно, точной количественной оценки реального вирусного загрязнения питьевой воды.
Используемые в настоящее время в нашей стране методы концентрирования вирусов из больших объемов воды обладают рядом недостатков, связанных с длительностью концентрирования (от нескольких дней до 24 часов), низкой пропускной способностью (не более 10 л чистой воды), нестандартностью и т.д., что значительно' влияет на частоту обнаружения вирусов в водных объектах.
Наиболее полно необходимым требованиям отвечает технология мембранной фильтрации. Он является очень перспективным для индикации вирусного загрязнения воды, т.к. даёт возможность разработки простого, точного, легко воспроизводимого количественного метода определения вирусов в воде, основанного на использовании высококачественных мембран отечественного производства, стандартизированных и сертифицированных для вирусологического анализа (Ю.А.Рахманин, А.Е. Недачин и соавт., 2001).
Это диктует необходимость разработки и внедрения мембранных методов, основанных на использование наиболее эффективных фильтрующих мембран и фильтровальных установок отечественного производства.
В связи с выше изложенным, целью работы является разработка и гигиеническая оценка метода санитарно-вирусологического контроля качества воды различных водных объектов на основе метода мембранной фильтрации в режиме микрофильтрации с использованием позитивно-заряженных мембран.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1.В экспериментальных условиях оценить эффективность различных позитивно-заряженных фильтрующих мембран, изготовленных на различной сырьевой и технологической основе и отработать оптимальные условия сорбции и элюции энтеровирусов для наиболее эффективных.
2.Провести сравнительную оценку эффективности
фильтровальных мембранных установок различного типа для концентрирования энтеровирусов из воды разных водных объектов.
З.Разработать метод концентрирования энтеровирусов из воды различных водных объектов на основе метода мембранной фильтрации с использованием наиболее эффективных фильтрующих мембран и эффективной фильтровальной установки.
4,Апробировать разработанный метод концентрирования вирусов в натурных условиях.
5.Провести сравнительную оценку эффективности
разработанного метода с существующими методами концентрирования вирусов из воды в экспериментальных условиях.
Научная новизна. Впервые:
- проведена оценка эффективности 9 позитивно- заряженных
фильтрующих мембран отечественного производства различной сырьевой и технологической основы с размером пор 0,2 мкм и выявлена наиболее эффективная для санитар но-вирусологических исследований, позволяющая фильтрование воды в режиме микрофильтрации в отношении концентрирования вирусов из воды;
- дана сравнительная оценка эффективности фильтровальных
мембранных установок различного типа в комплекте с мембранами
типа ММК 1 и выявлена наиболее эффективная для концентрирования
вирусов из воды различных водных объектов;
- определены оптимальные режимы сорбции и элюции для
эффективного концентрирования энтеровирусов на установке МФМ
0142 с мембранами ММК 1 при санитарно-вирусологическом
исследовании воды;
- экспериментально обоснован и разработан унифицированный
метод концентрирования энтеровирусов из питьевых, подземных,
речных и сточных вод с использованием метода мембранной
фильтрации в режиме микрофильтрации.
Практическая значимость. Материалы исследований использованы при разработке:
МУК 4.2. 2005 «Методические указания по санитарно-вирусологическому контролю водных объектов окружающей среды»;
МУ 2.1.5. 2005 «Санитарно-вирусологический контроль, эффективности обеззараживания питьевых и сточных вод УФ-облучением».
Основные положения, выносимые на защиту оценка эффективности 9 положительно-заряженных фильтрующих мембран отечественного производства, изготовленных
на различной сырьевой и технологической основе с различными модификациями с размером пор 0,2 мкм для концентрирования энтеровирусов из воды;
оценка эффективности фильтровальных мембранных установок различного типа для их использования при проведении санитарно-вирусологических исследований;
экспериментальное обоснование метода мембранной фильтрации в режиме микрофильтрации для концентрирования вирусов из воды различных водных объектов на установке МФМ 0142 с мембраной ММК 1;
разработка унифицированного метода мембранной фильтрации в режиме микрофильтрации для индикации вирусов в различных водных объектах с использованием установки МФМ 0142 с мембраной ММК 1.
ЧАСТЫ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Метод мембранной фильтрации и его применение в микробиологических исследованиях
Мембранная фильтрация - один из наиболее важных процессов в лабораторных исследованиях и в промышленности. Мембранная фильтрация - это разновидность фильтрации, когда фильтр представляет собой тонкую перегородку толщиной менее 0,1 мм с высокой степенью пористости.
Мембраны начали использовать более ста лет назад, когда в 1855 г. Фик (17) для изучения явления диффузии применил полупроницаемые перегородки. Однако главный прогресс произошел, когда мембраны начали изготавливать из нитрата целлюлозы (нитроцеллюлозы). Сначала эти мембраны получались с порами неконтролируемых размеров, но в 1907 г. Belfort G. (92) разработал метод изготовления мембран калиброванной проницаемости.
Мембрана представляет собой тонкую (не более 0,3 мм) перегородку (обычно полимерную), имеющую на микроскопическом уровне вид капиллярного, сетчатого или губчатого каркаса, отдельные элементы структуры которого представляют собой неразрывное целое. Порами в мембранах являются просветы между звеньями этого пористого каркаса. Мембрана может быть различной толщины, ее структура может быть гомогенной или гетерогенной, транспорт через нее может быть активным или пассивным; мембраны могут быть природными или синтетическими, органическими или неорганическими, нейтральными или заряженными. (17, 51),
Пористые мембраны имеют фиксированные поры размером 0.1-10 мкм для микрофильтрации или 2-100 нм для ультрафильтрации. Мембраны, которые способны механически (стерически) задерживать вирусы относятся к ультрафильтрационным мембранам. Диаметр пор ультрафильтров меньше, чем размер вирусов. Эффективность сорбции при их использовании составляет 100 % и чувствительность метода -до 70 % (92).
В 70-х годах за рубежом широко использовались ультрафильтры для концентрирования вирусов из сточной и питьевой воды. Использовались ультрафильтры из альгината алюминия (168, 173). Nupen Е. и Stander G. (155) применили полимерные ультрафильтрационные мембраны для концентрирования вирусов из 10 л воды. Элюцию сконцентрированных вирусов с мембран проводили 10 %. раствором бычьей сыворотки. Эффективность концентрирования составила 70 %. Foliguet J. и др. (114) концентрировали полиовирус Г типа на ультрафильтрационных мембранах на целлюлозной основе в системе тангенциального потока. Эффективность концентрирования колебалась в пределах 50-100 %. Система тангенциально-проточного движения жидкости способствует увеличению производительности при ультрафильтрации (179).
Berman D. и др. (94) описали метод концентрирования полиовируса из воды с помощью ультрафильтрации. Было достигнуто 70 % - ное выделение вирусов при 2000 - кратном их концентрировании. Такие же результаты получены Belfort G. и Winoma L. (92, 187) при концентрировании вирусов на ультрафильтрах в виде полых волокон.
В Германии разработан метод, который является комбинацией мембранной ультрафильтрации и использования адсорбента на основе пылевых фракций кокса бурого угля (153). Использование адсорбента позволяет в значительной степени повысить производительность и эффективность ультрафильтрации, что является перспективным при крупнотоннажных технологиях очистки.
В Баварии (ФРГ), также как ив Германии для подготовки питьевой воды также используется метод ультрафильтрации (125).
В Италии (110) для концентрирования полиовируса и вируса гепатита А используются полисульфонатные ультрафильтры. Наблюдается 100 % - ное концентрирование, но с увеличением давления притока воды процент эффективности снижается.
Ультрафильтрация также применяется для вторичного концентрирования вирусов (ПО) с целью уменьшения объема исследуемой пробы.
Несмотря на 100 % сорбцию вирусов при использовании ультрафильтров,, этот метод не нашел широкого применения в практике, так как обладает рядом недостатков. К основным недостаткам ультрафильтрации относятся неполная элюция вирусов с поверхности мембраны, быстрое забивание пор мембраны взвешенными частицами, очень большое сопротивление потоку жидкости, что не позволяет фильтрацию больших объемов воды (77).-. Размеры.пор микрофильтрационных мембран варьируются от 10 до 0.05 мкм.
Помимо простых мембран, которые действуют как чисто поверхностные, при этом удерживаемые частицы остаются сверху матрицы фильтра, широко используют также и глубинные, которые представляют собой сотканные или уложенные таким образом волокна, что фильтруемая жидкость, прежде чем покинуть фильтр, должна пройти длинный извилистый путь (17).
Несмотря на то, что у микрофильтрационных мембран поры больше чем размеры вирусных частиц, с их помощью можно концентрировать вирусы, которые адсорбируются на матрице мембраны. В адсорбции вирусов на мембранный фильтр имеют место слабые взаимодействия типа вандерваальсовых сил, гидрофобных взаимодействий и водородных связей (96), но главную: роль в связыванию играют электростатистические силы (17).
Поверхности мембранных фильтров обычно заряжены отрицательно. Вирусы же, как правило, при нейтральных значениях рН заряжены отрицательно и не адсорбируются. Однако если рН среды становится меньше 4, матрица мембраны перезаряжается, она становится положительно заряженной и начинает адсорбировать вирусные частицы. Таким образом, если водную пробу подкислить (17, 91, 103), а затем профильтровать через мембрану, то практически все вирусные частицы свяжутся с мембраной. Добавление катионов, особенно многовалентных, таких как алюминий, магний или натрий увеличивают эффективность перезарядки матрицы мембраны (91, 106, 108,144, 177,182, 185).
Также разработаны фильтры, несущие в нейтральной области рН положительный заряд (17, 133, 134, 162, 165, 174, 178), что позволяет избежать необходимости подкисления воды на стадии адсорбции вирусов, что может вызвать инактивацию вирусов. Кроме того, фильтры модифицируют и различными другими методами. В качестве примера можно привести метод обработки фильтра растворами солей хлорида железа и после высушивания гидридом магния, алюминия, натрия или аммония (145, 182).
Изучение сорбции вирусов на позитивно-заряженных мембранных фильтрах изготовленных на различной сырьевой и технологической основе с различными модификациями
Экспетшментальный раздел включает изучение эффективности различных фильтрующих мембран отечественного производства в отношении концентрирования вирусов из воды различных водных объектов в режиме микрофильтрации; дающих возможность концентрирования с большей скоростью, чем на ультрафильтрах и мембранных модулей и оценку эффективности различных фильтрующих мембранных модулей.
Результатами экспериментальных исследований обоснована перспективность использования мембранной фильтрации для концентрирования вирусов из воды и определены оптимальные режимы для отработки унифицированного метода выделения энтеровирусов из воды различных водных объектов.
Методический раздел включает отработку метода концентрирования энтеровирусов из больших объемов питьевых, природных и сточных вод и сравнительную оценку эффективности разработанного метода и методов индикации вирусов в воде, рекомендуемых в настоящее время для санитарной практики.
При проведении методических исследований соблюдался принцип максимального приближения к натурным условиям в отношении выбора водных объектов и концентрации модельных микроорганизмов в экспериментальных условиях. Одним из важнейших этапов санитарно-вирусологического контроля качества воды является этап концентрирования вирусов из больших объемов воды. Начиная с 70-х годов для этих целей в нашей стране использовали: - методы сорбции вирусов на различных фильтрующих материалах с последующей десорбцией с них; - методы осаждения вирусов высокополимерными системами гелями; - методы сорбции вирусов на искусственных и естественных сорбентах; - ультрафильтрацию с использованием мембран в виде листов, дисков или полых волокон; - использование водно-полимерных двухфазных систем (жидкостная экстракция). Однако большинство из этих методов не нашли широкого применения для исследования больших объемов воды на наличие вирусов. Метод ультрафильтрации обладает высокой эффективностью, но не позволяет проводить фильтрование больших объемов воды из-за быстрого забивания пор, методы осаждения недостаточно эффективны при низких концентрациях вирусов, а метод гидроэкстракции можно использовать лишь при работе с малыми объемами воды. Мембранная фильтрация, либо сама по себе, либо в сочетании с глубинными фильтрами представляет собой один из наиболее перспективных методов концентрирования вирусов.
Поэтому задачей исследований было изучение сорбции вирусов на мембранных фильтрах с размером пор 0,2 мкм, обеспечивающий фильтрацию больших объемов воды с большей скоростью.
Механизм сорбция вирусов на мембранах с размером пор 0,2 мкм (больше размера вирусных частиц) обусловлена по данным литературы слабыми взаимодействиями типа вандерваальсовых сил, гидрофобных взаимодействий и водородных связей, но главную роль в связывании играют электростатистические силы. Поскольку, вирусы при нейтральных рН заряжены отрицательно, то они должны адсорбироваться на положительно заряженных мембранных фильтрах, несущих в нейтральной области рН положительный заряд (рис. 1).
Преимуществом таких фильтров является то, что не требуется. В связи с этим, задачей данного раздела исследований являлось изучение сорбции модельных микроорганизмов на мембранных подкисления исследуемой воды, что может инактивировать вирусы.
Исследования проводили в экспериментальных условиях с искусственно заражаемой водопроводной водой. В качестве модели вирусного загрязнения использовали РНК-содержащий фаг MS-2 в концентрациях 102 БОЕ/100 мл, 103 БОЕ/100 мл и 104 БОЕ/100 мл. Исходную концентрацию тест-микроорганизма определяли как раститровкой внесенной затравки в рабочий раствор, так и непосредственно после его внесения в исследуемую пробу воды. Для фильтрования исследуемой воды использовали установку типа АФ-142 «К». Перед фильтрацией фильтр о держатель протирали ватным тампоном, смоченным спиртом ректификованным 70 и обжигали. После охлаждения на нижнюю часть фильтродержателя помещали стерильным пинцетом влажный мембранный фильтр, предварительно смоченный стерильной дистиллированной водой. Затем мембрану прижимали верхней частью фильтродержателя и закрепляли зажимами, равномерно завинчивая со всех сторон. Исследуемый объем воды наливали в напорную емкость, крышку тщательно закрепляли зажимами, включали подачу давления (1,5-2,0 бара), после чего вода направлялась в фильтрдержатель со скоростью около 100 мл/мин,.и фильтровалась через мембрану.
Для изучения сорбционной способности фильтра изучали концентрации вируса в исходной воде и фильтрате. По разнице между концентрациями тест-микроорганизмов, вносимыми в воду и определяемыми в фильтрате, вычисляли эффективность сорбции.,
Как видно из данных, представленных в таблице 1, фильтрующие мембраны обладали различной степенью сорбции в отношении фага MS-2. Низкий процент сорбции наблюдался у фильтрующих мембран, изготовленных из металлокерамики, и составлял 24,5-26,3 %, а у модифицированных металлокерамических мембран процент сорбции был чуть выше и составлял 26,5-40,1 %. Следует отметить, что с увеличением титра вируса процент сорбции также увеличивался.
Оценка эффективности фильтрационной установки типа АФ-142 «К» в отношении концентрирования вирусов из воды
Для проведения вирусологического анализа воды необходимо наличие фильтровальной установки, позволяющей концентрировать вирусы из больших объемов воды. В связи с этим задачей данного исследования было изучение эффективности различных фильтровальных мембранных модулей для выявления наиболее эффективной, простой и удобной в обращении и обладающей высокой производительностью в отношении концентрирования вирусов из больших объемов воды на фильтрующих мембранах типа ММК, модифицированной 0,5% соединениями аминов, как наиболее эффективной по результатам оценки эффективности концентрирующей способности, представленные в предыдущей главе.
Устройство предназначено для использования в аналитической химии, биотехнологии, фармацевтической промышленности для выделения и концентрирования следовых количеств ценных компонентов из водных растворов, оно состоит из двух мембранных модулей, расположенных друг над другом для двух фильтрационных мембран в 142 мм, напорной емкости и насоса для подачи воды под давлением. Мы провели оценку данного устройства с целью ее последующего использования при проведении санитарно-вирусологаческих исследований при оценке качества воды.
Исследования проводили в экспериментальных условиях с искусственно заражаемой водопроводной водой. В качестве моделей вирусного загрязнения использовали РНК-содержащий фаг MS-2 в концентрациях 10 БОЕ/100 мл и 10 БОЕ/100 мл и вирус полиомиелита в концентрациях 103ТЦД5с/ 10 л. и 104ТЦД5о/10 л. Десорбцию вирусов с, фильтров проводили 3% раствором бифэкстракта на трисбуфере с рН 9,1-9,5. После фильтрации рН элюента доводили до 7,0-7,2 0.1N раствором соляной кислоты. Исходную концентрацию тест-микроорганизма определяли как раститровкой внесенной затравки, так и непосредственно после его внесения в исследуемую пробу воды. Перед фильтрацией фильтродержатели стерилизовали - протирали ватным тампоном, смоченным спиртом ректифицированным 70 и обжигали; После охлаждения на нижнюю и верхнюю части фильтрдержателя клали стерильным пинцетом влажные мембранные фильтры типа ММК, модифицированные 0,5% соединениями аминов, предварительно смоченные в стерильной емкости стерильной дистиллированной водой. Затем мембраны прижимали и закрепляли, завинчивая зажимом. Исследуемый объем воды наливали в напорную емкость, крышку тщательно закрепляли зажимом, включали подачу давления (1,5-2,0 бара) и фильтровали исследуемую пробу через мембраны.
Для изучения эффективности данной установки в отношении выделения вирусов из воды изучали исходную воду, фильтрат и элюат, полученный в два этапа: 1 - продавливанием элюирующего раствора через мембрану и 2"- полученный путем механического смыва с мембраны - на наличие вирусов. По разнице между концентрациями тест-микроорганизмов, вносимыми в воду и определяемыми в фильтрате и элюате, вычисляли эффективность установки. Как видно из представленных в таблицах 6 и 7 данных данная установка, хотя и дала 100% сорбцию, обладает низкой эффективностью элюции сконцентрированных вирусов как в отношении фага (5,2-6,7%), так и в отношении полиовируса (4,5-6,3%)- Кроме того, скорость фильтрации 10 л водопроводной воды составляет 140 мин, что говорит о его не очень высокой производительности.
Таким образом, в результате проведенных исследований выявили, что данная установка обладает низкой эффективностью в отношении выделения вирусов из воды и не пригодна для вирусологического анализа воды.
Аппарат фильтрационный используется для концентрирования вирусов с целью их дальнейшего исследования. Он предназначен для: использования на предприятиях санитарно-эпидемиологической службы, водоснабжения, в экологических и природных службах.
Аппарат работает по методу мембранной фильтрации: определенный объем воды наливается в напорную стальную емкость, затем вода нагнетается в фильтродержатель и отфильтровывается.
Исследования проводили в экспериментальных условиях с искусственным заражением водопроводной дехлорированной воды. В качестве моделей вирусного загрязнения использовали РНК-содержащий фаг - MS-2 в концентрациях 10 и 10 БОЕ/ 100 мл и вирус полиомиелита 1 типа (штамм LSc 2ab) в концентрациях 103ТЦД5о/ Юли 1О4ТЦД50/10л. На первом этапе изучали эффективность сорбции на данной установке в отношении фага MS-2 в зависимости от исходной концентрации. Результаты проведенных исследовании представлены в таблице 8
Полученные результаты показали, что эффективность сорбции не зависит от исходной концентрации тест-микрорганизма и составляет 97 %. После окончания фильтрования откручивали зажимы и снимали верхнюю часть фильтродержателя. Мембрану осторожно приподнимали за край фламбированным пинцетом и переносили в стерильную емкость (чашка Петри с диаметром 142 мм). Затем на поверхность мембраны наносили 10 мл элюента (3% бифэкстракт на трисбуфере с рН 9,1-9,5) и стерильной пипеткой с целым концом проводили механический смыв (соскабливанием и струей) вируса с поверхности мембраны в течение нескольких минут. Полученный элюат переносили в стерильный флакон. Затем на эту же мембрану наносили второй объем (10 мл) того же элюента и проводили вторичное смывание вирусов струей с обеих сторон мембраны и вторую часть элюата помещали в тот же флакон, что и первую. Затем рН полученного элюата доводили до 7,0-7,5 1 N раствором соляной кислоты.
Оценка эффективности мембранного фильтрующего модуля МФМ 0142 в отношении концентрирования вирусов из нативных вод
На основании результатов проведенных экспериментальных исследований; подтвержденных расчетными данными была обоснована эффективность мембранного модуля МФМ 0142 с фильтрующей мембраной типа ММК, модифицированной 0,5% соединениями аминов, а также определены оптимальные режимы для разработки: унифицированного метода для концентрирования энтеровирусов в воде различных водных объектов.
В связи с этим основной задачей данного раздела работы являлась разработка метода концентрирования вирусов из больших объемов воды, регламентируемых в существующих методических указаниях.
На основании проведенных экспериментальных исследований было установлено, что эффективность сорбции вирусов не зависит от его исходной концентрации и во всех случаях составлял 100%. При этом установлено, что - эффективность сорбции не зависит от скорости фильтрации и давления; -скорость фильтрации не зависит от типа воды (в пределах нормируемых объемов) и ее мутности; При этом особую методическую сложность представлял этап десорбции вирусов с мембраны. По данным, полученных в экспериментальных исследований был выбран наиболее эффективный десорбирующие раствор - 3% бифэкстракт на трисбуфере (рН 9,1-9,5). В результате проведенных экспериментальных исследований по отработке оптимальных режимов элюции сорбированных вирусов фильтрующей мембраны установлено: -эффективность элюции не зависит от исходной концентрации вируса; -оптимальным объемом элюента является 60 мл (по 20 мл в трех последовательных смывах); -выход С является наиболее эффективным вариантом выхода элюирующего раствора (элюента). Отработка оптимального режима элюции дала нам возможность приступить к изучению эффективности метода концентрирования вирусов из больших объемов воды при использовании метода мембранной фильтрации на МФМ с ММК 1, Задача была выполнена с учетом рекомендаций для объема исследуемой воды при проведении санитарно-вирусологического контроля качества вод разной степени загрязнения. Изучение эффективности выделения вирусов из, питьевых, природных и сточных вод было проведено нами с учетом всех методических приемов, разработанных с целью оптимизации процесса элюции вирусов с фильтрующей мембраны. Вышеуказанные эксперименты были проведены в условиях приближенных к натурным. В исследуемые пробы натурных вод добавляли концентрации вирусов из расчета реально определяемых для данного вида водных объектов или превышающих их на 1-2 порядка. Исследования проводили на модели фага MS-2 и полиовируса. С учетом выше указанных методических приемов нами было проведено изучение эффективности данного метода в отношении выделения вирусов из больших объемов воды различных водных объектов. Результаты данных исследований приведены в таблице 24.
Данная таблица демонстрирует высокий процент выделения бактериофага MS-2 и полиовируса из водопроводной воды - 83,3% и 84,8% соответственно. Из воды подземного водоисточника эффективность концентрирования фага составила 85,8%, полиовируса - 83,6%. Для речной воды эффективность выделения тест-микроорганизмов составляет 86,8% и 84,6% соответственно; из сточной воды - 84,6% и 85,9%.
Анализ полученных данных показывает высокую эффективность разработанного нами метода выделения энтеровирусов из питьевых, природных, и сточных вод с использованием метода мембранной фильтрации в режиме микрофильтрации на МФМ 0142. Метод является универсальным — позволяет проводить выделение энтеровирусов из воды различных водных объектов (в пределах нормируемых объемов). Разная степень органического, неорганического и микробного загрязнения питьевых, природных и сточных вод не влияет на эффективность концентрирования вирусов из этих вод. Метод прост в исполнении, технически доступен, экономичен и позволяет значительно сократить время концентрирования (до 43 минут).
Предлагается следующая методика проведения анализа для выделения энтеровирусов из воды различных водных объектов:
Перед фильтрацией мембранный модуль протирают ватным тампоном, смоченным спиртом ректификованным 70 и обжигают. После охлаждения на нижнюю часть модуля (фильтродержатель) кладут стерильным пинцетом влажный мембранный фильтр, предварительно смоченный в стерильной водопроводной воде. Затем фильтр прижимают верхней частью модуля и закрепляют зажимом, равномерно завинчивая.
Исследуемый объем воды наливается в напорную емкость, крышка тщательно закрепляется зажимом, включается подача давления (1,5-2,0 бара), после чего вода направляется в модуль со скоростью около 232 мл/мин, и фильтруется через мембрану.
После окончания фильтрования элюцию вирусов с мембран проводят путем смыва 60 мл элюента (3% бифэкстракт на трисбуфере или МПБ на фосфатном буфере при рН 9,1-9,5) 20-кубовым одноразовым шприцом, который подсоединяется к специальному смывному проходу в три порции (по 20 мл).
Полученный элюат переносится в стерильный флакон. Затем рН полученного элюата доводится до 7,0-7,5 1 N раствором, соляной кислоты. Для удаления бактериальной микрофлоры элюат подвергается обработке хлороформом - добавляют в элюат (1 мл на 10 мл элюата), интенсивно встряхивают 10 минут и центрифугируют 10 минут при 2000 оборотов в минуту для разделения фаз. Водную фазу (верхнюю) аккуратно отбирают пипеткой в стерильный флакон, добавляют 100 ME/ мл пенициллина и 10,0 мг/ мл стрептомицина.
Стерильные элюаты хранят до испытания при +4 С не более 24-х часов. При температуре -20С их можно хранить в течение 1 года. При необходимости многократного исследования, элюат делят на несколько порций, чтобы избежать повторного замораживания.
