Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Оценка мутагенного действия факторов окружающей среды на клетки органов дыхательной системы (овзор литературы) 13
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 28
2.1. Исследуемые факторы 28
2.2. Микроядерный тест на клетках костного мозга 36
2.3. Микроядерный тест на клетках легких экспериментальных животных 38
2.4. Дифференцировка различных типов клеток легкого на суспензионных препаратах экспериментальных животных и человека 41
2.5. Микроядерный тест на эпителиальных клетках слизистой оболочки носа человека 44
3.1. Микроядерный тест на клетках легких человека 47
2.1. Оценка результатов 50
ГЛАВА 3. Оценка цитогенетического эффекта малых доз гамма- излучения в клетках легких мышей 51
ГЛАВА 4. Оценка цитогенетического эффекта химических веществ в клетках легких экспериментальных животных 53
4.1. Оценка онтогенетического и цитотокенческого эффектов диоксидина в клетках легких и костного мозга мышей микроядерным методом 53
4.2. Оценка цитогенетического и цитотокенческого эффектов диоксазида в клетках легких крыс 58
4.3. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов симвастатина в клетках легких крыс 60
4.4. Оценка цитогенетического эффекта продуктов химической дезактивации промышленных отходов в клетках легких экспериментальных животных 63
4.5. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов диоксида азота в клетках легкого крыс 72
ГЛАВА 5. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов в клетках органов дыхательной системы человека 76
5.1. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов в эпителиальных клетках слизистой носа 76
5.2. Оценка цитогенстических и цитотоксических показателей в клетках легкого больных саркаидозом и другими заболеваниями легких 80
ГЛАВА 6. Обсуждение полученных результатов 84
6.1. Разработка и усовершенствование методов оценки цитогенетических эффектов факторов окружающей среды в клетках органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека 84
6.2. Спонтанные уровни цитогенетического эффекта в клетках легких экспериментальных животных 90
6.3. Значения цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках слизистой оболочки носа человека 92
6.4. Оценка цитогенетического эффекта химических соединений в клетках легких экспериментальных животных 94
6.5. Уровни цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках легких больных различными легочными заболеваниями 98
6.6. Оценка дополнительных кариологических показателей, характеризующих цитогенетическое и цитотоксическое действие факторов окружающей среды 100
6.7. Сравнение цитогенстических и цитотоксических показателей в клетках органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека 103
Выводы 106
Список источников литературы 108
Приложение 125
- Микроядерный тест на клетках легких экспериментальных животных
- Оценка онтогенетического и цитотокенческого эффектов диоксидина в клетках легких и костного мозга мышей микроядерным методом
- Оценка цитогенстических и цитотоксических показателей в клетках легкого больных саркаидозом и другими заболеваниями легких
- Оценка цитогенетического эффекта химических соединений в клетках легких экспериментальных животных
Введение к работе
В настоящее время возрастает техногенное загрязнение окружающей среды. В атмосферный воздух ежегодно выбрасываются миллионы тонн лыли, оксида углерода и диоксида серы, сотни тысяч тонн оксидов азота, десятки тысяч тонн других химических веществ. Поступление большого количества вредных веществ в организм человека через органы дыхания приводит к повышению распространенности легочной патологии, и особенно онкологической заболеваемости (Онищенко Г.Г., Новиков СМ., Рахманин Ю.А. с соавт., 2002; Пинигин М.А., 2004; Величковский Б.Т., 2003; Чу чал и н А.Г. 1998). Опухоли трахеи, бронхов, легкого в последние годы стабильно занимают первое место в общей структуре онкопатологии (41,3 на 100000 населения) (Социально значимые заболевания населения России в 2003 г., 2004; Государственный доклад, 2002). Возрастает необходимость оценки влияния канцерогенных факторов на систему органов дыхания. Проблема профилактики канцерогенного действия факторов окружающей среды является одной из важнейших в мировом сообществе. Первичная профилактика онкологической заболеваемости предусматривает выявление факторов, обладающим канцерогенным действием и их устранением или ограничением распространения в окружающей среде.
В настоящее время существует система исследования канцерогенной активности различных факторов окружающей среды, представляющая собой двухгодичные эксперименты на двух видах лабораторных животных. Однако эти исследования являются длительными, дорогостоящими и проводятся лишь для небольшой части веществ, По определению экспертов ВОЗ «канцерогеном (химическим, физическим или вирусным) называют агент, способный вызвать или ускорять развитие новообразования, независимо от механизма (или
механизмов) его действия или от специфичности эффекта. Канцероген - это агент, который в силу своих физических или химических свойств может вызывать необратимые изменения или повреждение в тех частях генетического аппарата, которые осуществляют гомеостатический контроль над соматическими клетками». Вне зависимости от того, на какие организмы действуют канцерогенные факторы, объединяющей их чертой является мутагенный эффект (индукция генных, хромосомных, геномных мутаций). Своевременное и корректное выявление мутагенов для запрета или ограничения их использования является важнейшей задачей гигиены окружающей среды. (Сычева Л.П, Журков B.C., Рахманин Ю.А., 2003).
Разработаны краткосрочные тесты, позволяющие прогнозировать канцерогенные свойства химических веществ на основе определения их мутагенных свойств (Руководство ВОЗ, 1989; Руководство, 2000). Однако эти тесты не позволяют определять мутагенное действие факторов на клетки органов дыхательной системы млекопитающих и человека. Этот аспект проблемы является особенно важным, поскольку доказана органная специфичность действия мутагенов, проявляющаяся в качественных и количественных различиях повреждения генетического аппарата клеток разных органов (Сычева, 2002).
В связи с этим актуальной проблемой является оценка цитогенетических и цитотоксических эффектов различных факторов (Журков B.C., 1986; Курило Л.Ф., Хилькевич Л.В., 1989; Беляева Н.Н., 1997), особенно в клетках органов дыхательной системы. В настоящее время распространен тест по оценке цитогенетической активности факторов на культуре фибробластов легких китайского хомяка. Разрабатываются системы in vitro на эпителиальных клетках легких для оценки мутагенных свойств. Однако, такие исследования не учитывают истинные взаимодействия структур целого организма на
молекулярном, клеточном, тканевом и органном уровнях, метаболические особенности целого организма. Среди методов оценки мутагенности в легких in vivo проводятся исследования с помощью метода Comet, позволяющего определять повреждения ДНК, однако при этом не рассматривается дальнейшая судьба таких повреждений. Проводятся единичные исследования по оценке цитогенетической активности факторов в бронхоальвеолярном лаваже экспериментальных животных, при этом не оцениваются мутагенные эффекты в эпителиоцитах - клетках-мишенях канцерогенеза.
Разработанная Л.П.Сычевой (2002) система оценки цитогенетического эффекта in vivo микроядерным методом в клетках различных органов экспериментальных животных на суспензионных препаратах, позволяет проводить оценку мутагенного действия факторов, в том числе и в легких. Этот методический подход может быть использован для разработки методов оценки мутагенного действия факторов окружающей среды на клетки органов дыхательной системы млекопитающих и человека: эпителиальные клетки бронхов, легких, слизистой носа. Для этого необходима дальнейшая разработка и усовершенствование соответствующих методик, в первую очередь неинвазивных (Рахманин Ю.А., Михайлова Р.И., Зайцева Н.В. с соавт., 2001), их апробация при исследовании различных клеточных популяций дыхательной системы при действии различных факторов, а также определение дозо-временных закономерностей возникновения цитогенетического эффекта.
Таким образом, нерешенные вопросы этой актуальной проблемы позволили сформулировать цель исследования: оценить цитогенетический эффект факторов окружающей среды в клетках органов дыхательной системы. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Разработать методики оценки цитогенетического действия факторов окружающей среды на клетки органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека.
Изучить цитогенетическое действие отдельных химических соединений, их смесей и у-излучения на клетки легкого млекопитающих при ингаляционном или пероралыюм воздействии.
Изучить дозовые и временные параметры изменения уровня цитогенетического эффекта в клетках легкого млекопитающих.
Сравнить уровни цитогенетических эффектов в разных клеточных популяциях органов дыхательной системы.
Оценить спектр и частоту цитотоксических кариологических показателей эпителиальных клеток в слизистой носа и легких человека.
Научная новизна. Впервые:
- разработан метод комплексной оценки цитогенетических и цитотоксических
показателей клеток органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека;
определены частоты клеток с микроядрами, ядерными протрузиями, с центральной ядерной перетяжкой, двуядерпых клеток в легких контрольных животных;
проведена количественная оценка и определены дозовые и временные параметры цитогенетического и цнтотоксического действия на клетки легких мышей и/или крыс диоксида азота, диоксидина, диоксазида, симвастатина, продуктов дезактивации химических отходов (совтола, люизита, иприта) при ингаляционном и пероралыюм воздействии;
проведена комплексная оценка и установлены фоновые уровни цитогенетических (клеток с микроядрами и протрузиями) и цитотоксических показателей (клеток с вакуолизацией ядра, кариорексисом, двуядерных и
клеток с перетяжкой ядра) в эпителии слизистой носа 224 жителей г. Москвы, а также частоты этих показателей в макрофагах бронхоальвеолярного лаважа и бронхиальном эпителии браш-биопсии больных бронхолегочпыми заболеваниями.
Практическая значимость. Материалы исследований использованы при разработке:
методических рекомендаций: «Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом», утвержденных Председателем Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ академиком РАМН Ю.А.Рахманиным (Москва, 200]);
методических рекомендаций «Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека», утвержденных Председателем Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ академиком РАМН Ю.А.Рахманиным (Москва, 2005);
изобретения «Способ дифференциальной диагностики туберкулеза и злокачественных поражений легких» (заявка №2004113078, приоритет от 28.04.2004);
изобретения «Способ неинвазивной диагностики цитогенетического и цитотоксического действия различных факторов на организм человека» (заявка №2005108225, приоритет от 24.03.2005);
Результаты экспериментальных исследований по изучению мутагенной активности использованы при обосновании гигиенических нормативов: - симвастатина - ПДК утверждена Минздравом РФ (Дополнение №1 к ГН 2.1.6.1338-03 г. -ГН.2.1.6.1765-03 г.);
диоксида азота - разовая ПДК рекомендована к утверждению Комиссией по санэпиднормированиго МЗиСР РФ (протокол от 28.12.04 г.) (Справка о внедрении №2 от|13.01.05 г,);
смеси триэтаиоламинных солей сульфированных полихлорировашшх. бифенилов и сульфированного трихлорбензола при нероралыюм поступлении в организм лабораторных животных. ОДУ в воде водных объектов утверждена Минздравом РФ (ПI 2.1.5.1316-03).
Результаты по оценке мутагенной активности смесей РМ1 (продуктов нейтрализации люизита) и РМ2 (продуктов нейтрализации иприта) использованы при комплексной оценке степени эффективности обезвреживания и утилизации этих отходов и при обосновании гигиенических рекомендаций по технологии их переработки (Справка о внедрении от 06.12.0.4 г.).
Индивидуальные выписки, отражающие цитогенетические и цитотоксические показатели эпителия слизистой носа 205 обследуемых, служащих офиса, переданы в медсанчасть для практического использования с целью улучшения состояния здоровья обследованных.
Работа выполнена в лаборатории генетического мониторинга в рамках двух плановых тем ГУ НИИЭЧиГОС им.А.Н.Сысина РАМН (№ госрегистрации 01200303902 2003-2005 гг.; «Гигиенические основы управления качеством внутренней среды современных общественных зданий» 2005-2007).
В работе использованы материалы совместных исследований по оценке цитогенетической активности различных факторов с , сотрудниками лабораторий: комплексного эколого-гигиенического нормирования, гигиены атмосферного воздуха, гигиены почвы, экологии и гигиены жилой среды, цитогистологии ГУ НИИЭЧиГОС им.А.Н.Сысина РАМН, Института общей генетики РАН, ВНИХФИ, ГУП МосНПО Радон.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на III международной научно-практической конференции «Проблемы онкогеиетики: научные и прикладные аспекты» (Киев, 2002); научной конференции «Теоретические основы и практические решения проблем санитарной охраны атмосферного воздуха» и конференции молодых ученых «Развитие научного творчества молодежи — объект постоянного внимания В.А.Рязанова», посвященных 100-летию со дня рождения академика В.А.Рязанова (Москва, 2003); 2-м съезде токсикологов России (Москва, 2003); 3-м съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 3 - в центральной печати.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Текст изложен на 124 страницах машинописи, иллюстрирован 29 таблицами и 10 таблицами (приложение) и 7 рисунками. Указатель литературы содержит 134 источника, из них 48 ' отечественных и 86. иностранных авторов.
Основные положения, выносимые на защиту
Методические основы оценки мутагенного действия факторов окружающей среды на клетки органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека.
Качественные и количественные параметры цитогенетического и цитотоксического действия химических веществ (диоксида азота, диоксидина, диоксазида, симвастатина), продуктов дезактивации химических отходов (совтола, люизита, иприта) при ингаляционном и пероральном воздействии, низких доз у-излучения.
Дозовые и временные закономерности изменения уровня цито генетического
и цитотоксического эффекта в клетках легкого экспериментальных
животных.
Сравнение уровней цито генетических эффектов в разных клеточных
популяциях органов дыхательной системы.
Микроядерный тест на клетках легких экспериментальных животных
Методика приготовления препаратов осуществлялась в соответствии с нашими методическими рекомендациями "Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом" (2001). Кроме того, для ускоренного анализа препаратов клеток легких нами разработана методика приготовления суспензионных препаратов клеток ex tempore. Обе методики приведены ниже. Фиксация материала
Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации, вскрывали, легкие выделяли, вырезали кусочек для фиксации. У крыс брали материал в одном и том же месте от определенной доли легкого (средней доли правого легкого), ближе к корню, пластом толщиной 0,5-0,8 см. У мышей фиксировали правое или оба легких полностью. Выделенный кусочек помещали в 10% раствор формалина с рН 7,0. Длительность фиксации не менее 1 месяца. 10% раствор формалина (4% по формальдегиду) готовили из нейтрального формалина, используя 0,1М фосфатный буфер с рН 7,0. Для приготовления фосфатного буфера использовали следующие растворы: А: 1/10 М КН2РО4, Б: 1/10 М Na2HP04X 12Н20, Фосфатный буфер готовили перед употреблением, смешивая 390 мл раствора А и 610 мл раствора Б.
Фиксированные кусочки легкого промывали в проточной водопроводной воде в течение 8 часов. Затем кусочки помещали в центрифужные пробирки, заливали 1,5 мл 50% раствора КОН из холодильника. Выдерживали 12-14 часов при 20С. Щелочь сливали и добавляли в пробирку 3 мл дистиллированной воды. Выдерживали 1-1,5 часа. Осторожно пипетировали, используя пипетку с пластиковым наконечником, до образования суспензии. Центрифугировали 6 мин. при 1500 об/мин. Сливали падосадочную жидкость, к осадку добавляли дистиллированную воду, слегка пипетировали для лучшего промывания клеток в суспензии. Центрифугирование повторяли в том же режиме. Пипеткой убирали надосадочную жидкость, оставив 1-2 капли. Осторожно пипетировали. Каплю густой суспензии с помощью пипетки наносили на край сухого, тщательно обезжиренного стекла. Мазок делали шлифованым стеклом под углом 45. Густоту расположения клеток контролировали на пробном препарате под микроскопом.
Наряду с методикой фиксации клеток легких в формалине нами разработана методика приготовления суспензионных препаратов клеток легких ex tempore. После окончания эксперимента легкие мышей выделяли и измельчали ножницами на часовом стекле. Полученную кашицу помещали в эмбриональную телячью сыворотку и пипетировали. Суспензию фильтровали через капроновую сеточку и центрифугировали при 1500 об/мин. в течение б минут, надосадочную жидкость удаляли, из осадка делали мазки. Этот способ приготовления суспензионных препаратов позволяет ускорить анализ материала, но при этом затруднена дифференцировка различных типов клеток легкого. Окрашивание препаратов
Хорошо просушенный препарат помещали на 10 минут в свежеприготовленный фиксатор: смесь этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1). Высушивали на воздухе. Окрашивали свежеотфнльтрованным 2,5% ацетоорсеином в термостате при 37С в течение 1 часа. Промывали в двух сменах дистиллированной воды. Высушивали на воздухе. Цитоплазму клеток докрашивали 1% спиртовым раствором светлого зеленого в течение 3-10 мин. Промывали в двух сменах дистиллированной воды. Высушивали на воздухе. Окраску цитоплазмы контролировали под микроскопом.
Препараты анализировали под микроскопом в проходящем свете с помощью объектива с масляной иммерсией при увеличении 10x90. Анализ проводили на зашифрованных препаратах. Подсчитывали не менее 1000 клеток легких на каждое животное, определяли количество клеток с микроядрами. Показателем качества препаратов является небольшое количество разрушенных клеток. Большинство клеток лежит отдельно, хорошо расправлены. .Ядра бордового цвета, цитоплазма прозрачная зеленовато-голубая.
Микроядра - небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии ана-тслофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественные микроядра в цитоплазме клетки. Микроядро в клетках с ядром представляет собой хроматиновое тельце, соответствующее следующим критериям: 1) четко отделено от ядра, расположено в цитоплазме клетки; 2) форма - округлая или овальная с ровными краями; 3) окраска соответствует окраске основного ядра клетки; 4) структура - гомогенная, оптически плотная, или, подобно основному ядру клетки, хроматин может иметь диффузный сетчатый рисунок; 5) размер не превышает 1/3 диаметра ядра анализируемой клетки; 6) плоскость расположения микроядра соответствует плоскости основного ядра (определяется при вращении микровинта микроскопа); 7) не преломляет свет при вращении микровинта. Кроме микроядер учитывали дополнительные кариологические показатели (рис. 2.3.1): Протрузии - шаровидные (возможна более сложная форма) ядерные структуры за пределами основного ядра в цитоплазме, четко ограниченные от ядра и соединяющиеся с ним перемычкой. Двуядерные клетки - клетка с двумя отдельно лежащими ядрами. Учитывали только отдельно лежащие клетки без наложения друг на друга. Клетки с перетяжкой ядра - клетки с центрально расположенной бороздой, как бы перетягивающей ядра. Иногда такая борозда может быть смещена к одному из полюсов ядра. Все показатели учитывали в отдельно лежащих клетках, имеющих четкую контрастную окраску, с неповрежденными ядром, цитоплазмой и плазмалеммой. Для определения соотношения клеток различных типов на суспензионных препаратах легкого (иневмоциты II типа, пневмоциты I типа, макрофаги) подсчитывали по 100 клеток от каждого животного. Нами разработаны морфологические критерии дифференцировки этих типов клеток легкого экспериментальных животных на суспензионных препаратах при окраске ацетоорсеином и светлым зеленым.
Оценка онтогенетического и цитотокенческого эффектов диоксидина в клетках легких и костного мозга мышей микроядерным методом
Эксперимент проведен на самцах мышей С57В1/6, масса которых в конце эксперимента составила 20-25 г. Животным ежедневно внутрибргошинно вводили раствор диоксидина (ex tempore). Животных забивали на 5 и 16 день эксперимента. Исследуемые дозы составили 10, 100 и 300 мг/кг. Контрольным животным вводили дистилирован ну ю воду. Приготовление препаратов и оценку мутагенного действия диоксидина в клетках легкого и костного мозга осуществляли в соответствии с разделами 2.3 и 2.2, соответственно. На препаратах клеток легкого анализировали по 1000 клеток трех типов (пневмоциты I типа, пнвмоциты II типа и альвеолярные макрофаги) суммарно.
Полученные результаты по частоте полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) с микроядрами в костном мозге мышей С57В1/6 у отдельных животных и в среднем по группам представлены в таблицах 2 (приложение) и 4.1.1.
Частота ПХЭ с микроядрами в контрольной группе составила 3,13%о. Частота ПХЭ с микроядрами в опытных группах животных после 4 кратного введения диоксидина в дозах 10, 100 и 300 мг/кг была 3,83; 33,0 и 47,4%о, соответственно. Частота ПХЭ с 2 и более микроядрами на 5 день эксперимента после введения диоксидина в дозах 100 и 300 мг/кг была 1,0 и 6,4%о. Отмечается достоверное возрастание частоты ПХЭ с одним микроядром (рис. 4.1.1), а также частоты ПХЭ с 2 и более микроядрами в зависимости от дозы вещества (R=0,80; df-22; Р 0,001) на 5 день эксперимента. Полученные данные хорошо согласуются с результатами учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей С57В1/6. После пятикратного введения диоксидина в дозе 300 мг/кг отмечалось возрастание цитогенетического эффекта приблизительно в 20 раз (Гусева Н.В. с соавт., 1995).
Полученные результаты по частоте микроядер в клетках легких мышей по отдельным животным и в среднем по группам C57BI/6 представлены в таблицах 3 (приложение) и 4.1.1.
Средняя частота клеток легкого с микроядрами в контрольной группе (объединенная группа животных по 2 срокам воздействия) составила 0,25%о (табл. 4.1.1). Средняя частота клеток легкого с микроядрами в опытных группах животных после введения диоксидина в дозах 10, 100 и 300 мг/кг на 5 день эксперимента была 0,0; 0,4 и 1,6%о,соответственно (табл. 4.1.1). Средняя частота клеток легкого с микроядрами у мышей С57В1/6 на 16 день эксперимента после введения диоксидина в дозах 10, 100 и 300 мг/кг была 0,5; 0,5 и 1,4%о.
Отмечается достоверное возрастание частоты клеток легкого с микроядрами над контрольным уровнем после введения диоксидина в дозе 300 мг/кг при обоих сроках воздействия (рис. 4.1.1). Уровень показателя значимо возрастал с увеличением дозы диоксидина (r=0,51; df=22; Р 0,05).
Доля двуядерных клеток на 5 день воздействия диоксидина в дозах 10, 100 и 300 мг/кг составила 12,67; 8,6 и 11,8%о соответственно и не отличалась от контрольного уровня (9,33 %о). На 16е сутки при действии таких же дозовых уровней доля двуядерных клеток составила 17,0; 19,33 и 25,5%о (табл. 4.1.1). Отмечено зависимое от дозы возрастание доли двуядерных клеток, которое удовлетворительно описывалось линейным уравнением у =13,19 + 0,44х (Fperp = 8,35; уі = 1; Y2 = 19; Р — 0,009) где х - дозы диоксидина (мг/кг), а у - доля двуядерных клеток В %о.
По данным литературы увеличение числа двуядерных клеток легких показано также при действии асбестовых волокон (Lemaire I., 1985), для которых известен свободно-радикальный механизм мутагенного действия, характерный также и для диоксидина (Серединин СБ., Дурнев А.Д., 1992). Минимально действующие дозы (МДЦ), удваивающая доза (УД) и кратность повышения эффекта над контролем при исследуемых дозах диоксидина были различны в клетках легких и костного мозга (табл. 4.1.2). УД диоксидина по показателю частоты клеток с микроядрами для костного мозга в 5 раз выше, чем для легкого. Возможно, более высокий уровень эффекта диоксидина в костном мозге обусловлен присутствием большого количества макрофагов и нейтрофилов, которые являются основными клетками-индукторами свободных радикалов. Мутагенное действие диоксидина в клетках легких подтверждается выявленным ранее методом щелочной элюции ДНК-повреждающим действием препарата при внутрибрюшинном введении мышам (Абилев С.К., Абдразаков М.М., 1991). В этой работе также показано, что диоксидин индуцирует меньше ДНК-повреждений в клетках печени и почек (МДД -200 мг/кг), чем в легких (МДД - 100 мг/кг). В клетках толстой кишки также показан меньший, по сравнению с легкими, уровень ци тоге нети чес ко го эффекта (Сычева Л.П. с соавт., 2004). С.К.Абилев и М.М. Абдразаков (1991) связывают мутагенный эффект диоксидина в клетках легких с насыщенностью этой ткани кислородом, что способствует генерации свободных радикалов. Более низкая мутагенная активность при действии высоких доз диоксидина в клетках печени, почек и толстого кишечника, вероятно, связана с меньшей интенсивностью свободно-радикальных реакций в этих органах.
Оценка цитогенстических и цитотоксических показателей в клетках легкого больных саркаидозом и другими заболеваниями легких
Оценка мутагенных эффектов экзогенных и эндогенных факторов на клетки органов дыхательной системы является важной проблемой как в теоретическом, так и в практическом плане. Однако почти полное отсутствие соответствующих методических подходов не позволяет решить эту проблему. В связи с этим основной задачей нашего исследования была разработка методических основ оценки мутагенного действия различных факторов на клетки органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека.
Поскольку цитогснетический эффект (микроядра или хромосомные аберрации) нельзя оценивать на гистологических препаратах (срезах), важно было получить суспензионные препараты клеток, т.е. отработать методы диссоциации клеток легкого. Для цитогенетического анализа клеток легкого Л.П.Сычевой (2001) разработан метод приготовления препаратов путем фиксации органов в формалине с последующей диссоциацией в КОН. Однако фиксация должна осуществляться в течение 2 — 4 недель. Мы, в основном, использовали эту методику приготовления препаратов, но для получения более быстрого ответа о наличии цитогенетического эффекта исследуемого фактора разработали методику приготовления препаратов ex tempore, путем механического измельчения легких, с применением пипетирования в эмбриональной телячьей сыворотке, что позволяет ускорить скрининговые исследования. В исследованиях цитогенетического статуса клеток человека мы оценивали уровень цитогенетических повреждений в разных органах дыхательной системы: в назальном эпителии волонтеров; в бронхиальном эпителии при браш-биопсии и в макрофагах легких при бронхоальвеолярном лаваже у пациентов с бронхолегочпой патологией. Для этого разработана неинвазивная методика приготовления, окраски и анализа препаратов назального эпителия при обследовании волонтеров; усовершенствованы методики окраски и анализа клеток бронхоальвеолярного лаважа и бронхиальных эпителиоцитов, полученных после браш-биопсии у пациентов в клинике.
Для оценки цитогенетического эффекта в клетках слизистой носа разработана методика приготовления препаратов эпителиальных клеток с помощью ватной палочки (что менее болезненно, чем нейлоновой щеточкой), с применением способа отпечатков и последующей фиксацией в смеси этанола и уксусной кислоты. Такой несложный и дешевый способ нанесения материала на стекло позволяет набирать необходимое для цитогенетического анализа количество клеток. Для окраски препаратов назального эпителия отработан способ с применением ацетоорсеина и светлого зеленого. Содержащаяся на препаратах слизь, инородные частицы и разрушенные клетки при окраске по методу Романовского-Гимзы, который чаще всего применяют при анализе эксфолиативных клеток, могут затруднять анализ цитогенетических и цитотоксических показателей, в то время как контрастная окраска ядерного материала ацетоорсеином и цитоплазмы светлым зеленым облегчает анализ препаратов эпителиоцитов слизистой оболочки носа.
Клетки бронхоальвеолярного лаважа и браш-биопсии также предложено окрашивать ацетоорсеином и светлым зеленым. При окраске по Романовскому-Гимзе, которая обычно используется для анализа таких препаратов, трудно отличить цитогенетические повреждения от инородных включений в клетках, особенно в активно фагоцитирующих макрофагах. Предложенный нами способ окраски значительно облегчает распознавание микроядер и оценку других кариологических показателей.
В работе применен новый значительно более информативный анализ препаратов, К настоящему времени выполнено небольшое число работ (около 10) по оценке цитогенетического эффекта в назальном эпителии человека и, по-видимому, только одно исследование бронхоальвеолярного лаважа микроядерным методом у человека. В этих исследованиях цитогенетический эффект определяли по частоте клеток с микроядрами и почти не учитывали другие кариологические показатели. Для комплексной оценки цитогенетического и кариологического статуса клеток органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека мы предложили анализировать дополнительно клетки с ядерными протрузиями, двуядерные клетки с межъядерными мостами (показатели цитогенетического действия), вакуолизацией ядра, кариорексисом (показатели дегенерации ядра), двуядерные клетки, клетки с центральной перетяжкой ядра (показатели пролиферации клеток) и трехъядерные клетки (показатель аномальных митозов) в разном сочетании в зависимости от типа исследуемых клеток.
Для учета указанных показателей разработаны расширенные протоколы анализа клеток дыхательной системы экспериментальных животных и человека (табл. 6.1.1; 6.1.2; 6.1.3).
Оценка цитогенетического эффекта химических соединений в клетках легких экспериментальных животных
Дозовые уровни исследуемых веществ. В работе исследованы вещества различной химической структуры, характеризующиеся разной степенью токсичности. Исследуемые дозы, нредстакленные в таблице 6.4.І., варьировали от 1/1250 ЛД50 до 1/2 ЛД50.
Цитогенетический эффект в клетках легкого выявлен при действии диоксидина в дозе 1/2 ЛД5о; при действии смеси продуктов дезактивации люизита (РМ1) в дозе 1/250 ЛД50 и при действии продуктов дезактивации иприта (РМ2) в дозах 1/1250 и 1/250 ЛД50. Цитогенетический эффект отсутствовал при действии диоксида азота в дозах на уровне 1/16 - 1/4 ЛД п, при действии диоксазида в дозе 1/20 ЛД50 и при действии продуктов Диоксидин является относительно слабым мутагеном. Относительно невысокая токсичность препарата обусловила линейный характер кривой зависимости эффекта от дозы, как в легких, так и в костном мозге.
В случае действия смесей РМ1 и РМ2, в состав которых входят продукты трансформации люизита и иприта, мутагенный эффект выявлен при действии очень низких дозовых уровней и отсутствует на высоких, а кривая зависимости эффекта от дозы характеризуется как «подъем спад». Такой же характер дозовой кривой для легких описывается при действии циклофосфамида, который является аналогом иприта (Сычева Л.П., 2001). Такое проявление эффекта связано с высокой токсичностью действующих факторов на высоких дозах, которая приводит к гибели генетически поврежденных клеток.
Временные параметры изменения цитогенетического и цитотоксического эффекта в клетках легких экспериментальных животных. В наших исследованиях мутагенного действия диоксидина, продуктов трансформации люизита и иприта установлено, что цмтогенстический эффект в легких (по доле клеток с микроядрами) .можно наблюдать уже на 5 сутки ежедневного воздействия. Данные литературы подтверждают наши результаты. Увеличение доли альвеолярных макрофагов с микроядрами в бронхоальвеолярном лаваже крыс наблюдали к 3 - 7 дню при ежедневном ингаляционном воздействии радона и однократно поглощенных в виде аэрозолей а-частиц ("Гауа A. et all., 1994; Talbot R.J. ct all., 1989).
На примере исследования диоксидина нами показано, что уровень клеток с микроядрами, определенный на 5 день воздействия препарата, остался таковым и на 16-й день эксперимента. Другие исследователи отмечали максимальные уровни цитогенетического эффекта в альвеолярных макрофагах на 14-21 день при ингаляционном воздействии радона и а-облучения (Taya А, et all., 1994; Talbot R.J. et all., 1989) и медленное снижение уровня эффекта к 98 дню воздействия (Talbot R.J. et all., 1989).
В совместных исследованиях с Сычевой Л.П. (2002) цитогенетический эффект высоких доз у-облучения (6-7 Грей) в легких выявлен через 22 дня после окончания воздействия, причем, в толстой кишке к этому сроку эффект отсутствовал. Выявление цитогенетических повреждений в клетках легкого на отдаленном сроке даже после однократного воздействия указывает на возможность увеличения риска возникновения канцерогенных эффектов в легких. Мы исследовали некоторые временные параметры изменения других показателей в легких. Изменение доли двуядерных клеток при действии диоксидина по сравнению с контролем не отмечено на 5 день, однако увеличено на 16-й день воздействия, что может указывать на цитотоксический эффект препарата. На примере исследования мутагенности продуктов трансформации люизита и иприта у мышей и диоксида азота у крыс показано, что увеличение двуядерных клеток и, по-видимому, цитотоксическое действие проявляется уже к 5 — 7 дню непрерывного воздействия. В работе Talbot R.J. с соавторами (1989) показано, что при действии разных изотопов, излучающих а-частицы, увеличение доли многоядерных макрофагов отмечается на различных сроках воздействия с 7 по 21 день. Следовательно, увеличение доли двуядерных клеток отмечается, начиная с 5-го дня непрерывного воздействия, и, по-видимому, зависит от особенностей действующего фактора и исследуемых доз.
Таким образом, индукцию микроядер в клетках легких при действии различных факторов можно наблюдать, начиная с 5 дня ежедневного воздействия. На примере исследования диоксидина показано, что уровень цитогенетического эффекта сохраняется к 16 дню.
Анализ уровня микроядер в разных типах клеток легкого экспериментальных животных клеток. Па примере исследования цитогенетического действия диоксидина определено распределение клеток по типам (пневмоциты I типа, пневмоциты II типа и альвеолярные макрофаги) и количество микроядер в этих типах (табл. 6.4.2.).
В этом эксперименте при микроскопическом анализе 100 клеток определили соотношение клеток легкого разного типа. При дальнейшем анализе 1000 клеток отмечали тип клеток, в которых обнаруживали микроядра. Эти данные были положены в основу расчета и сопоставления ожидаемого и наблюдаемого числа клеток разного типа с микроядрами.
