Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Предпосылки изучения индивидуальной чувствительности человека 10
1.2. Мультифакториальная патология и генетический полиморфизм 13
1.3.Биомаркеры экспозиции, эффекта и восприимчивости 22
1.4. Основные механизмы биотрансформации 26
1.5. Генотоксические эффекты химических токсикантов 34
1.6. Диоксины и медико-генетические показатели 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Характеристика обследованных групп лиц и объем экспериментальных исследований 41
2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК (ПЦР) 41
2.3. Оценка уровня хромосомных аберраций в клетках периферической крови человека 52
2.4. Учет микроядер и клеточных аномалий в эпителиоцитах слизистой оболочки ротовой полости 54
2.5. Методы статистической обработки материала 56
ГЛАВА 3. Молекулярно-генетический анализ генов системы биотрансформации у обследованных лиц 57
3.1. Определение частот полиморфных аллелей генов 1 фазы биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP2E1, PON54) 57
3.2. Определение частот полиморфных аллелей генов 2 фазы биотрансформации ксенобиотиков (GSTT1, GSTM1) 61
ГЛАВА 4. Анализ взаимосвязей полиморфизмов генов 1-й (CYP1A1, CYP2E1, PON54) и 2-й (GSTT1, GSTM1) фазы системы биотрансформации ксенобиотиков с цито генетическим и нарушениями (хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови и микроядра в буккальном эпителии ротовой полости человека) у обследованных лиц 65
ГЛАВА 5. Определение частот полиморфных аллелей генов 1 (CYP1A1) и 1 (GSTT1 и GSTM1) фазы биотрансформации ксенобиотиков у детей национальности кинь, Вьетнам 82
ГЛАВА 5. Обсуждение 88
Выводы 96
Список литературы 98
- Мультифакториальная патология и генетический полиморфизм
- Учет микроядер и клеточных аномалий в эпителиоцитах слизистой оболочки ротовой полости
- Определение частот полиморфных аллелей генов 2 фазы биотрансформации ксенобиотиков (GSTT1, GSTM1)
- Определение частот полиморфных аллелей генов 1 (CYP1A1) и 1 (GSTT1 и GSTM1) фазы биотрансформации ксенобиотиков у детей национальности кинь, Вьетнам
Введение к работе
Актуальность проблемы
Изучение роли индивидуальной чувствительности человека к действию неблагоприятных факторов окружающей среды в донозологической диагностике представляется весьма актуальным (Рахманин Ю.А., Ревазова Ю.А., 2004).
Многочисленные эпидемиологические исследования указывают на то, что практически все широко распространенные заболевания в той или иной мере связаны с неблагоприятными внешними факторами, среди которых значительное место принадлежит химическим соединениям и, так называемым сопутствующим факторам (Рахманин Ю.А. 2001; Their R et al., 1998; Кузьмина Л.П. 2001; Nebert D.W., 2000).
Полиморфизм ферментов, ответственных за биотрансформацию химических веществ, в том числе, мутагенов и канцерогенов, определяет способность организма активировать или детоксицировать их, влияет на внутреннюю (поглощенную) и биологически эффективную дозы агентов. В зависимости от особенностей генома различные индивидуумы могут сохранять устойчивость или, наоборот, обнаруживать повышенную чувствительность к повреждающим агентам (Nebert D.W., Carvan M.J. 1997). Биотрансформация ксенобиотиков, является многоступенчатым процессом, в котором одновременно или поочередно участвуют многие ферменты различных этапов детоксикации, что важно учитывать в исследовании мутагенных эффектов у лиц, контактирующих с известными или предполагаемыми мутагенами (Баранов B.C. с соавт. 2000; Бочков Н.П., 2003).
Среди ферментов первой фазы метаболизма особое внимание исследователей привлекает семейство цитохромов Р450 (изоформы CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2E1, CYP2D6 и CYP3A4). Они принимают участие в метаболизме полициклических ароматических
углеводородов, гетероциклических аминов, афлатоксинов, нитрозоаминов и др.
Среди ферментов второй фазы (конъюгации) велика роль глютатион-S-трансфераз (GST), катализирующих реакцию глютатиона с различными алифатическими, ароматическими и гетероциклическими радикалами веществ, загрязняющих атмосферу в городах и играющих значительную роль в резистентности клеток к перекисному окислению липидов, алкилированию белков и повреждениям ДНК.
Связь генетического полиморфизма с ответом человека на мутагенные воздействия факторов среды является новой и крайне важной областью исследований в экологии человека и медицине окружающей среды, поскольку изучается проблема реализации генотипа в определенных условиях окружающей среды и в выявлении комплекса генов, отвечающих за возникновения патологических состояний при контакте с повреждающими факторами. Развитие этого направления позволяет исследовать механизмы возникновения экологически обусловленной патологии на основе изучения генетически контролируемых механизмов биотрансформации ксенобиотиков, корректно формировать группы риска мультифакториальной патологии и повышенного генетического риска.
В соответствии с этим целью работы являлось изучение генетического полиморфизма систем биотрансформации ксенобиотиков у лиц, контактирующих с высокотоксичными химическими веществами. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов генов 1-й и 2-й фаз биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP2E1, PON54, GSTT1, GSTM1) у лиц, имевших/имеющих контакт с химическими веществами.
Провести поиск ассоциаций полиморфных маркеров генов 1-й и 2-й фаз биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP2E1, PON54, GSTT1, GSTM1) с уровнями цитогенетических нарушений (хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови, клетки с микроядрами в буккальных эпителиоцитах) в обследуемых группах лиц.
Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов генов 1-й и 2-й фазы биотрансформации ксенобиотиков (CYP1AI, GSTT1, GSTM1) у лиц азиатской популяции, проживающих на территории Вьетнама.
Показать гигиеническую значимость исследования индивидуальной чувствительности человека по генам, участвующим в биотрансформации ксенобиотиков.
Научная новизна работы
В данной работе впервые проведено определение генетического полиморфизма ферментов биотрансформации ксенобиотиков наряду с цитогенетическими исследованиями у лиц, имеющих (имевших) контакт с высокотоксичными химическими веществами.
Впервые определены частоты генов CYP1A1, GSTT1 и GSTM1 во вьетнамской популяции.
Выявлена связь генетического полиморфизма по системам биотрансформации высокотоксичных химических веществ (PON 54 и GSTM1) с уровнями цитогенетических нарушений в соматических клетках обследованных людей.
Практическая значимость работы.
Показана важность и необходимость включения молекулярно-генетических методов в оценку здоровья населения на донозологическом уровне. Связь генетического полиморфизма с ответом на действие
8 химических факторов среды позволит корректно формировать группы повышенного генетического риска, риска возникновения мультифакториальной патологии и экологозависимых заболеваний. Подобные исследования могут быть включены в программу проведения предварительных медицинских осмотров для формирования групп повышенного риска профессиональной или иной патологии. Результаты работы легли в основу одного из разделов Методических рекомендаций «Система оценки нестабильности генома человека в генетико-гигиенических исследованиях», утвержденных 10,11. 2004 Председателем Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды академиком РАМН Рахманиньш Ю.А.
Положения, выносимые на защиту.
Определение генетического полиморфизма ферментов
биотрансформации ксенобиотиков молекулярно-генетическими методами наряду с цитогенетическими исследованиями необходимо включать в оценку здоровья населения на донозологическом уровне.
Выявлена связь генетического полиморфизма по системам биотрансформации высокотоксичных химических веществ (PON 54 и GSTM1) с уровнями цитогенетических нарушений в соматических клетках обследованных людей европейской популяции.
Частота вариантов гена CYP1A1, определяющих высокую вероятность накопления токсичных метаболитов диоксина в биосубстратах жителей загрязненных территорий Вьетнама, более чем в 6 раз превышает популяционные частоты генетических полиморфизмов у европейцев.
Апробация работы.
Результаты диссертационной работы были представлены на 1-й Всероссийской научной конференции с международным участием (г. Новосибирск, 9-11 декабря 2002 г.), на конференции, посвященной 100-
9 летиіо со дня рождения В.А.Рязанова (г. Москва, 25-26 сентября ГУ НИИ ЭЧиГОС, 2003 г.), на съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова (г. Москва, 6-12 июня 2004 г.).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 - в центральных российских журналах, 1 тезисы за рубежом.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, 5 глав, обсуждения и выводов. Список литературы содержит 209 источников, из них 80 отечественных и 129 зарубежных авторов. Работа изложена на 118 листах машинописи. Текст иллюстрирован 22 таблицами, и 7 рисунками.
Мультифакториальная патология и генетический полиморфизм
В различных странах проводились многочисленные исследования, которые выявили достоверную связь между показателями загрязнения окружающей среды и увеличением частоты заболеваний органов пищеварения, дыхания, кожи, эндокринных и онкологических заболеваний, иммунодефицитных состояний.
В силу того, что легкие и другие органы дыхания находятся на границе раздела двух сред - внутренней среды организма и внешней, - они постоянно оказываются подверженными неблагоприятному влиянию вредных веществ, загрязняющих атмосферный воздух. Вследствие этого широкая распространенность болезней системы органов дыхания среди населения городов и территорий с неблагоприятной экологической обстановкой в большой мере связана с загрязнением окружающей среды. В целом, долевой вклад экологического неблагополучия в развитие патологии органов дыхательной системы составляет примерно от 40 до 60% (Величковский Б.Т., 2001; Суржиков В.Д. 1998; Гичев Ю.П. 1999).
Данные эпидемиологических исследований делают очевидной необходимость изучения биохимических основ этих заболеваний в той их части, которая относится к воздействию окружающей среды на организм. Знания, полученные в исследованиях ферментативной системы биотрансформации чужеродных соединений (ксенобиотиков), позволяют рассматривать ее как важное звено в этиологии и патогенезе мультифакториальных (полифакторных) заболеваний. Прежде всего, это относится к тому факту, что результатом метаболизма может быть образование более высокореакционноспособных метаболитов, чем исходные ксенобиотики (Watkins Р.В.,1990). Биологические следствия этого события включают образование аддуктов с ДНК, приводящее к мутациям (Shelby M.D., Zeiger Е., 1990), с белками, приводящее к образованию конъюгированных антигенов (van Bladeren P.J., van Ommen В., 1991), стимуляцию процессов образования активных кислородных метаболитов, приводящих к развитию окислительного стресса (Величковский Б.Т., 2000; Хрипач Л.В. с соавт., 2004; Nebert D., 1990). Данные об индуцибельности и генетическом полиморфизме ферментов биотрансформации ксенобиотиков (Gross A.S. et al., 1990, Kalow W. 1997) легли в основу представлений о высокой межиндивидуальной вариабельности чувствительности к воздействию ксенобиотиков. Открытие множественности форм ферментов биотрансформации ксенобиотиков и присущей им субстратной специфичности обеспечили возможность таких исследований с использованием методологии кандидатных генов и подходов молекулярной и клинической эпидемиологии (Perera F. Р. 1997). Наряду с чужеродными соединениями, ферменты биотрансформации ксенобиотиков осуществляют также метаболизм многих эндогенных субстратов - стероидных гормонов, нейромедиаторов, медиаторов воспаления (Endo Y., 1979, Heim M.N. et al., 1991, Jouve J. et al., 1992, Wang W., Ballatori N., 1998), поэтому их участие в этиологии и патогенезе полифакторных заболеваний может не ограничиваться механизмами, которые указаны выше.
Клинико-эпидемиологические наблюдения показывают, что пассивное курение является фактором риска бронхиальной астмы у детей (Infante-Rivard С. et al., 1999). Бронхиальная астма по своей природе является мультифакториальными заболеванием, то есть таким, в этиологии и патогенезе которого имеют значение многие гены и многие факторы окружающей среды (Sandford A. et al., 1995). Табачный дым содержит около 4000 соединений (Wang S.S., Samet J.S. 1997) и является модельной средой, воздействие которой позволяет идентифицировать многие гены, участвующие во взаимодействии организма с глобальной окружающей средой. Был проанализирован риск развития заболевания, ассоциированный с генотипами, раздельно для некурящих и пассивно курящих людей.
Были выявлены особенности индивидуальных генотипов в ассоциации с предрасположенностью к астме, большой интерес представляет оценка их взаимодействия. Анализ комбинаций подтвердил рисковую значимость нуль-генотипов GSTM1 и GSTT1 и выявил доминирующую роль GSTT1"-" в формировании предрасположенности к астме. Он показал, что максимальный риск заболевания ассоциирован с делецией в генах GSTM1 и GSTT1 в условиях без воздействия табачного дыма. Напротив, сочетание функциональных генов обеспечивает устойчивость к развитию заболевания (Вавилин В.А. 2001).
Викторовой Т.В. и сотрудниками проведено изучение взаимосвязи полиморфизма генов CYP1A1 и CYP2E1 и бронхолегочных заболеваний и было показано, что у здоровых индивидов (164 чел.) на долю полиморфных генотипов приходилось 6,2% и 5,5%, соответственно. У больных хроническими бронхолегочными заболеваниями легких (96 чел.) полиморфные генотипы встречались с более высокой частотой, в частности, 8,3% для гена CYP1A1 и 7,8% для гена CYP2E1. Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфизма гена GSTM1 свидетельствуют о повышении частоты делеции у больных хроническими бронхолегочными заболеваниями до 50,5% против 42,7% у здоровых индивидов (Викторова Т.В. с соавт., 2003).
Резкий рост загрязнения окружающей среды вредными химическими веществами, наблюдавшийся с середины XX века, привел к увеличению числа случаев заболевания раком во всем мире. Было сформулировано представление, достаточно широко признаваемое сегодня, о том, что канцерогенез в большой мере связан с воздействием на организм различных химических загрязнителей атмосферного воздуха, воды, почвы и пищевых цепей. Среди более 7000 химических веществ, исследованных на канцерогенность, около 1500 оказались канцерогенно опасными.
Учет микроядер и клеточных аномалий в эпителиоцитах слизистой оболочки ротовой полости
Исследуемым материалом для ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка, и другие биологические выделения.
В качестве материала для генотипирования (на первом этапе работы, 2001-2002 год) использовали ДНК, извлеченную из лимфоцитов. С этой целью 5мл венозной крови отбирали в шприц-контейнер с консерватором ЭДТА, который помещали в сумку-холодильник и доставляли в лабораторию в течение 24 часов.
На втором этапе исследований (2003-2004 год) года в качестве материала для получения ДНК, использовали эпителиальные клетки ротовой полости человека. Забор материала осуществляли с помощью одноразовых стерильных зондов. Соскоб эпителиальных клеток с зонда переносили в пробирку типа эппендорф (1,5мл.) со 100 мкл физиологического раствора. Пробирки центрифугировали в течении 5 мин. при 6-10 тыс. об/мин., супернатант отбрасывали. Осадок хранили в морозильном отделении при температуре -5С не более 2-х недель. Данный способ забора клинического материала является неиивазивным, что соответствует требованиям ВОЗ и Минздрава России, направленным на разработку неинвазивных методов, необходимых при массовых обследованиях населения. Выделение ДНК из венозной крови человека. К 300-500 мкл крови, помещенной в пробирку типа эппендорф, добавляли 1 мл физраствора, и центрифугировали 30 сек при 10000 об/мин. Супернатант отбрасывали и инкубировали осадок с 1 мл 0,83% NH4C1 в течение 10 мин. Эта процедура приводит к селективному лизису эритроцитов. Супернатант отбрасывали, к осадку добавляли 1 мл 0,83% NH4C1. Процедуру отмывки от эритроцитов повторяли еще 1-2 раза до получения неокрашенного клеточного осадка. К отмытой клеточной массе добавляли 500 мкл лизирующего буфера. Состав буфера: 4 М гуанидин тиоцианат, 20 мМ Трис, рН 6,4-7,0 и 20 мМ ЭДТА. Клетки лизировали 10 мин. при комнатной температуре. В лизат вносили 10 мкл сорбента, представляющего собой водный гель частиц Si02 размером 5 мкм. Смесь инкубировали 10 мин при комнатной температуре. В данных условиях происходит селективное связывание нуклеиновых кислот с частицами геля. Пробы центрифугировали 15 сек, при максимальных оборотах, отделяя тем самым сорбированную ДНК от других компонентов клеточного лизата. Супернатант отбрасывали, к осадку добавляли 100 мкл лизирующего буфера, ресуспендировали осадок 10 сек. на вортексе, центрифугировали 15 сек. при максимальных оборотах. Осадок дважды промывали 70% этанолом. Полученный после отмывки осадок подсушивали на воздухе, после чего вносили 50 мкл бидистиллированнои воды и инкубировали в течение 10-15 мин. при комнатной температуре. При этом сорбированная ДНК переходит в водную фазу. Пробы центрифугировали 30 сек. Водную фазу, содержащую элюированную с сорбента ДНК, переносили в другую пробирку, которую помещали на хранение при - 20С. Для амплификации использовали 5 мкл полученного раствора. Раствор ДНК хранили при -10 С. Выделение ДНК из эпителиальных клеток ротовой полости человека. К осадку, находящемуся в пробирке типа эппендорф добавляли 300 мкл лизирующего буфера (4 М гуанидин тиоцианат, 20 мМ Трис, рН 6,4-7,0 и 20 мМ ЭДТА). Клетки лизировали 10 мин. при комнатной температуре. В лизат вносили 10 мкл сорбента, представляющего собой водный гель частиц Si02 размером 5 мкм. Смесь инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Пробы центрифугировали 15 сек. при максимальных оборотах, отделяя тем самым сорбированную ДНК от других компонентов клеточного лизата. Супернатант отбрасывали, к осадку добавляли 100 мкл лизирующего буфера, ресуспендировали осадок 10 сек. на вортексе, центрифугировали 15 сек. при максимальных оборотах. Осадок дважды промывали 70% этанолом. Полученный после отмывки осадок подсушивали на воздухе, после чего вносили 50 мкл бидистиллированной воды и инкубировали в течение 10-15 мин. при комнатной температуре. При этом сорбированная ДНК переходит в водную фазу.
Пробы центрифугировали 30 сек. Водную фазу, содержащую элгоированную с сорбента ДНК, переносили в другую пробирку, которую помещали на хранение при - 10С. Для амплификации использовали 5 мкл полученного раствора.
Амплификацию последовательностей в составе генов CYP1A1, PON54, CYP2E1, GSTM1, GSTT1 осуществляли следующим образом. В среднем 500 нг геномной ДНК помещали в 25 мкл реакционного буфера, содержащего по 0,1-0,2 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата, 2 единицы, активности Taq ДНК-полимеразы (ДНК-полимеразы), выделенной из Thermus aquaticus, 15 рМ каждого олигопраймера. Состав буфера: 16,6 мМ сульфата аммония, 67 мМ Tris-HCl, рН 8,8 при 25 С, 1,5-3 мМ хлорида магния 0,1% Twin 20 . На поверхность реакционной смеси наслаивали небольшой объем вазелинового масла для предотвращения высыхания, затем помещали пробирку в автоматический термоцикл ер и подбирали экспериментально необходимую программу смены температур и длительности каждого шага реакции. В данной работе использовали амплификаторы ВЮСОМ и ТЕРЦИК.
При анализе генов GSTM1 и GSTT1 на наличие делеций использовали мультиплексную ПЦР. В амплификационную пробу вносили две пары праймеров, что давало возможность одновременно амплифицировать фрагменты каждого из указанных генов. Такой подход, во-первых, вдвое сокращает время генотипирования. Во-вторых, в том случае, если в конкретной пробе отсутствует только один из фрагментов, можно с уверенностью утверждать, что это является результатом истинной делеций в данном гене, а не следствием некорректно проведенной амплификации. Сомнения могут вызывать случаи, когда отсутствуют оба фрагмента. По имеющимся данным, вероятность этого события мала и такие случаи можно проанализировать, используя другой внутренний стандарт.
Определение частот полиморфных аллелей генов 2 фазы биотрансформации ксенобиотиков (GSTT1, GSTM1)
Данный раздел работы проводился совместно с сотрудниками лаборатории генетического мониторинга Кривцова Е.К., Юрцева Н.А., к. м.н. Юрченко В.В., д.б.н. Хрипач Л.В,
Нами исследован генетический полиморфизм систем биотрансформации ксенобиотиков с одновременной оценкой уровня цитогенетических нарушений у лиц, имевших/имеющих контакт с высокотоксичными химическими веществами.
На основе современных представлений известно, что высокая активность ферментов 1-й фазы биотрансформации (из изученных нами генов: генотипы ILE/ILE гена CYP1A1; N/N, N/M гена CYP2E1) часто приводит к повышению токсичности и мутагенности химических веществ, в частности, в тех случаях, когда метаболиты являются более опасными по сравнению с исходными веществами. В то время как наличие активных ферментов 2-й фазы биотрансформации в (данном случае глутатион-S-трансфераз Ml и ТІ) приводит к инактивации части активных метаболитов и соответственно, к снижению токсичности и мутагенности ксенобиотиков.
PON 1 это сывороточная арилэстераза - наиболее известным действием которой на метаболизм ксенобиотиков является детоксикация фосфорорганических пестицидов и фосфорсодержащих отравляющих веществ (зарин, зоман). С этой точки зрения можно было предполагать, что аллели L/L и L/M гена PON54 (высокая активность фермента) будут благоприятны в отношении детоксикации вышеуказанных химических веществ.
Тест на индукцию хромосомных аберраций (ХА) в клетках крови был проведен у 65 человек, из них 33 человека были из группы лиц, имеющих/имевших контакт с высокотоксичными химическими веществами, и 32 человека из группы сравнения. Микроядерный тест на клетках слизистой оболочки щеки (МЯ) был проведен для 129 обследуемых, из которых 59 человек из группы лиц, имеющих/имевших контакт с высокотоксичными химическими веществами (экспонированные) и 70 человек из группы сравнения (табл. 10). Среднее значение доли клеток с аберрациями в группе сравнения составила 3,2% + 2,0%, в группе экспонированных лиц 2,8%±1,8%. Средние значения доли клеток с микроядрами также не отличались между группами и составили 1,4+1,4%о и 1,3±1,1%о. Для дальнейшего анализа полученных данных мы объединили обе выборки.
Как видно из табл. 11, не выявлено статистически значимых различий между уровнями цитогенетических нарушений (хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови и клетки с микроядрами в буккальном эпителии) в группе сравнения и в группе лиц, имеющих/имевших контакт с высокотоксичньши химическими веществами (р=0,44 и 0,53, соответственно).
В данной работе использованы два подхода к анализу данных. В первом случае изучена взаимосвязь генотипов с уровнем цитогенетических нарушений. Мы провели парное сравнение генотипов CYP1A1 (ILE/ILE, ILE/VAL), CYP2E1 (N/N, N/M, М/М), PON54 (М/М, L/M, L/L), GSTMIH GSTT1 (+, 0/0) с уровнями хромосомных аберрация и микроядер (табл. 12).
Как это следует из табл. 12, достоверных коэффициентов корреляций между генотипами CYP1A1, CYP2E1, PON54, GSTM1, GSTTI и уровнями клеток с микроядрами в буккальном эпителии (с использованием непараметрического критерия Спирмена) не выявлено (р = 0,93; 0,65; 0,51; 0,84; 0,08, соответственно).
Выявлена статистически значимая корреляция между генотипами GSTM1 и уровнями хромосомных аберраций в лимфоцитах. «Нуль-генотип» (0/0) гена GSTM1 связан с повышенным уровнем хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови, генотип «+» соотносится с более низкими уровнями хромосомных аберраций (R= 0,289 р = 0,02), Статистически значимых корреляций между генотипами CYP1A1 (R=0,009; р=0,95) и GSTTI (R=0,002; р=0,99) и уровнем клеток с хромосомными аберрациями не выявлено, наблюдается тенденция к значимой взаимосвязи между генотипами CYP2E1 (R= 0Д98; р= ОД 1) и PON54 (R= ОД82; р= 0Д4) и уровнями хромосомных аберраций в периферической крови (табл. 12). Это послужило поводом для применения множественного регрессионного анализа (таб. 13).
Как видно из табл. 13 полиморфизм по генам PON54 и GSTM1 статистически достоверно связан с уровнем хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови обследованных индивидуумов (р=0,014 и р=0,О05, соответственно), на рис. 5 это отображено графически. Как видно на рис. 1 генотип L/L гена PON54 и генотип «0/0» гена GSTM1 связаны с повышенным уровнем хромосомных аберраций, генотип М/М гена PON54 и генотип «+» гена GSTM1 - с более низким уровнем.
Таким образом, влияние полиморфизма гена GSTM1 на уровень хромосомных аберраций соответствовало ожидаемому. Напротив, влияние полиморфизма гена PON54 на уровень хромосомных аберраций обследованных лиц оказалось обратным тому, что мы ожидали, исходя из литературных данных.
При использовании второго подхода, мы разделили все наблюдения на две группы для каждого метода учета цитогенетических нарушений, для хромосомных аберраций эта граница составила 3% (ХА 3% и ХА 3%). Для метода учета микроядер в буккальном эпителии полости рта эта граница составила 1%о (МЯ 1%о и МЯ 1%о). Такое деление условно, но не является полностью волюнтаристским, поскольку широкие генетико-эпидемиологические исследования среди населения европейских стран (без выявления повреждающих генотоксических агентов) показали, что уровень ХА составляет 1-2,5%, а МЯ - около %о. Для характеристики генотипа в совокупности условно можно использовать термины «защитный» и «предрасполагающий» генотип. Под «защитным» генотипом в отношении биотрансформации ксенобиотиков мы понимаем набор генов (и/или их аллелей), способный успешно контролировать фазы биотрансформации (минимизировать токсические или мутагенные свойства веществ), а под «предрасполагающим» - набор генов (и/или их аллелей), экспрессия которых приводит к увеличению токсичности метаболизируемых соединений.
Определение частот полиморфных аллелей генов 1 (CYP1A1) и 1 (GSTT1 и GSTM1) фазы биотрансформации ксенобиотиков у детей национальности кинь, Вьетнам
Социально-гигиенический мониторинг как государственная система слежения, анализа и оценки состояния здоровья населения в связи с воздействием факторов окружающей среды с каждым годом расширяется и совершенствуется. При этом анализ, выполняемый в рамках этой системы, как правило, имеет ретроспективный характер и проводится в следующей последовательности: изменения в состоянии здоровья - выявление воздействующих факторов - установление возможных источников появления вредных факторов.
Концепция риска, включающая оценку риска и следующую за ней этап - регулирование риска (управление риском), представляет собой новый подход при управлении качеством окружающей среды и выявлении опасности воздействия антропогенного загрязнения на состояние здоровья населения (Онищенко Г.Г. с соавт., 2002).
Использование методологии оценки риска здоровью, как правило, имеет проспективный характер (хотя возможны оценки риска не только от настоящих, но и предшествующих воздействий), т.е. направлено на прогноз возможных изменений в будущем, создавая тем самым основу для профилактики неблагоприятных влияний на здоровье населения.
Исследования в методологии оценки риска проводятся в следующей последовательности; источник загрязнения — загрязненная окружающей среда - воздействие на человека - эффект. Расчет риска всегда ориентирован на наиболее чувствительные к действию неблагоприятных факторов среды группы населения.
В научно-практических исследованиях начинают все в большей мере использовать клинико-физиологические критерии, молекулярно-генетические методы и подходы, без которых невозможны теоретические обобщения и анализ данных о влиянии факторов окружающей среды на организм человека (концепция оценки риска).
В профилактической медицине и медицине труда сегодня большое внимание уделяется изучению состояния здоровья работающих или проживающих в зонах экологического неблагополучия, наиболее точному определению критериев оценки факторов риска, повышению диагностических и лечебно-реабилитационных возможностей при профессиональной и экологически-обусловленной патологии (Фогель Ф., Мотульский А. 1989; Измеров Н.Ф., 2004).
Хорошо известно, что профессиональные и производственно-обусловленные заболевания при одних и тех же условиях труда и стаже возникают не у всех работающих. Выявляемые симптомы и синдромы обнаруживаются в разные сроки и имеют разную выраженность, что формирует клинический полиморфизм и определяет виды и объемы диагностических приемов и лечебно-реабилитационных вмешательств. Течение болезни, формы и тяжесть осложнений, отдаленные последствия имеют индивидуальные особенности у отдельных лиц.
Аналогичные наблюдения имеются и у специалистов, изучающих влияние факторов окружающей среды на здоровье. Они, как правило, оперируют средними частотами той или иной патологии.
Изучение природы наследственной предрасположенности к развитию заболеваний существенно продвинулось в связи с успехами генетики, биохимии, иммунологии и молекулярной биологии.
Одной из наиболее актуальных проблем является канцерогенная и мутагенная опасность загрязнения окружающей среды. Мутагенный эффект от воздействия загрязнителей проявляется как в соматических, так и в половых клетках. Хорошо известно, что мутации в соматических клетках увеличивают число новообразований, вызывают преждевременное старение, влияют на многие жизненно важные функции. Следует отметить, что работ по изучению вклада генетической компоненты в развитие того или иного профессионального заболевания с использованием современных молекулярно-генетических методов до настоящего времени явно недостаточно, хотя в последние годы интерес к данной проблеме возрос. В исследованиях последних лет было установлено, что встречаемость определенных фено- и генотипов, гомо- и гетерозиготность может рассматриваться как фактор повышенной восприимчивости или, напротив, устойчивости к вредным воздействиям производственной среды. Такие данные были получены при изучении пневмокониозов, флюороза, хронического профессионального бронхита (Артамонова В. Г., 2000; Спицын В. А., с соавт., 1992; Спицын В. А., с соавт., 2000; Тарасова Л. А., с соавт., 1998).
В настоящее время идет целенаправленный поиск генов (или их аллельных состояний), контролирующих предрасположенность ко многим заболеваниям у человека и определяющих риск их возникновения при контакте с определенными вредными факторами производственной или окружающей среды. Оценка генетически детерминированной индивидуальной чувствительности человека к действию высокоактивных генотоксикантов может быть полезной как на стадии профессионального отбора, так и в процессе верификации причин и степени тяжести патологических процессов у обследуемых пациентов.
В последние годы появляется много публикаций по выявлению связи между наличием генетических полиморфизмов и мультифакториальными болезнями, а также различными цитогенетическими нарушениями у лиц, контактирующих с потенциальными мутагенами и канцерогенами окружающей среды.
Мы исследовали генетический полиморфизм систем биотрансформации ксенобиотиков с одновременной оценкой уровня цитогенетических нарушений у лиц, имевших/имеющих контакт с высокотоксичными химическими веществами, ожидая зафиксировать у них более высокие уровни генетических нарушений. Однако, сравнение групп лиц, имеющих контакт с высокоактивными химическими веществами, и группами условного контроля таких изменений не выявило. Причин этому может быть несколько. Во-первых, у ряда лиц эти контакты были в относительно далеком прошлом, во-вторых, уровни тех воздействий не представлялось возможным реконструировать, и, в-третьих, часть цитогенетических повреждений могла быть репарирована или элиминирована. Наконец, основными причинами могли быть и есть генетически контролируемые индивидуальные различия.
