Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Оценка органной специфичности мутагенного действия различных факторов (обзор литературы) 16
Собственные исследования
Глава 2. Материал и методы исследования 63
2.1. Разработка и усовершенствование микроядерного теста на разных органах млекопитающих in vivo 63
2.1.1. Анализ мутагенной активности в гепатоцитах млекопитающих метафазным методом in vivo 63
2.1.2. Сравнение способов приготовления препаратов для выявления микроядер 66
2.2. Методики приготовления суспензионных препаратов разных органов лабораторных животных путем диссоциации 5% раствором сахарозы (способ 1: приготовление препаратов ех tempore) 69
2.2.1. Микроядерный тест на клетках печени 69
2.2.2. Микроядерный тест на клетках органов желудочно-кишечного тракта (преджелудка, желудка, 12-перстной, подвздошной и толстой кишки) 71
2.2.3. Микроядерный тест на клетках легких 73
2.2.4. Микроядерный тест на клетках почек 74
2.2.5. Микроядерный тест на клетках мочевого пузыря 75
2.2.6. Микроядерный тест на клетках семенников 75
2.3. Методики приготовления суспензионных препаратов разных органов лабораторных животных после фиксации формалином (способ 2: приготовление препаратов в удобное для исследователя время) 76
2.3.1. Микроядерный тест на клетках органов желудочно-кишечного тракта (преджелудка, желудка, 12-перстной. подвздошной и толстой кишки) 77
2.3.2. Микроядерный тест на клетках легких 83
2.3.3. Микроядерный тест на клетках мочевого пузыря 85
2.2.1. Микроядерный тест на гепатоцитах мышей и крыс
2.4. Микроядерный тест на полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга мышей 86
2.5. Общие подходы к анализу препаратов 89
2.6. Проведение экспериментов 90
2.6.1. Выбор веществ для апробации предлагаемого подхода к оценке органной специфичности цитогенетического эффекта з
2.6.2. Характеристика исследуемых веществ и смесей 92
2.6.3. Лабораторные животные 95
2.6.4. Схемы экспериментов 96
2.7. Оценка результатов экспериментов, проведенных с использованием микроядерных тестов
2.7.1. Статистический анализ 101
2.7.2. Кариометрия. Алгоритм разделения кластогенного и анеугенного действия генотоксических веществ в микроядерном тесте 103
2.7.3. Расчет удваивающей дозы 104
Глава 3. Сравнительная оценка спонтанного уровня цитогенетических повреждений в клетках разных органов с помощью микроядерного теста 105
Глава 4. Изучение мутагенной активности химических соединений и выявление органов-мишеней у лабораторных животных с помощью микроядерных тестов 119
4.1. Анализ мутагенной активности бенз(а)пирена в разных органах млекопитающих 119
4.2.Анализ мутагенной активности 1,2-диметилгидразина в разных органах млекопитающих 133
4.3. Анализ мутагенной активности галопропанов в разных органах млекопитающих 149
4.3.1. 1,2-дибром-З-хлорпропан 149
4.3.2. 1,2-дибромпропан 162
4.3.3. 1,1,3-трибромпропан
4.4. Анализ мутагенной активности N-нитрозодиэтиламина в разных органах млекопитающих 183
4.5. Анализ мутагенной активности циклофосфамида в разных органах млекопитающих 200
4.6. Анализ мутагенной активности бензамида в разных органах млекопитающих
4.7. Анализ мутагенной активности йода в разных органах млекопитающих 223
4.8. Анализ мутагенной активности хризотил-асбеста в разных органах млекопитающих 229
4.9. Анализ мутагенной активности продуктов хлорирования органических соединений в разных органах млекопитающих
4.9.1. Продукты хлорирования циклогексена 249
4.9.2. Продукты хлорирования бутанола 256
Глава 5. Изучение цитогенетического действия у-излучения в разных органах мышей 262
5.1. Анализ мутагенного действия у-излучения на гепатоциты мышей, экспонированных в 10-километровой зоне
Чернобыльской АЭС 262 5.2. Анализ мутагенного действия внешнего и инкорпорированного у-излучения в дозе 3 Гр на гепатоциты
мышей 265
5.3. Анализ мутагенного действия у-излучения в дозах 6 и 7 Гр на клетки толстой кишки и легких мышей 266
Обсуждение
Глава 6. Оценка мутагенного действия химических соединений в клетках разных органов 274
6.1. Мутагенный эффект химических соединений в клетках печени 274
6.2. Мутагенный эффект химических соединений в клетках легких 291
6.3. Мутагенный эффект химических соединений в клетках преджелудка и желудка 303
6.4. Мутагенный эффект химических соединений в клетках толстой кишки 314
6.5. Мутагенный эффект химических соединений в клетках мочевого пузыря 328
Глава 7. Оценка органной специфичности мутагенного действия химических соединений 334
7.1. Оценка органной специфичности мутагенного эффекта химических соединений на разных этапах его реализации 334
7.2. Качественные характеристики органной специфичности мутагенного эффекта химических соединений
7.3. Количественные характеристики органной специфичности мутагенного эффекта химических соединений 346
7.4. Сравнение органной специфичности мутагенного действия химических соединений у животных разных видов 352
7.5. Сравнение органной специфичности мутагенного действия химических соединений у животных разного пола 358
7.6. Сравнение органной специфичности мутагенного действия химических соединений у животных разных линий 360
7.7. Зависимость мутагенного эффекта химических соединений от типа исследуемых клеток. Оценка тканевой и клеточной специфичности 363
7.8. Дозовые параметры оценки органной специфичности мутагенного действия химических соединений 369
Глава 8. Система оценки мутагенного эффекта химических соединений с учетом органной специфичности в опытах на млекопитающих 382
8.1. Описание и характеристика системы оценки мутагенного эффекта химических соединений с учетом органной специфичности 382 8.2. Алгоритм тестирования веществ для оценки их мутагенной активности с учетом органной специфичности 392
8.3. Регламентирование химических загрязнений окружающей среды, обладающих мутагенной активностью, с учетом органной специфичности 394
8.4. Применение системы оценки мутагенного эффекта химических соединений с учетом органной специфичности для прогноза канцерогенных свойств вещества и органов-мишеней канцерогенного действия 398
Заключение 403
Выводы 407
Список литературы
- Анализ мутагенной активности в гепатоцитах млекопитающих метафазным методом in vivo
- Методики приготовления суспензионных препаратов разных органов лабораторных животных после фиксации формалином (способ 2: приготовление препаратов в удобное для исследователя время)
- Анализ мутагенной активности продуктов хлорирования органических соединений в разных органах млекопитающих
- Мутагенный эффект химических соединений в клетках преджелудка и желудка
Введение к работе
з
Актуальность проблемы. Одной из важных задач гигиены окружающей :реды является оценка факторов окружающей среды, в том числе их іутагенньїх и канцерогенных свойств (Г.И. Сидоренко и соавт., 1995; Ю.А. 'ахманин и соавт. 2001; Н.П. Бочков, А.Н. Чеботарев, 1989; Н.П. Бочков, 2001; І.С. Журков, 1986; 1998; Г.Н. Красовскнй и соавт., 1985; А.П. Ильницкий н оавт., 1993; Ю.А. Ревазова, B.C. Журков, 2001). Общее число ежегодно :интезируемых химических соединений превышает 5 млн. При выборочных іспьітаниях в разных тест-системах у 5-7% (250-350 тыс.) этих соединений іьіявлєньі мутагенные свойства (В.М. Крнвочуров и соавт., 1998). Примерно акое же количество веществ (5-10%), с которыми контактирует человек, южет обладать канцерогенной активностью (Н.П. Бочков, А.Н. Чеботарев, 989). Химические канцерогены являются причиной развития онкологических аболеваний приблизительно в 80% случаев (Эпидемиология рака, 1979). По овременным представлениям канцерогенный эффект развивается юследовательно, проходя этапы инициации, промоции и прогрессии. В основе іазвития опухолей как на стадии инициации, так и, по-видимому, промоции, ежат генотоксические эффекты, и установлена высокая (до 90%) корреляция іутагешшх и канцерогенных свойств химических соединений (J.Ashby, LW.Tennant, 1994; R.Benigni, 1995). Можно считать доказанным, что озникновению и развитию злокачественного роста предшествует накопление іутаций в определенных генах в тех тканях, которые вовлекаются в нкологический процесс (В.Н. Горбунова, 2001). Роль мутагенов не граничивается индукцией опухолей, она более многозначна. Мутационные овреждения зародышевых клеток приводят к спонтанным абортам и рожденным порокам развития. Мутации в половых клетках вызывают овышение частоты наследственных болезней в популяции. Мутационные овреждения соматических клеток обуславливают преждевременное старение
организма. Генетические дефекты являются причиной значительной дол заболеваний у человека, хотя пока не ясно, в какой мере присутствующие окружающей среде химические вещества обусловливают генетические болезн (Руководство по краткосрочным тестам, 1989).
В настоящее время большинство исследований мутагенных свойст химических соединений проводится на прокариотах с помощью теста Эймс! Значительно меньше исследований выполнено на млекопитающих in vivo. ] этих опытах данные преимущественно получены на клетках костного мозг мышей и крыс. Система выявления и оценки мутагенных свойств химически веществ при их гигиеническом регламентировании предусматривас исследование мутагенного действия веществ на клетках костного мозг млекопитающих in vivo и в тесте доминантных летальных мутаций (Журко B.C., 1986). В клетках других органов мутагенный эффект различных факторо мало изучен. Однако по нашим данным и результатам других исследовани (G.Krishna, J.C.Theiss, 1995; F.A.Angelosanto, 1995; М. Hayashi et al., 2000) ря мутагенов не индуцирует цитогенетические повреждения клеток костног мозга, но вызывает эффект в других органах. Общепринятый подход к оценк цитогенетического действия химических соединений на млекопитающих in viv приводит к тому, что вещества, не индуцирующие эффект в клетках костног мозга, могут считаться не мутагенными, несмотря на то, что их эффект в други органах не исследован. Например, известные гепатоканцерогеш нитрозодиметиламин и нитрозодиэтиламин не повышали уровен цитогенетических повреждений в клетках костного мозга, в связи с чеі считали, что они не мутагенны для млекопитающих, до тех пор пок положительный эффект не был выявлен в клетках печени (H.Barbason et al 1975; A. Tates et al, 1980). Кроме того, уровень мутагенного эффект отличается в клетках разных органов. По нашим данным минимальнс действующие дозы мутагена могут отличаться в различных тканях и органах
5-125 раз. В связи с этим, изучение органной специфичности мутагенов имеет большое значение для более корректного их регламентирования.
Другим важным аспектом проблемы оценки органной специфичности мутагенов является использование тестов на мутагенность для прогноза канцерогенных свойств. В настоящее время оценка мутагенных и канцерогенных свойств химических соединений с целью их гигиенического регламентирования проводится независимо. Для тестирования канцерогенов предусмотрено проведение двухгодичных экспериментов на лабораторных животных двух видов обоего пола с гистологическим выявлением опухолей во всех основных органах животного (Методические рекомендации, 1985). Однако объем, длительность и стоимость долгосрочных экспериментов на млекопитающих не позволяет проводить рутинное тестирование всех веществ на канцерогенность. Поэтому для решения вопроса о необходимости тестирования вещества на канцерогенность желательно проводить предварительную оценку его мутагенных свойств в системе краткосрочных тестов (А.П. Ильницкий и соавт., 1993; Г.А. Белицкий, В.В. Худолей, 1986; М. Hayashi et al., 2000). При изучении канцерогенов в краткосрочных тестах важно оценивать их органную специфичность, так как это одно из основных свойств канцерогенов. Развитие систем тестирования мутагенных и канцерогенных свойств химических соединений идет в направлении их сближения путем изучения мутагенной активности веществ в разных органах млекопитающих in vivo.
В связи с изложенным определена цель исследования - научное обоснование и разработка системы оценки мутагенного эффекта химических загрязнений у млекопитающих in vivo с учетом органной специфичности. Для достижения этой цели поставлены следующие задачи: 1. Провести сравнительный анализ имеющихся подходов к оценке органной специфичности мутагенного действия факторов окружающей среды и обосновать использование микроядерных тестов на клетках разных органов
6 млекопитающих in vivo как наиболее информативных и адекватных задачам гигиены окружающей среды.
-
Разработать и усовершенствовать суспензионные методики приготовление препаратов клеток разных органов млекопитающих in vivo для оценки частоты микроядер.
-
Провести сравнительную оценку спонтанного и индуцированногс химическими веществами и у-излучением уровня цитогенетическш повреждений в клетках разных органов с помощью микроядерных тестов и выявить органы-мишени мутагенного действия.
-
Провести анализ цитогенетпческого повреждения клеток разных органог млекопитающих in vivo в зависимости от дозы, типа мутагена і исследуемого органа; сравнить информативность показателе? количественной оценки для определения органов-мишеней мутагенного действия.
-
Определить зависимость органной специфичности мутагенного действие химических соединений от вида и пола животных, генотипа мышей.
-
Разработать систему оценки мутагенного эффекта химических загрязнений окружающей среды на млекопитающих in vivo с учетом органной специфичности.
-
Провести сравнительный анализ органной специфичности цитогенетического и канцерогенного эффекта веществ; обоснован возможность использования системы для прогноза канцерогенных свойсті химических соединений.
Научная новизна исследований заключается в том, что впервые
- научно обоснована и разработана система оценки мутагенного эффекте
химических загрязнений окружающей среды на млекопитающих in vivo с
учетом органной специфичности путем анализа цитогенетическо?
активности различных факторов и их совокупности в клетках органої
основных систем организма (пищеварительной, дыхательной, выделительной, кроветворной);
определены уровни спонтанной частоты микроядер в клетках разных органов (печени, легких, мочевом пузыре, разных отделах желудочно-кишечного тракта) мышей и/или крыс;
проведена количественная оценка органной специфичности и определены органы-мишени мутагенного действия бенз(а)пнрена (БП), 1,2-диметилгидразина (ДМГ), 1,2-дибром-З-хлорпропана (ДБХП), 1,2-дибромпропана (ДБП), 1,1,3-трибромпропана (ТБП), циклофосфамида (ІДФ), нитрозодиметиламина (НДЭА), бензамида, хризотил-асбеста, йодированной питьевой воды, смесей продуктов хлорирования циклогексена и бутанола у мышей и/или крыс;
обоснована необходимость количественной оценки органной специфичности мутагенного действия вещества для определения минимально-действующей (МДД) и «допустимой» дозы мутагена (ДДмут), классификации мутагенов, при изучении видовой, половой и клеточной специфичности;
показано, что видовая, половая и линейная чувствительность к мутагенному действию химических соединений, определенная с учетом органной специфичности, отличается по уровню эффекта, но не по его наличию или отсутствию;
определены показатели (МДД, удваивающие дозы и/или коэффициенты Р регрессионных уравнений) для выявления наиболее чувствительных органов-мишеней мутагенного и канцерогенного действия; для сравнения видовой, половой и линейной специфичности с учетом эффекта в разных органах наиболее информативным и чувствительным является показатель "удваивающая доза мутагена";
установлено, что локализация мутагенного эффекта вещества может изменяться в зависимости от дозы, поэтому при оценке органной специфичности необходимо исследовать не менее трех доз;
обосновано использование системы для оценки мутагенного эффекта и определения органов-мишеней при действии факторов разного типа (химических соединений, относящихся к разным структурным группам; смесей химических веществ, корпускулярных агентов, у-излучения);
обоснована возможность использования системы оценки мутагенного эффекта химических загрязнений окружающей среды на млекопитающих in vivo с учетом органной специфичности для прогноза канцерогенных свойств химических соединений и определения органов-мишеней канцерогенного действия.
Практическая значимость работы заключается в использовании системы оценки- мутагенного действия химических соединений с учетом органной специфичности для гигиенической оценки и регламентирования факторов окружающей среды. Оценка мутагенного эффекта химических соединений с учетом органной специфичности на млекопитающих in vivo позволяет повысить надежность выявления мутагенов, снизить количество ложно-положительных и ложно-отрицательных результатов при скрининге, прогнозировать канцерогенные свойства и включать эти вещества в список приоритетного тестирования на канцерогенность в долгосрочных экспериментах.
На основе системы впервые разработан алгоритм тестирования веществ для оценки их мутагенной активности с учетом органной специфичности. Он предназначен для использования в практических лабораториях, занимающихся тестированием мутагенных свойств различных факторов.
Установлена мутагенная и потенциальная канцерогенная опасность двух галопропанов - ДБП и ТБП.
В опытах на млекопитающих доказана возможность образования мутагенных продуктов при хлорировании циклогексена и бутанола -гигиенически значимых соединений, загрязняющих в составе сточных вод открытые водоемы.
Дано заключение о безопасности бснзамнда (промежуточного продукта производства красителей) при оценке мутагенных свойств в клетках костного мозга, преджелудка и желудка мышей в опытах in vivo в диапазоне доз от 12 до 300 мг/кг.
Установлена безопасность длительного потребления йодированной литьевой воды (концентрации йода 62,5 -1000 мкг/л) при оценке мутагенного эффекта в клетках костного мозга и мочевого пузыря крыс.
Материалы диссертационного исследования были использованы при тодготовке следующих методических документов:
"Методических указаний по изучению мутагенной активности химических
веществ при обосновании их ПДК в воде" (М., 1986), утвержденных
Минздравом СССР, №4110-86 от 12.06.1986 г.;
"Временных методических указаний по обоснованию предельно-допустимых концентраций (ПДК) загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест" (М., 1989) утвержденных Минздравом СССР, №468І-88 от 15.07.1988 г.;
Методических рекомендаций "Оценка мутагенных свойств
фармакологических средств" (М.,1998), утвержденных Фармкомитетом
Минздрава России 11.06.1998 (протокол №6);
"Методических указаний по прогнозированию канцерогенное фармакологических средств и вспомогательных веществ в КСТ", вошедших в "Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ" (М., 2000), утвержденное Фармкомитетом Минздрава России;
Методических рекомендаций "Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом" (М., 2001), утвержденных Межведомственным научным советом по экологии человека и гигиене окружающей среды.
Работа выполнена в плановом порядке и обобщает результаті многолетних (1986-2001 гг.) исследований, проведенных в лаборатори; мутагенеза в соответствии с планом Проблемной комиссии союзного значени "Научные основы гигиены окружающей среды" в рамках научне исследовательских работ НИИ экологии человека и гигиены окружающе среды им. А.Н. Сысина РАМН при участии с.н.с. к.б.н. И.Ф.Выскубенко и к.б^ О.Г. Саламатовой с личным вкладом не менее 80%. №N государственно регистрации тем 01.850000495; 01.870025753; 01.89.0040738; 01.91.001358С 01.920013586; 01.970002123; 01.970002125.
В работе использованы материалы совместных исследований по оценк мутагенной активности различных факторов с сотрудниками лаборатори комплексного эколого-гигиенического нормирования (рук.: д.м.н., проф. 3.V Жолдакова), цитогистологии (рук.: д.б.н. Н.Н. Беляева), гигиены питьевог водоснабжения (рук.: д.м.н. Р.И. Михайлова) НИИ экологии и гигиеш окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН; НИИ канцерогенеза ВОНЦ (руї лабораторий: д.м.н., проф. Г.А. Белицкий; д.м.н., проф.Л.А. Пылев); Институт общей генетики РАН (д.б.н., проф.М.Д. Померанцевой, к.б.н. Л.К. Рамайя).
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 2 международных, всесоюзных или российских симпозиумах, конференциях совещаниях: IX Всероссийском съезде гигиенистов и санитарных враче (Москва, 2001); 1 съезде токсикологов России (Москва, 1998); Четверто; международном конгрессе "Вода: экология и технология" (Москва, 2000 г. Международной конференции "Загрязнение окружающей среды. Проблем: токсикологии и эпидемиологии" (Пермь, 1993г.); Международном симпозиум «Проблемы токсикологии и прикладной экологии» (Москва-Пермь, июль 199 г.); 1-ом Международном симпозиуме "Окружающая среда и здравоохранени Исследования и разработки в странах Европейского сообществ (ЕС) и в СССІ (Франция, Аббеи де Воде-Серкэ, март 1990 г.); II Всесоюзном (Алма-Ат декабрь 1990 г.), I (третьем) и II (четвертом) Российском съездах медицински
II енетиков (Москва, 1994г., Курск, 2000); І Съезде Российского общества енетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова (Санкт-Петербург, 2000); 11 Іациональном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2001); I (сесогозном радиобиологическом съезде (Пущино, 1989); Ежегодных овещаниях Европейского общества по мутагенам окружающей среды: 21 - в Іраге (1991); 26 - в Риме (1996); 28 - в Зальцбурге (1998), 29 - в Копенгагене 1999); 7 Международной конференции по мутагенам окружающей среды Гулуза, 1997); заседаниях секции генетических аспектов проблемы "Человек и иосфера" при ГКНТ СССР "Тест-системы для оценки мутагенного потенциала агрязнителей окружающей среды" (Иркутск, 1984 г.); "Генетические оследствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами" Самарканд, 1990 г.); Всесоюзном симпозиуме "Объем и методы енотоксическои оценки и побочных эффектов биологически активных еществ" (Ленинград, май 1989г.); Научно-практической конференции стран ;НГ, Балтии, Закавказья "Проблемы антимутагенеза" (Минск, 1993); оссийской конференции "Мутагены окружающей среды" (Казань, 1996); аседании комиссии по канцерогенным факторам МЗ РФ (Москва, 1997). Публикации. По теме диссертации опубликовано 45 печатных работ. Структура ч объел» диссертации. Диссертационная работа состоит из ведения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, трех пав обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Текст зложен на */5У страницах машинописи, иллюстрирован /26 таблицами и 9. исунками. Указатель литературы содержит 419 источников, из них f/S течественных иЗйфшостранных авторов.
Основные положения, выносимые на защиту Система оценки мутагенного эффекта химических загрязнений окружающей среды с учетом органной специфичности в опытах на млекопитающих in vivo.
Качественная и количественная оценка органной специфичності мутагенного действия десяти химических соединений и двух смесей і опытах на млекопитающих.
Использование системы оценки мутагенного действия химически: соединений для анализа видовой и половой специфичности ; млекопитающих.
Регламентирование веществ, обладающих мутагенными свойствами і учетом органной специфичности.
Сравнительная оценка органной специфичности мутагенного і канцерогенного действия и прогноз канцерогенных свойств химически; соединений.
Материал, методы и объем исследований. Эксперименты проведень на неинбредных крысах и мышах, а также мышах (CBAxC57Bl/6)F|, СВА С57В1/6, Balb/c, 101/Н самцах и/или самках. Основными экспериментальным! методами были цитогенетические: анализ аберраций хромосом в клетка: костного мозга и печени и мнкроядерный тест на клетках разных тканей і органов мышей и крыс. Статистическая обработка полученных результате] проводилась с помощью интегрированного пакета анализа данных і компьютерной системе Statistica for Windows (в том числе, корреляционный дисперсионный и регрессионный анализ).
Для исследования выбраны хорошо изученные вещества, обладающие мутагенным и канцерогенным действием (табл. 1): БП, ДМГ, ДБХП, НДЭА ЦФ. Наряду с ДБХП были изучены его структурные гомологи - ДБП и ТБП обладающие мутагенным эффектом на Salmonella typhymurium или Drosophil melanogaster. Их канцерогенный эффект на млекопитающих не изучен Исследованные вещества являются представителями разных наиболее опасны: классов мутагенных соединений: полициклических ароматически: углеводородов (БП); азотистых ипритов (ЦФ); нитрозосоединений (НДЭА] гидразинов (ДМГ), галогенсодержащих соединений (ДБХП, ДБП, ТБП); амидо
(бензамид). В опытах на крысах изучен эффект одного из представителей группы минеральных пылей - хризотил-асбеста. Подход апробирован также при изучении двух смесей продуктов хлорирования циклогексена и бутанола. В хроническом опыте на крысах исследована цнтогенетическая активность йодированной питьевой воды. Микроядерные тесты апробированы при действии ("-излучения на клетках печени, легких и толстой кишки мышей. Всего было изучено действие 10 веществ, 2 смесей и разных режимов у-излучения. Проведено 38 экспериментов на 934 животных, у которых в совокупности исследовано 2711 органов и 3079980 клеток.
Таблица 1. Органная специфичность цитогенетического действия химических соединений
у мышей и крыс
Примечание. Исследованные органы обозначены серым цветом "+" -эффект выявлен;"-" -эффект не выявлен.
Анализ мутагенной активности в гепатоцитах млекопитающих метафазным методом in vivo
Этилнитрозомочевина индуцировала однонитевые разрывы ДНК дозо-зависимым способом в печени, мозге, семенниках и костном мозге мышей, причем, уровень эффекта этого канцерогена был приблизительно одинаков во всех исследованных органах [219].
В большом исследовании [318] проведен анализ 22 веществ в 7 органах млекопитающих на индукцию разрывов ДНК. Совпадение генотоксических и канцерогенных свойств химических соединений обнаружено в 62% случаев. Процент соответствия был еще выше, если анализировались эффекты только непрямых мутагенов.
Тест Comet. Метод оценки разрывов ДНК не так давно нашел применение в более простой и совершенной системе щелочного гель электрофореза одиночных клеток разных органов мышей. В отличие от применения трипсина для получения суспензии отдельных клеток авторы предложили методику приготовления гомогената клеток и выделения ядер. Каждый орган измельчали, суспендировали в охлажденном гомогенизирующем буфере, содержащем NaCl и Na2EDTA, слегка гомогенизировали с помощью Potter-гомогенизатора, установленного на льду, а затем осажденные с помощью центрифуги ядра клеток использовали для проведения щелочного гель электрофореза. Этот метод оценки разрывов ДНК одиночных клеток (точнее было бы сказать ядер) получил название тест Comet [345].
Тест был использован для оценки генотоксичности 8 канцерогенов печени грызунов (табл. 1.1.1.4.) в клетках 5 органов мышей (печени, легких, почках селезенке и костном мозге). Были исследованы такие канцерогены как р-аминоазобензол, аурамин, 2,4-диаминотолуол, р-дихлолробензол, этилентиомочевина (ЭТМ), стирол-7,8-оксид, фенобарбитал натрия и бензол-1,2,3,4,5,6-гексахлорид (БГХ); кроме р-аминоазобензола, эти соединения не индуцировали микроядра в клетках косного мозга. Мыши были забиты через 3 и 24 часа после введения каждого канцерогена. Р-аминоазабензол, ЭТМ и стирол-7,8-оксид индуцировали щелоче-лабильные повреждения ДНК во всех изученных органах. Аурамин, 2,4-диаминотолуол, р-дихлорбензол и фенобарбитал натрия также индуцировали повреждения, но эффект был наиболее выражен в печени. БГХ, не токсичный в тестах in vitro, не вызывал никаких эффектов. Оказалось возможным использование теста Comet для определения активности химических веществ, чья генотоксичность не выявлена в костном мозге [345].
Тест Comet был использован также для оценки генотоксичности 7 канцерогенных галоалканов и галоалкенов в клетках 7 органов мышей -желудке, печени, почках, мочевом пузыре, легких, мозге и костном мозге (табл. 1.1.1.4.). Были изучены 1,2-дибром-З-хлорпропан (ДБХП), 1,3-дихлорпропен (смесь цис- и транс-изомеров; ДХП), 1,2-дибромэтан (ДБЭ), 1,2-дихлорэтан (ДХЭ), винилбромид, дихлорметан, и четыреххлористый углерод. Мыши были забиты через 3 и 24 часа после введения канцерогена. ДХП и ДХЭ индуцировали повреждения ДНК во всех исследованных органах. Винилбромид увеличивал количество повреждений ДНК во всех органах, кроме костного мозга. ДБХП индуцировал повреждения в желудке, печени, почках, легких и костном мозге. ДБЭ - в желудке, печени, почках, мочевом пузыре и легких. ДХМ - в печени и легких. Поскольку не было выявлено случаев смерти, заболеваемости, клинических признаков, патологии органов или микроскопических признаков некроза, выявленные повреждения ДНК не были связаны с цитотоксичностью. С другой стороны, положительный ответ в печени, индуцируемый четыреххлористым углеродом, который сопровождался некрозом, посчитали за ложно-позитивный результат. В других тестах ДБХП индуцировал микроядра в костном мозге мышей, и все соединения, кроме четыреххлористого углерода, были мутагенны в тесте Эймса на Salmonella typhimurium. Авторы считают, что тест Comet может быть использован как дополнительный для определения генотоксичности галогенсодержащих соединений в нескольких органах мышей in vivo, поскольку мутагенные свойства этих соединений нельзя выявить микроядерным методом в клетках костного мозга. При испытании следует использовать дозы вещества, не индуцирующие некроз [349].
Методики приготовления суспензионных препаратов разных органов лабораторных животных после фиксации формалином (способ 2: приготовление препаратов в удобное для исследователя время)
Молекулярный механизм образования микроядер в результате нарушений веретена деления и канцерогенные эффекты. В последние ГОДБ исследователи уделяют особое внимание молекулярным механизмам процессов канцерогенеза, связанных с морфологическим и функциональным нарушением веретена деления. Последствием этого является нарушение митотического режима и каскадный запуск неконтролируемого безостановочного "порочного" круга деления. Важную роль в ответе на повреждение веретена деления и образование микроядер играет белок-супрессор опухолей р53 [292]. Он определяет переходы в G]/S и G2/M - контрольных точках клеточного цикла в ответ на различные клеточные стрессы, в том числе повреждение ДНК, экспрессию доминантного онкогена, гипоксию, метаболические изменения и вирусную инфекцию. Р53 может быть также активирован при повреждении веретена деления. Первоначально повреждение веретена деления приводит к активации независимого от р53 контрольного события при мета-анафазном переходе, которое препятствует прохождению клетки через митоз до того, как сформируется веретено деления. В конце концов, клетки выходят из этого процесса, названного "митотической пробуксовкой", после чего следует аберрантный митоз, в котором сестринские хроматиды не смогут разойтись должным образом. После "пробуксовки", р53 задерживает в Gi клетку с неповрежденным ядром, содержащим 4N ДНК, без ее разделения.
Клетки, в которых отсутствует р53 исходного типа, также задерживаются в митозе и не могут разделиться, что свидетельствует о независимости задержки митоза от р53. Однако эти клетки не блокированы от начала нового клеточного цикла и могут удваивать ДНК неконтролируемо, приводя к полиплоидии. Кроме того, р53-нулевые клетки, в которых нарушено веретено деления, часто приводят к образованию микроядер, появляющихся в результате плохой сегрегации хромосом, которые деконденсированы и расположены у ядерной оболочки. Р53 предотвращает их образование путем включения G2. Молекулярный механизм, с помощью которого р53 способен распознавать нарушения в митозе, все еще неизвестен, но может быть связан со способностью р53 регулировать удвоение центромер [292].
Молекулярный механизм образования микроядер в результате апоптоза [146]. Этот механизм был изучен на примере действия мышьяка. Мышьяк вызывает оксидативный стресс в клетках, что приводит к запуску разнообразных процессов, включая метаболические изменения, сопровождаемые остановкой роста и, в конечном счете, апоптозом. Морфологические изменения в клетках при действии мышьяка лежат в основе разрушения частей цитоскелета, ответственного за клеточную целостность, форму и передвижение. Однако, специфические особенности ультраструктурных изменений при воздействии мышьяка пока непонятны. Различные ткани и органы отличаются по чувствительности к мышьяку, в частности печень и кожа, которые наиболее изучены. Мышьяк вызывает гиперкератоз кожи и сквамозно-клеточный рак. Хотя мутагенность мышьяка не была полностью доказана, недавно было показано, что он индуцирует онкогенные мутации и действует только на определенные ферменты, связанные с репликацией и репарацией ДНК. Чувствительность веретена деления к мышьяку, особенно к его органическим соединениям, хорошо подтверждена появлением цитогенетических повреждений в экспонированных мышьяком популяциях. Индуцированный мышьяком стресс на молекулярном уровне считается химическим проявлением теплового шока. Подобно тепловому шоку, соединения мышьяка индуцируют белки теплового шока разного размера. Сигнальный каскад, запущенный тепловым стрессом, подобно действию мышьяка, индуцирует активность митоген-активирующих протеин-киназ, внеклеточных регулирующих киназ (JNK) и р38. Через JNK и р38 соединения мышьяка немедленно активируют гены c-fos, c-jun и egr-1, обычно активируемые различными факторами роста, цитокинами, сигналами дифференцирования и ДНК-повреждающими агентами. Подобно другим факторам, вызывающим стресс и образование радикалов кислорода, мышьяк стимулирует образование оксида нитрида, активацию транскрипции, индукцию поли(АДФ)-рибозилирование, истощение НАД, разрывы ДНК и образование микроядер [146].
В свете последних данных по молекулярным механизмам канцерогенеза, анеугенные эффекты различных факторов, выявляемые в микроядерном тесте, могут быть более важными индикаторами потенциальных канцерогенов, чем кластогенные эффекты, определяемые в тесте хромосомных аберраций. По указанным причинам оба теста нельзя рассматривать как полностью взаимозаменяемые.
Суммируя представленные данные можно выделить следующие преимущества микроядерного теста для оценки органной специфичности химических соединений:
1) тест позволяет выявлять не только кластогены, но и анеугены (яды веретена деления), которые могут иметь значение как на этапе инициации, так и промоции и прогрессии опухолей. Применение специальных методов для выявления центромерных участков в микроядре или определение размеров микроядер позволяют определить характер действия вещества как кластогена или анеугена;
2) тест может быть адаптирован для выявления генотоксических эффектов в нескольких органах одного и того же животного параллельно, тогда как другие методы применить для этой цели практически невозможно;
3) нет необходимости предварительного введения колхицина или 5-бромдезоксиуридина, поэтому частота микроядер может быть непосредственно определена у животных в токсикологическом эксперименте;
Анализ мутагенной активности продуктов хлорирования органических соединений в разных органах млекопитающих
Большой фактический материал по частоте клеток с микроядрами накоплен при проведении исследований на полихроматофильных эритроцитах костного мозга [36, 289, 221], тогда как по остальным органам выполнены единичные работы или такие данные отсутствуют. В этой главе представлены результаты оценки частоты микроядер в разных органах контрольных крыс и мышей. К сожалению, даже в обобщенных группах представлены результаты не более чем по 30 животным, а линейных мышей в группах было всего 6-12. Тем не менее, мы сочли необходимым представить эти данные в виде отдельной главы и по возможности сопоставить их с имеющимися данными литературы.
Костный мозг. Частота полихроматофильных эритроцитов с микроядрами в костном мозге представлена в таблице 3.1. В ней обобщены результаты 16 экспериментов.
В работе B.C. Журкова, Е.Г. Фельдт [36] показано, что частота клеток с микроядрами в костном мозге мышей в среднем составляет 1%о. В работе [289], обобщающей результаты международной программы Geneox, приведена частота ПХЭ с микроядрами у мышей разных линий. Этот показатель у самцов мышей (CBAxC57Bl/6)Fi составил 1,59%о (данные по 198 животным) и у самок этих же гибридов - 0,83%о (данные по 63 животным). Частота этого показателя в наших исследованиях хорошо соответствует приведенным данным - 1,45%о у самцов (24 животных) и 1,17%о ПХЭ у самок (6 животных). Данные по самцам практически совпадают, а данные по самкам также ниже, чем у самцов. Наиболее высокая частота ПХЭ с микроядрами отмечена у мышей Balb/c -3,89%о. В наших исследованиях у животных этой линии также отмечен самый высокий уровень ПХЭ с микроядрами в контроле - 2,08%о.
В соответствии с итоговым международным обзором, посвященным прошлому, настоящему и будущему микроядерного теста, частота клеток с микроядрами в костном мозге варьирует от 1 до 3 на 1000 [223]. По нашим данным, полученным на 63 мышах разных линий, пределы колебания показателя меньше - от 0,76 до 2,08 и они укладываются в среднюю часть диапазона, который указывает мировое сообщество [223, 221].
Частота ПХЭ с микроядрами у самцов крыс по нашим данным составляет 0,86%о (30 животных). В соответствии с обзором [221] частота клеток костного мозга с микроядрами у самцов крыс не превышает 1%о. В нашем исследовании на самках крыс частота этого показателя составила 2%о.
По результатам проведенного дисперсионного анализа показатель частоты клеток с микроядрами у контрольных животных не зависит от пола и линии животных. В связи с этим данные, полученные на самцах и самках, были объединены. Средняя частота ПХЭ с микроядрами в костном мозге 63 контрольных мышей составила 1,25%о, у 36 контрольных крыс -1,43%о. Эти величины находились в пределах колебаний спонтанного уровня у крыс и мышей по данным литературы [289, 223, 221].
Печень. Частота гепатоцитов с микроядрами изучена в девяти опытах на мышах (табл. 3.2.). В основном, опыты проведены на самцах гибридов (CBAxC57Bl/6)Fi 1-2 месячного возраста массой 18-25 г. Этот показатель у мышей разных линий варьировал от 3 до 7%о, что в целом значительно выше, чем для клеток костного мозга. Причем, если у самцов мышей СВА этот показатель был равен 3%о, а у С57В1/6 - 7%о, то у самцов и самок мышей-гибридов его величина, как это и должно быть, занимала промежуточное положение - 5,75%о и 4,33%о соответственно. Средняя частота гепатоцитов с микроядрами у всех исследованных мышей (56 животных) составила 5,02%о, что хорошо совпадает с данными литературы. В работе I.V. Uryvaeva, G. N. Delone [399] частота клеток с микроядрами в печени 2,5-месячных мышей составила 6,6%о (5 животных).
Частота гепатоцитов с микроядрами у животных контрольных групп после частичной гепатоэктомии Названиеэксперимента, вкотором изученачастота клеток смикроядрами Количество животных Вид животных Пол животных Частота клеток с микроядрами,Х±Ш, В %о Подострый, ДМГ 6 мыши-гибриды 8 8,50±2,40
На крысах проведен только один эксперимент. В контроле было 6 белых нелинейных крыс 2-х месячного возраста массой приблизительно 200 г. Анализ препаратов от каждого животного проведен дважды. Средняя частота гепатоцитов с микроядрами составила при первом анализе 1,17%о (колебания от 1 до 3) и при повторном анализе - 1,33%о (колебания от 1 до 4). В работе [391] этот показатель был немного выше - 2,5%о (данные по 13 животным, анализ 31000 клеток) и не зависел от времени между гепатоэктомией и забоем (24, 32, 48, 72 и 120 часов). В исследовании В.В. Юрченко [112], проведенном на более чем 50 самцах белых неинбредных крыс, уровень клеток с микроядрами у отдельных животных колебался от 0 до 10 и в среднем составил 3,33%о.
Легкие. Данные по частоте клеток легких с микроядрами контрольных крыс и мышей приведены в таблице 3.3. Низкий уровень этого показателя (0,5%о и 0,67%о) отмечен у мышей линий Balb/c и 101/Н. Частота клеток легкого с микроядрами у мышей-гибридов по результатам двух исследований (12 животных) составила 2,17%о. Приблизительно такая же частота отмечена у самцов крыс - 2,67%о.
Интересно отметить, что в первичной культуре спонтанный уровень клеток легких крыс с микроядрами был на порядок выше, чем in vivo. В двуядерных клетках он составил 21-28%о [411]. Возможно, высокая частота по микроядер обусловлена тем, что сама по себе система культивирования клеток является искусственной. Кроме того, для того, чтобы можно было отличить клетки, прошедшие митоз, в эту систему добавляют цитохалазин В. Это вещество ингибирует образование межклеточной перегородки и при делении образуются двуядерные клетки. Считается, что цитохалазин В не индуцирует микроядра, но, по-видимому, он все же может косвенно влиять на появление микроядер при культивировании клеток.
Преджелудок. Результаты исследования эпителиальных клеток с микроядрами в преджелудке мышей и крыс представлены в таблице 3.4. Частоты эпителиальных клеток с микроядрами у самцов и самок мышей-гибридов приблизительно одинаковы и составляют 0,53%о и 0,33%о. Приблизительно такая же частота клеток преджелудка (0,42%о) с микроядрами отмечена у интактных мышей СВА. Значительно более высокий уровень показателя выявлен у мышей Balb/c, он равен 3%о. У самок крыс частота клеток преджелудка с микроядрами была несколько выше, чем у самцов (1,34%о по сравнению с 0,78%о).
Желудок. Результаты исследования спонтанной частоты эпителиальных клеток желудка с микроядрами представлен в таблице 3.5. Этот показатель у самцов и самок мышей-гибридов был приблизительно одинаков (0,67 и 0,83%о), у мышей СВА немного ниже - 0,3%о, но у мышей Balb/c значительно выше -3,71%о, как и в преджелудке. У самцов крыс он составил 1,22%о, у самок -0,66%.
Мутагенный эффект химических соединений в клетках преджелудка и желудка
В наших экспериментах мутагенный эффект всех трех галопропанов был выявлен в опытах на мышах и крысах. Однако он не был выявлен в клетках костного мозга мышей и крыс в подострых экспериментах при оценке действия всех трех галопропанов ни микроядерным методом, ни с помощью метафазного анализа. Только в предварительном остром опыте на мышах SHK при увеличении дозы до 0,5 и 0,1 ЛД5о отмечено повышение частоты ПХЭ с микроядрами. Другие авторы также отмечали индукцию микроядер в костном мозге крыс при действии высоких доз ДБХП [114, 205]. Рассмотренные факты позволяют предположить, что ДБХП в дозах, близких к ЛД5о, обладает слабой цитогенетической активностью в клетках костного мозга. Отрицательные результаты в наших опытах с максимальными дозами ДБХП на крысах согласуются с наблюдением Е. George и соавторов [205] о снижении частоты клеток с микроядрами в костном мозге крыс до контрольного уровня при повторном введении вещества в дозе 75 мг/кг. Следует отметить, что данные, полученные на клетках костного мозга, указывают на отсутствие или очень слабую мутагенную активность галопропанов, поэтому их можно было бы отнести к соединениям, не проявляющим мутагенный эффект в опытах на млекопитающих. Однако исследование мутагенных свойств этих веществ с учетом органной специфичности показало хорошо выраженную мутагенную активность в разных отделах желудочно-кишечного тракта или печени мышей и крыс.
Специфика действия галопропанов особенно выражена у крыс. ДБХП и ДБП были эффективны в преджелудке обоих видов. У крыс увеличение эффекта на единицу дозы для ДБХП было в 3,7 раза выше, чем для ДБП. В толстой кишке крыс все галопропаны были эффективны, однако, ДБХП был активнее при сравнении минимально-действующих и удваивающих доз, а также коэффициентов регрессии. Его эффект был выявлен в толстой кишке мышей. ДБХП и ТБП индуцировали цитогенетический эффект в печени мышей.
В отчете НИР [72] приведены результаты анализа соотношения объёмов микроядра и ядра (Умя/Уяд), что позволило оценить качественные различия цитогенетического действия галопропанов. Увеличение этого показателя наблюдается при увеличении объема микроядра, т.е. количества входящего в него хромосомного материала. Самые мелкие микроядра образуются из фрагментов хромосом, т.е. являются результатом хромосомных аберраций. Крупные микроядра формируются отставшими хромосомами или группами хромосом в результате нарушений митоза. Полученные на клетках преджелудка и толстой кишке крыс и гепатоцитах мышей данные показывают, что ДБП индуцирует более крупные микроядра, чем два других галопропана. То же отмечено в преджелудке и толстой кишке мышей. Относительный размер микроядер, индуцируемых ДБХП и ТБП, был сходным. Вероятно, ДБП вызывает преимущественно нарушение митоза, тогда как ДБХП и ТБП -хромосомные аберрации.
Различия цитогенетического эффекта обусловлены, по-видимому, механизмом действия веществ, а также особенностями их токсикокинетики. По данным теста Эймса ДБХП был эффективен в вариантах с метаболической активацией и без нее, в то время как ТБП был активен только при метаболической активации, а ДБП вовсе не индуцировал мутации [139]. ТБП обладал слабым эффектом в тесте опосредования хозяином, что также указывает на необходимость метаболической активации вещества при индукции мутагенного эффекта. Эти факты объясняют эффект ДБХП в преджелудке (прямое действие) и отсутствие эффекта ТБП, а также индукцию микроядер обоими веществами в клетках печени. Можно предположить, что ДБП также обладает прямым эффектом, однако, он проявляется по другому механизму действия. На это указывает отсутствие мутагенности в тесте Эймса, а также индукция относительно крупных микроядер в клетках печени.
Индукция микроядер галопропанами в клетках толстой кишки, видимо, обусловлена тем, что активное вещество или активный метаболит в печени коньюгирует с глютатионом и выделяется с желчью. В толстой кишке происходит разрушение этого комплекса и активные радикалы вызывают появление хромосомных аберраций. Этот механизм показан для аналогичного соединения - трихлорпропана [403].
