Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Оценка генетического действия факторов окружающей среды на клетки органов выделительной системы (обзор литературы) 10
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования 31
2.2. Исследованные факторы 32
2.3. Методы исследования 45
2.3.1. Микроядерный тест на эпителиальных клетках мочевого пузыря экспериментальных животных
2.3.1.1. Приготовление суспензионных препаратов эпителиальных клеток мочевого пузыря после их фиксации в формалине 45
2.3.1.2. Приготовление суспензионных препаратов эпителиальных клеток мочевого пузыря ex tempore 47
2.3.2. Микроядерный тест на клетках коркового вещества почки экспериментальных животных 47
2.3.3. Микроядерный тест на клетках костного мозга экспериментальных животных 48
2.3.4. Микроядерный тест на эксфолиативных уротелиальных клетках человека 50
2.3.5. Характеристика анализируемых цитогенетических и кариологических показателей в клетках органов животных и человека 53
2.3.6. Протоколы учета результатов анализа 57
2.3.7. Статистический анализ исследования 58
Собственные исследования
Глава 3. Сравнительная оценка цитогенетических и других кариологических показателей в клетках органов выделительной системы контрольных животных 59
Глава 4. Оценка временных и дозовых параметров цитогенетического и цитотоксического эффектов циклофосфамида в эпителиальных клетках мочевого пузыря мышей 63
4.1. Зависимость цитогенетического и цитотоксического эффекта от длительности действия и дозы мутагена 64
4.2. Зависимость цитогенетического и цитотоксического эффекта от времени после окончания воздействия 73
Глава 5. Оценка цитогенетического и цитотоксического действия химических веществ на клетки выделительной системы экспериментальных животных микроядерным методом
5.1.Оценка цитогенетического и цитотоксического действия метиленового голубого на эпителиальные клетки мочевого пузыря крыс 77
5.2.Оценка цитогенетического и цитотоксического действия профлавин ацетата в уротелиальных клетках мочевого пузыря крыс 79
5.3. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов диоксидина в клетках коркового вещества почки мышей 81
5.4. Оценка цитогенетического действия диоксазида на эпителиальные клетки мочевого пузыря крыс 83
5.5. Оценка цитогенетической активности диоксида азота в эпителиальных клетках мочевого пузыря крыс 86
5.6. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов изолированного и сочетанного действия солей цезия, стронция и у-излучения при различных сроках воздействия в эпителиальных клетках мочевого пузыря и почек мышей 90
Глава 6. Оценка цитогенетического и цитотоксического действия смесей химических соединений на клетки выделительной системы экспериментальных животных
6.1. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов смеси РМ1 (продуктов химической нейтрализации люизита) в эпителиальных клетках мочевого пузыря мышей 95
6.2. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов смеси РМ2 (продуктов химической нейтрализации иприта) в эпителиальных клетках мочевого пузыря мышей 99
6.3. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов смеси продуктов химической нейтрализации совтола (ПХДС-Т) в эпителиальных клетках мочевого пузыря крыс 104
Глава 7. Оценка цитогенетических и цитотоксических показателей в эксфолиативных уротелиальных клетках человека 106
Глава 8. Обсуждение 109
Выводы 121
Список используемой литературы 125
Приложение 143
Список сокращений 156
- Микроядерный тест на клетках костного мозга экспериментальных животных
- Зависимость цитогенетического и цитотоксического эффекта от длительности действия и дозы мутагена
- Оценка цитогенетического действия диоксазида на эпителиальные клетки мочевого пузыря крыс
- Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов смеси РМ1 (продуктов химической нейтрализации люизита) в эпителиальных клетках мочевого пузыря мышей
Введение к работе
Своевременное и корректное выявление мутагенов для запрета или ограничения их использования - одна из основных задач гигиены окружающей среды [Сычева Л.П., Рахманин Ю.А. и соавт., 2005; Бочков Н.П., Чеботарев А.Н., 1989; Ревазова Ю.А., Журков B.C., 2001]. Это важно и для прогноза канцерогенной активности факторов, поскольку положительные результаты краткосрочных тестов анализа мутагенной активности химических соединений рассматривают в качестве прогностических показателей наличия у них канцерогенных свойств. Некоторые авторы считают, что генотоксические исследования могут стать альтернативой классическим методам оценки канцерогенной активности [Douglas G.K et al, 1988; Ashby J. et all, 1996]. Исследование канцерогенности одного химического соединения общепринятым методом требует проведения двухлетних дорогостоящих экспериментов, поэтому трудно представить, чтобы такие исследования приобрели массовый, опережающий характер. Подобное положение обязывает признать, что краткосрочные тесты для выявления мутагенных химических веществ играют роль своеобразной «просеивающей» программы для выявления потенциальных канцерогенов.
В ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН разработана система оценки мутагенного эффекта факторов окружающей среды с учетом органной специфичности, основой которой является полиорганный микроядерный тест [Сычева Л.П., 2002]. Он позволяет с большей долей вероятности, по сравнению с другими краткосрочными тестами, прогнозировать канцерогенные свойства исследуемого фактора и определять органы-мишени. Однако в этой системе оценка мутагенного эффекта в органах выделительной системы разработана недостаточно. Подобного рода исследования мутагенного действия химических соединений на клетки мочевого пузыря и почек единичны. В то же время установлено, что многие вещества, в том числе ароматические амины, соли тяжелых металлов, хлорорганические соединения индуцируют рак в этих органах. По данным ВОЗ
рак мочевого пузыря по частоте встречаемости среди всех злокачественных новообразований, уступает только опухолям желудка, пищевода, легких и гортани. В мире ежегодно регистрируется около 170 000 - 200000 новых случаев рака мочевого пузыря и среднегодовой темп прироста составляет 3,34% [Чиссов В.И., Старинский В.В., 2002; Borden L.S. et all, 2003].
Установлено, что химические соединения, образующиеся в производственных процессах кожевенной, анилинокрасочной, резиновой, электрокабельной, каучуковой промышленности, а также некоторые лекарственные препараты, обладают генотоксической и канцерогенной активностью в клетках мочевого пузыря человека и лабораторных животных [IARC, 1981; Двойрин В.В. с соавт., 1996; Maltoni С. et all, 1996; Плисе Г.Б., 1996].
Открытие возможности определять генотоксические повреждения в эксфолиативных клетках, полученных неинвазивным способом, позволило использовать микроядра в качестве маркера для выявления ранних канцерогенных изменений в эпителиальных тканях [Stich H.F., Rosin М.Р., 1983; 1984; Rosin MP., 1992; Majer B.J. et all, 2001]. Однако для эксфолиативных уротелиальных клеток человека соответствующие методические основы разработаны недостаточно.
В связи с этим целью исследования являлась оценка микроядерным методом мутагенного действия факторов окружающей среды на клетки органов выделительной системы. Для ее достижения сформулированы следующие задачи:
Усовершенствовать методы оценки цитогенетического эффекта факторов среды в клетках органов выделительной системы экспериментальных животных и человека.
Определить контрольные уровни цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках органов выделительной системы животных и в эксфолиативных уротелиальных клетках человека.
Оценить временные и дозовые закономерности действия модельного мутагена на цитогенетические и цитотоксические показатели в клетках мочевого пузыря млекопитающих.
Изучить мутагенное действие химических соединений и у-излучения на эпителиальные клетки мочевого пузыря млекопитающих.
Научная новизна. Впервые:
В оценку цитогенетического эффекта в уротелиальных клетках мочевого пузыря включен новый показатель - доля клеток с ядерными протрузиями. Установлена высокая значимая корреляция этого показателя с микроядрами (0,52 - 0,72; р<0,001).
В анализ уротелиальных клеток мочевого пузыря включены дополнительные кариологические показатели (частота двуядерных клеток; клеток с центральной ядерной перетяжкой; клеток с атипичной формой ядра), изменение которых может указывать на цитотоксическое действие исследуемого фактора.
Разработан и апробирован неинвазивный метод комплексной оценки эксфолиативных уротелиальных клеток человека по цитогенетическим и кариологическим показателям.
Проведена количественная оценка и определены дозовые параметры цитогенетического и цитотоксического действия на эпителиальные клетки мочевого пузыря мышей и/или крыс диоксида азота, диоксидина, диоксазида, метиленового голубого, профлавин ацетата, стронция, цезия, циклофосфамида, продуктов дезактивации химических отходов (люизита, иприта, совтола).
Определены дозо - временные зависимости цитогенетического эффекта циклофосфамида в клетках мочевого пузыря от длительности воздействия и времени после окончания воздействия.
- Установлены ориентировочные фоновые частоты кариологических
показателей в эпителиальных клетках мочевого пузыря у контрольных
животных и в эксфолиативных уротелиальных клетках человека.
Практическая значимость. Применение разрабатываемой методологии
позволяет значительно увеличить объем получаемой информации о цитогенетическом и цитотоксическом действии фактора, повысить надежность качественной и количественной оценки мутагенных свойств химических соединений в экспериментах на млекопитающих и при обследовании людей.
Материалы исследований по корреляции частоты клеток с микроядрами и протрузиями, оценке других кариологических показателей в органах выделительной системы использованы при разработке:
изобретения «Способ неинвазивной диагностики цитогенетического и цитотоксического действия различных факторов на организм человека» [заявка № 2005108225, приоритет от 24.03.05];
методических рекомендаций «Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека», утвержденных Председателем Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ академиком РАМН Ю.А.Рахманиным [Москва, 2005. - 37с]. Результаты экспериментальных исследований по изучению мутагенной
активности использованы при обосновании гигиенических нормативов:
диоксида азота - разовая ПДК рекомендована к утверждению Комиссией по санэпиднормированию МЗиСР РФ РФ [протокол от 28.12.04 г.] [Справка о внедрении №2 от 25.01.05 г.].
смеси триэтаноламинных солей сульфированных полихлорированных бифенилов и сульфированного трихлорбензола при пероральном поступлении в организм лабораторных животных. ОДУ этих соединений в воде водных объектов утверждена Минздравом РФ [ГН 2.1.5.1316-03].
Результаты по оценке мутагенной активности смесей РМ1 (продуктов нейтрализации люизита) и РМ2 (продуктов нейтрализации иприта) использованы при комплексной оценке степени эффективности обезвреживания и утилизации этих отходов и при обосновании гигиенических рекомендаций по технологии их переработки [Справка о внедрении от 02.02.05г.].
Работа выполнена в лаборатории генетического мониторинга в рамках плановых тем ГУ НИИЭЧиГОС им.А.Н.Сысина РАМН «Разработка методологии оценки мутагенного эффекта в клетках органов дыхательной и выделительной системы», 2003-2005 гг., № госрегистрации 01200303902; «Гигиенические основы управления качеством внутренней среды современных общественных зданий» 2005-2007г., № госрегистрации 01200502722; "Разработка системы методов обоснования и верификации эколого-гигиенических нормативов химических веществ в окружающей среде на основе компьютерного моделирования и экспериментальных исследований", 2003-2005 гг., № госрегистрации 01200303903.
Исследования проведены совместно с лабораториями ГУ
НИИЭЧиГОС им.А.Н.Сысина РАМН: комплексного эколого-
гигиенического нормирования (зав. - д.м.н. О.О.Синицина); гигиены почвы (зав. - к.м.н. И.А.Крятов), питьевого водоснабжения (зав. - д.м.н. Р.И.Михайлова); гигиены атмосферного воздуха (зав. - д.м.н., проф., М.А.Пинигин); цитогистологии (зав. - д.б.н. Н.Н.Беляева); и другими институтами: ГУП МосНПО Радон (рук. группы - д.б.н. А.Н.Осипов); ФГУП ЦХЛС-ВНИХФИ (рук. лаборатории - д.м.н. СМ. Шарова); ГУ НИИ фармакологии (рук. лаборатории - д.м.н., проф., А.Д.Дурнев).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции молодых ученых «Развитие научного творчества молодежи -объект постоянного внимания В.А.Рязанова» [Москва, 2003]; 2-м съезде токсикологов России [Москва, 2003]; 3-м съезде Вавиловского общества
генетиков и селекционеров [Москва, 2004]; 5-м съезде Российского общества медицинских генетиков [Уфа, 2005]; Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Окружающая среда и здоровье" [Суздаль, 2005].
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 3 - в центральной печати.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из
введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований,
обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Текст изложен на 156
страницах машинописи, иллюстрирован 43 таблицами и 11 рисунками.
Указатель литературы содержит 150 источника, из них 52 отечественных и 98
иностранных авторов. ^
Основные положения, выносимые на защиту
Методические основы оценки мутагенного действия факторов окружающей среды на клетки органов выделительной системы (почки, мочевой пузырь) экспериментальных животных и человека.
Зависимость цитогенетического и цитотоксического эффекта модельного мутагена и канцерогена - циклофосфамида в клетках мочевого пузыря мышей от длительности воздействия, дозы и времени после окончания воздействия.
Качественные и количественные параметры цитогенетического и цитотоксического действия химических веществ (метиленового голубого, профлавин ацетата, диоксида азота, диоксидина, диоксазида), смесей (продуктов нейтрализации люизита, иприта, совтола) при ингаляционном и пероральном воздействии, низких доз у-излучения на клетки органов выделительной системы.
Микроядерный тест на клетках костного мозга экспериментальных животных
Приготовление препаратов осуществлялось в соответствии с методическими рекомендациями "Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом" (2001).
Методика приготовления препаратов. Препараты клеток костного мозга готовили в соответствии с Schmid W. (1976) с небольшой модификацией. Мышь умерщвляли методом цервикальной дислокации. Выделяли обе бедренные кости и очищали их от мышц. Для вымывания костного мозга использовали эмбриональную телячью сыворотку. Сыворотку набирали в шприц (приблизительно 1 мл), вымывали костный мозг из обеих бедренных костей в микропробирку. Суспензию центрифугировали при 1000 об/мин. в течение 5 минут, супернатант удаляли пипеткой с пластиковым наконечником, осадок осторожно ресуспендировали. Маленькую каплю суспензии помещали на край предметного стекла и делали мазок под углом 45. Высушивали на воздухе. Препараты фиксировали метиловым спиртом в течение 3 минут.
Окрашивание препаратов. Готовили забуференную воду с рН 7,0, добавляя к 1л дистиллированной воды 2,85 мл раствора А (1/15 М КН2Р04) и 2,15 мл раствора Б (1/15 М Na2HP04X 12НгО). Готовый краситель Романовского-Гимзы разводили забуференной водой (рН 7,0) в отношении 1:6. Окрашивали препараты в течение 10 минут. Препараты промывали в двух сменах забуференной воды. Высушивали на воздухе.
Анализ препаратов. Препараты анализировали под микроскопом в проходящем свете с помощью объектива с масляной иммерсией при увеличении хЮОО. Показателем качества мазка является отсутствие поврежденных ядерных клеток. Эритроциты лежат отдельно, хорошо расправлены. Зрелые эритроциты оранжево-красные, полихроматофильные эритроциты (ПХЭ) - серовато-голубые. Микроядра в ПХЭ представляют собой округлой формы гомогенно окрашенные в красновато-фиолетовый цвет хроматиновые тельца. Они не преломляют свет, по размеру не превышают 1/4 диаметра эритроцита. В редких случаях микроядра могут иметь удлиненную или подковообразную форму. Анализ проводили на зашифрованных препаратах. Подсчитывали 1000 ПХЭ на каждое животное, определяли количество ПХЭ с микроядрами. В качестве дополнительного показателя при подсчете 200 эритроцитов определяли долю ПХЭ от общего числа эритроцитов. У контрольных мышей доля ПХЭ составляет приблизительно 50%. Изменение доли ПХЭ при действии вещества свидетельствует о его влиянии на эритропоэз. 2.3.4. Микроядерный тест на эксфолиативных уротелиальных клетках человека
Для оценки цитогенетического эффекта факторов окружающей среды в клетках органов выделительной системы человека мы разработали методику приготовления препаратов эксфолиативных уротелиальных клеток человека для анализа микроядер и других ядерных аномалий.
Для оценки частоты микроядер в эксфолиативных клетках человека используют разные методы приготовления и окраски препаратов. Для уротелиальных клеток, в основном, исследователи используют методику Stich H.F. с соавторами (1985). Однако они указывают, что не на всех препаратах можно набрать 1000 клеток для анализа, на некоторых не набирали даже 500 клеток. При приготовлении препаратов по разработанной нами методике легко можно анализировать при необходимости не только 1000, но и большее число клеток что, по-видимому, связано с режимами центрифугирования и отмывания клеток. Наши исследования показали, что чем выше скорость центрифугирования, тем больше разрушенных клеток выявляется в образце. Кроме того, мы отказались от центрифугирования клеток в фиксаторе. Для окраски препаратов вместо красителя Гимзы стали применять ацетоорсеин и светлый зеленый.
Приготовление препаратов. Мочу собирали в первой половине дня в количестве 80 - 100 мл. Образцы центрифугировали в течение 6 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливали. Осадок заливали физраствором, осторожно пипетировали и центрифугировали в том же режиме. После удаления надосадочной жидкости осадок равномерно распределяли по сухому, обезжиренному стеклу. Окраску препаратов, микроскопический анализ проводили в соответствии со схемой описанной в главе 2.3.1.1.
Сравнение метода Stich H.F. с соавторами (1985) и нашего показывает, что они отличаются по параметрам центрифугирования мочи, условиям фиксации, окраски и анализа препаратов. Это позволило нам получать препараты с большим количеством клеток, пригодных для анализа (1000 и более).
В мочевом осадке эпителиальные клетки имеют различное происхождение, т. к. их десквамация происходит с органов, покрытых различными видами эпителия (многослойного, плоского, переходного, кубического и призматического).
Клетки переходного эпителия имеют различную величину и форму в зависимости от того, из какого отдела мочевыводящих путей отслаиваются. Могут встречаться полигональные, «хвостатые», цилиндрические и округлые клетки, содержащие одно (довольно крупное) или несколько пузырьковидных округлых ядер; цитоплазма в большинстве заполнена каплями секрета и зернистостью. Иногда в клетках наблюдаются дегенеративные изменения в виде грубой зернистости и вакуолизации цитоплазмы. Встречаются и двуядерные клетки. Клетки переходного эпителия могут находиться в моче изолированно, скоплениями и в виде групп. Переходный эпителий выстилает слизистую оболочку мочевого пузыря, мочеточников, почечных лоханок, простатического отдела уретры и протоков простаты.
Зависимость цитогенетического и цитотоксического эффекта от длительности действия и дозы мутагена
Циклофосфамид в дозе 20 мг/кг также приводит к повышению доли клеток с микроядрами, протрузиями, микроядрами и протрузиями суммарно на 7 день введения. Уровни показателей значимо превышали таковые при 3- и 7-кратном введении циклофосфамида в дозе 10 мг/кг (рис.4.1.1).
При увеличении длительности воздействия циклофосфамида в дозе 20 мг/кг указанные показатели резко снижаются. Введение циклофосфамида в этой дозе в течение 14 суток приводило к снижению доли клеток с микроядрами до контрольного уровня, а доли клеток с протрузиями или с микроядрами и протрузиями суммарно были на уровне таковых при дозе циклофосфамида 10 мг/кг. При 21- и 30-кратном воздействиях величина показателей возрастала, достоверно превышая контрольный уровень. Однако на этом сроке воздействия не отмечено статистически достоверных различий между долями клеток с микроядрами при дозах циклофосфамда 10 и 20 мг/кг, но выявлено значимое возрастание доли клеток с протрузиями.
Представляет интерес оценка связи доли клеток с микроядрами и доли клеток с протрузиями у мышей. Поскольку при дозе циклофосфамида 10 мг/кг при анализе всех сроков затравки отмечено слабое возрастание уровней показателей с увеличением длительности воздействия, а после 7-суточного воздействия уровни показателей стабилизировались, проведен отдельно корреляционный анализ для всех групп мышей (5 групп, 30 животных для каждой дозы циклофосфамида и для групп «7-кратное - 30-кратное воздействие» (4 группы, 24 животных для каждой дозы циклофосфамида). Результаты корреляционного анализа приведены в таблице 4.1.4. Отмечается статистически значимая прямая корреляционная связь данных цитогенетических показателей при действии циклофосфамида в дозах 10 и 20 мг/кг, что, вероятно, обусловлено их сходной динамикой при разной длительности затравки мутагеном. Корреляция показателей «частота двуядерных клеток» и «частота клеток с центральной ядерной перетяжкой» рассчитанная в этом эксперименте, составила 0,24 (Р 0,05; N=90).
Корреляционный анализ показал значимую положительную связь доли клеток мочевого пузыря с микроядрами, протрузиями, микроядрами и протрузиями суммарно от дозы циклофосфамида, за исключением доли клеток с микроядрами, микроядрами и протрузиями при 14-кратном и доли клеток с микроядрами при 21-кратном введении мутагена (табл. 4.1.5). Для оценки зависимости «доза мутагена-эффект» проведен регрессионный анализ. Оценена линейная модель: у = а+ Ьх , где х - доза циклофосфамида в мг/кг; у - доля клеток с микроярами в %о; а и b - коэффициенты уравнения.
Связь доли клеток мочевого пузыря с микроядрами, Результаты регрессионного анализа приведены в таблице 4.1.6. Линейное уравнение удовлетворительно описывает зависимость изученных показателей от дозы циклофосфамида на всех сроках введения, за исключением тех вариантов, где не выявлена связь эффекта с дозой (доли клеток с микроядрами, с микроядрами и протрузиями при 14-кратном и доли клеток с микроядрами при 21-кратном введении мутагена). Ожидаемый уровень показателей у мышей без введения циклофосфамида при всех сроках воздействия (коэффициент а уравнений) находится в пределах 95% доверительного интервала показателя в контрольной группе мышей.
Доля двуядерных клеток при действии двух доз циклофосфамида снижается на 3 сутки. Этот феномен, по-видимому, определяется известным свойством циклофосфамида как цитостатика (рис.4.1.2). 7 о
В параллельном исследовании данного вещества микроядерным методом, проведенном в лаборатории генетического мониторинга Л.П. Сычевой, установлено, что в костном мозге изученные дозы циклофосфамида индуцировали значимое повышение доли ПХЭ с микроядрами по сравнению с контролем во всех группах (табл. 4.1.7). При затравке дозой циклофосфамида 20 мг/кг отмечено значимое превышение доли клеток костного мозга с микроядрами по сравнению с дозой 10 мг/кг. Выявлено возрастание доли клеток костного мозга с микроядрами к 7 дню действия циклофосфамида в дозе 10 мг/кг и к 14 дню действия в дозе 20 мг/кг при последующем снижении эффекта с увеличением длительности действия вещества (рис. 4.1.3), однако эффект сохраняется повышенным на всех изученных сроках воздействия.
Оценка цитогенетического действия диоксазида на эпителиальные клетки мочевого пузыря крыс
Эксперимент проведен в лаборатории токсикологии Всесоюзного научно-исследовательского химико-фармацевтического института им.С.Орджоникидзе (ВНИХФИ) на самцах белых неинбредных крыс, полученных из питомника Крюково, массой 350 г к окончанию эксперимента. Животных содержали при 12-часовом светом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Каждая группа состояла из 5 животных. Крысам в опытной группе в течение трех месяцев ежедневно с помощью ингалятора вводили диоксазид таким образом, чтобы они получали препарат в дозе 25 мг/кг в пересчете на диоксидин. Состав смеси в ингаляторе соответствовал предполагаемому к применению у человека (100 мг диоксидина на 250 мг изониазида). Контрольная группа крыс содержалась в тех же условиях, но не подвергалась какому-либо воздействию.
Полученные результаты по анализу эпителиальных клеток мочевого пузыря крыс представлены в таблице 5.4.1. и 7 (в приложении).
У животных контрольной группы не выявлены эпителиальные клетки с микроядрами в мочевом пузыре, в опытной группе эффект выявлен только у 1 животного, средняя частота показателя в группе составила 0,75%о. Доля клеток с ядерными протрузиями в опытной группе составила 3,5%о при 2,4%о в контроле. Отмечено достоверное повышение частоты двуядерных клеток в опытной группе (25,75%о) при сравнении с контрольной (15,6%о). Достоверное снижение выявлено при сравнении частот клеток, имеющих ядро с перетяжкой (опыт - 36,25 %о, контроль - 56,8 %о).
В исследовании на тех же животных, проведенном сотрудниками лаборатории генетического мониторинга Л.П. Сычевой и М.А. Коваленко, установлено, что в костном мозге и клетках легких цитогенетические показатели (частота клеток с микроядрами и протрузиями) и цитотоксические показатели (доля клеток с ядерными перетяжками, атипичной формой ядра, двуядерных клеток) не отличались в опытной группах от контрольной [Сычева Л.П. и соавт., 2005].
О цитотоксическом действии диоксазида свидетельствует достоверное увеличение, приблизительно на 60%, доли двуядерных клеток в мочевом пузыре крыс. Выявленный эффект может быть связан с особенностями токсикокинетики веществ, составляющих диоксидин. Оба препарата выводятся через почки и мочевой пузырь. Около 30% дозы изониазида экскретируется с мочой, причем половина этого количества в неизмененном виде [Крылова Ю.Ф., 2001]. Диоксидин хорошо проникает в различные органы и ткани, практически не подвергается метаболизму, в основном, выводится почками путем клубочковой фильтрации, причем, в течение 8 часов после внутривенного введения диоксидина в терапевтической дозе (10 мг/кг) в моче отмечают высокие бактерицидные концентрации препарата [Страчунский Л.С., 2000]. Повышение количества двуядерных клеток объясняют усилением компенсаторных процессов в органе при действии токсического агента, который нарушает функционирование части клеток или даже их гибель. Это приводит к усилению пролиферативных процессов для компенсации нарушенных функций путем более интенсивного обновления клеточной популяции.
Анализ данных литературы позволяет считать, что, по-видимому, цитогенетический эффект диоксидина выявляется в клетках костного мозга мышей только при уровне доз, близких к 1/5 ЛД50 (100-150 мг/кг) и выше. В исследованиях Сычевой Л.П. диоксидин проявил цитогенетическое действие в клетках костного мозга в дозе 100 мг/кг, в клетках легких и толстой кишки при внутрибрюшинном введении в дозе 300 мг/кг [Сычева Л.П. и соавт., 2004].
Изониазид, входящий в состав диоксазида, в исследованиях in vivo не индуцировал доминантные летальные мутации у мышей, хромосомные аберрации, сестринские хроматидные обмены или повреждения ДНК у млекопитающих. В единственной работе при исследовании лимфоцитов крови людей, леченных изониазидом в дозе 10 мг/кг, не выявлено повышение частоты хромосомных аберраций [IARC,1987].
Таким образом, диоксазид не оказывал цитогенетического действия на эпителиальные клетки мочевого пузыря крыс при ингаляционном трехмесячном воздействии препарата в дозе, соответствующей приблизительно 25 мг/кг в пересчете на диоксидин. Повышение частоты двуядерных клеток в эпителии мочевого пузыря крыс может указывать на слабое цитотоксическое действие препарата в этом органе.
Эксперимент проведен сотрудниками лаборатории гигиены атмосферного воздуха (зав.лабораторией д.м.н., профессор М.А.Пинигин) на 30 белых неинбредных крысах-самцах массой 250-300 г, полученных из питомника Крюково. Животных содержали при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Путем случайной выборки крыс разделили на контрольную и опытные группы.
Первая группа крыс дышала чистым воздухом и служила контролем. Крысы второй-пятой групп находились в условиях ингаляционного воздействия в специальных 730-литровых камерах. Крысы второй и третьей групп круглосуточно повергались воздействию диоксида азота в концентрациях 10 и 20 мг/м3 в течение двух суток; четвертая группа (10 мг/м3) - в течение 5 суток. Пятая группа повергалась воздействию вещества в концентрации 45 мг/м3 в течение 4 часов, фиксацию органов проводили через 5 суток. Фиксацию органов крыс 2-4 групп проводили сразу же после окончания воздействия диоксида азота.
Цитогенетический эффект диоксида азота оценивали с помощью учета клеток мочевого пузыря крыс с микроядрами, протрузиями, с центральной ядерной перетяжкой, двуядерных клеток и клеток с атипичной формой ядра в подостром эксперименте при ингаляционном воздействии.
Препараты клеток мочевого пузыря готовили в соответствии с главой 2.3.1.1. Результаты анализа клеток мочевого пузыря крыс представлены в таблице 5.5.1. и табл. 5 приложения.
Частота эпителиальных клеток с микроядрами и протрузиями в мочевом пузыре крыс опытных групп варьировала в пределах 0,14-0,50%о и 1,43-2,5%о и не отличалась от контроля. Отмечено достоверное 2-3-кратное повышение частоты двуядерных клеток во всех опытных группах по сравнению с контролем, частоты клеток с ядерными перетяжками на 29-93%о в 3-5 группах, частоты клеток с атипичной формой ядра на 15-30%о (2, 4 и 5 группы).
Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов смеси РМ1 (продуктов химической нейтрализации люизита) в эпителиальных клетках мочевого пузыря мышей
Минимально-действующая доза в мочевом пузыре соответствовала 1/10 ЛД5о (по оценке частоты клеток с протрузиями), максимально-недействующая доза - 1/50 ЛД.50. Повышение частоты двуядерных клеток отмечено при действии минимальной дозы 1/250 ЛД5о и дозы 1/50 ЛД5о РМ1, что косвенно свидетельствует об увеличении пролиферативной активности в мочевом пузыре.
Таким образом, выявлен дозо-зависимый цитогенетический эффект продуктов нейтрализации люизита РМ1. Частота ПХЭ с микроядрами в контрольной группе составила 1,83%о. Частота ПХЭ с микроядрами в опытных группах животных после 7-кратного введения РМ1 в дозах 1/250; 1/50 ЛД50 и 1/10 ЛД50 была 4,0; 3,5 и 2,75%о, соответственно. Отмечено достоверное приблизительно двукратное увеличение доли клеток с микроядрами при действии 1/250 и 1/50 ЛД50 РМ1 по сравнению с контролем. Не выявлено различий по показателю соотношения нормохромных и полихроматофильных эритроцитов между исследуемыми группами.
В параллельном исследовании на клетках легких, проведенной М.А. Коваленко, статистически достоверное отличие частоты клеток с микроядрами опытных от контрольной групп не выявлено. О цитогенетическом действии данного вещества на клетки легкого свидетельствует значимое повышение клеток с протрузиями.
В составе смеси РМ1 содержится мышьяк, который, как известно, индуцирует хромосомные аберрации и микроядра в клетках костного мозга мышей и крыс, мочевого пузыря человека, разрывы ДНК в клетках легких мышей in vivo [GAP2000; Toxicological profile, 1998].
По данным химического анализа в составе смеси РМ1 до 15,5% составляет ЫагАБОз - соединение, в молекуле которого содержится мышьяк. Наличие мышьяка, по-видимому, и обусловило ее мутагенную активность. Для объяснения механизма мутагенного действия мышьяка существуют две гипотезы. Считают, что он не оказывает повреждающее действие на ДНК прямым способом, однако, как показали некоторые исследования, ингибирует один или несколько ферментов, вовлеченных в репликацию или репарацию ДНК. Согласно другой гипотезе мышьяк замещает фосфат в структуре ДНК. Это подтверждается наблюдениями, что эффект мышьяка проявляется только в том случае, когда он присутствует в клетке в период синтеза ДНК. Эта гипотеза позволяет объяснить значительный цитогенетический эффект препарата и в то же время отсутствие индукции генных мутаций [Toxicological profile, 1998]. При оценке опасности исследованной смеси кроме установленной мутагенной активности следует учитывать и то, что мышьяк способен накапливаться в организме млекопитающих, представляющих заключительные звенья трофических цепей [Худолей В.В., Мизгирев И.В., 1996].
Таким образом, проведенные исследования показали, что продукты нейтрализации люизита РМ1 обладают мутагенным (цитогенетическим) действием. На мутагенную и потенциальную канцерогенную опасность смеси РМ1 указывает следующее: - статистически достоверное повышение частоты клеток мочевого пузыря с протрузиями при действии дозы 39 мг/кг по сравнению с контролем; - статистически достоверное повышение частоты двуядерных клеток мочевого пузыря в опыте по сравнению с контролем; - соответствие органов-мишеней (мочевой пузырь) смеси РМ1, содержащей мышьяк, с органами-мишенями мутагенного и канцерогенного действия соединений мышьяка по данным литературы; - возможность накопления мышьяка в организме млекопитающих, представляющих заключительные звенья трофических цепей. Оценка мутагенной активности смеси РМ2 проведена в совместных исследованиях с лабораторией гигиены почвы (зав. лабораторией - к.м.н. И.А.Крятов). РМ2 представляет собой смесь продуктов химической трансформации иприта (дихлордиэтилсульфида). Оценка мутагенных свойств смеси проводилась в соответствии с Методическими рекомендациями «Оценка мутагенной активности...»(2001). Эксперимент проведен нами на 24 мышах самцах (СВАхС57В1/6) F1 весом 18-20 г, полученных из питомника Столбовая РАМН. Животных содержали в пластиковых клетках, давали стандартный корм и воду. Путем случайной выборки мышей разделили на контрольную и опытные группы. Исследуемые смеси в виде 10% растворов получены от к.м.н. И.А. Крятова. По данным, полученным в предварительных исследованиях, ЛД50 смеси РМ2 при внутрижелудочном введении мышам соответствовала 4600 мг/кг (Русаков Н.В. с соавт., 2003). В опытных группах животным вводили растворы смеси в концентрациях, которые приблизительно соответствовали 1/1250; 1/250; 1/50 и 1/10 ЛД50. Для РМ2 они составили 3,6; 18,4; 92 и 460 мг/кг. Для разведения использовали дистиллированную воду. Растворы вводили внутрижелудочно зондом из расчета 0,1 мл на 10 г веса мыши ежедневно в течение 5 дней. Забой животных проводили через 24 часа после последнего введения раствора. Приготовление суспензионных препаратов эпителиальных клеток мочевого пузыря (ex tempore) и оценку мутагенного действия смесей осуществляли в соответствии с главой 2.3.1.2. Оценку цитогенетических и цитотоксических показателей проводили при подсчете 1000 эпителиальных клеток мочевого пузыря. Результаты исследования по отдельным животным и в среднем по группам представлены в таблицах 6.2.1 и 10 в приложении. Введение смеси РМ2 было кратковременным в связи с ее высокой токсичностью, вызвавшей гибель 37,5% мышей. При тестировании РМ2 в эпителиальных клетках мочевого пузыря мышей установлено, что в группе, получавшей 1/50 ЛД5о уровня микроядер по сравнению с контрольной группой увеличился почти в 6 раз (таблица 6.2.1). Группа, которой вводилось вещество в дозе, соответствующей 1/10 ЛД50, в расчет не берется т.к. из-за сильного токсического эффекта из 7 мышей погибли 6.
![Гигиеническая оценка модифицирующего действия факторов окружающей среды химической и радиационной природы на организм человека [Электронный ресурс]](/i/i/4501/178797.png "Гигиеническая оценка модифицирующего действия факторов окружающей среды химической и радиационной природы на организм человека [Электронный ресурс] Воробьев Андрей Павлович")
