Введение к работе
Актуальность проблемы. Обеспечение микробиологической безопасности пищевых продуктов является одной из приоритетных задач, решение которой непосредственно направлено на охрану здоровья населения. Во всем мире эта проблема приобретает особую актуальность в связи с увеличением числа заболеваний, передающихся через пищевые продукты.
Необходимость всестороннего изучения данной проблемы очевидна и включает многоплановую оценку факторов, воздействующих на здоровье человека, наиболее значимым из которых в настоящее время является микробное загрязнение пищевых продуктов возбудителями новых или так называемых «эмерджентных» бактериальных инфекций с пищевым путем передачи (Listeria monocytogenes, Salmonella, энтерогеморрагические E.coli (ЕНЕС), Campylobacter jejuni, Enterobacter sakazakii и др.).
На современном этапе происходит формирование новых представлений о том, какие эволюционные изменения претерпевают пищевые бактериальные патогены в условиях антропогенной трансформации внешней среды, влияющие на этиологические и патогенетические свойства возбудителя, пути передачи инфекции и восприимчивость к ним человеческой популяции [Покровский В.И., 1996, Тутельян В.А., 2002, Гинцбург А.Л., 2002, Литвин В.Ю., 1997, Бухарин О.В., 2009, Тартаковский И.С., 2002, Куликовский А.В., 2004, Fratamico P.M. et al., 2005, Солодовников Ю.П., 2009].
Феномен появления новых возбудителей пищевых инфекций и токсикоинфекций должен рассматриваться с общих позиций эпидемиологической экологии бактерий, изучающей в первую очередь те аспекты существования бактериальных популяций в окружающей среде, которые определяют возможность возникновения инфекционных заболеваний у человека. При этом пищевые продукты и процессы их производства представляются как качественно новая «внешняя среда» обитания или экологическая ниша, сформировавшаяся в условиях развитого индустриального производства и благоприятная для ряда патогенных и потенциально патогенных микроорганизмов.
Выживание бактерий, находящихся в той или иной экологической нише, непосредственно связано с генетически закрепленной способностью включать регуляторные системы изменчивости и адаптации на различных стадиях развития бактериальной популяции [Бондаренко В.И., 1997, Ермолаева С.А., 2001, Доморадский И.В., 2002, Маркова Ю.А. с соавт., 2009]. Однако в свете современных концепций перестройка популяционных структур патогенов по вирулентности и факторам патогенности в условиях окружающей среды существенно отличается от характера персистенции возбудителя в клеточных системах макроорганизма при разных типах инфекций, что требует углубленного изучения биохимических и молекулярно-генетических аспектов этой проблемы.
Оценка частоты появления новых возбудителей пищевых инфекций свидетельствует об ускорении процессов адаптации бактериальных патогенов в неблагоприятных условиях внешней среды, вследствие чего микроорганизмы даже с весьма ограниченным ареалом распространения способны в короткие сроки превращаться в возбудителей острых пищевых инфекций с тяжелым течением и высоким процентом летальных исходов (листериоз, энтерогеморрагический эшерихиоз и др. инфекции).
Нарастающая озабоченность мировой общественности проблемой микробиологической безопасности пищи обусловила появление концепции «эмерджентных пищевых инфекций», в соответствии с которой они рассматриваются не только в медико-генетических аспектах, но и с учетом экологических и технологических факторов, что позволяет расшифровать структуру заболеваемости и прогнозировать появление новых возбудителей [Smith J.L., Fratamico P.M., 2005, MMWR, 2009].
Термин «эмерджентные пищевые инфекции» широко используется в научных публикациях и официальных документах международного сообщества и Всемирной организации здравоохранения, он происходит от английского «emergent» и означает «внезапно появляющиеся» или «вновь возникающие»; в отечественной терминологии используется понятие «новые или возвращающиеся» инфекции.
По определению ВОЗ эмерджентные инфекции – это болезни (и возбудители), возникающие или появляющиеся внезапно и этим обуславливающие чрезвычайные эпидемиологические ситуации, как правило, очень напряженные. Эти заболевания, особенно пищевые зоонозы, являются наиболее эпидемиологически значимыми, наносящими большой социально-экономический ущерб.
Современные подходы к организации системы обеспечения безопасности пищевых продуктов требуют детального исследования особенностей новых патогенов, биохимических и генетических механизмов их вирулентности, а также регулирующей роли технологических факторов в условиях индустриального производства. Это обосновывает необходимость разработки новых критериев в системе санитарно - эпидемиологического контроля продовольственного сырья и готовой продукции, в том числе на основе создания и внедрения высокочувствительных и эффективных методов микробиологического и молекулярно-генетического анализа.
Цель работы: совершенствование системы обеспечения микробиологической безопасности пищевых продуктов путем разработки и внедрения современных методов микробиологического и молекулярно-генетического анализа и новых нормативов безопасности для основных групп пищевых продуктов на основе подробного изучения экологии и особенностей выживания новых видов патогенных микроорганизмов, оценки роли технологических факторов в формировании измененных свойств этих патогенов в условиях пищевых производств.
Задачи исследования:
-
Провести анализ распространенности наиболее значимых эмерджентных пищевых патогенов (Listeria monocytogenes, Salmonella, ЕНЕС, Campylobacter jejuni, Enterobacter sakazakii и др.) в пищевых продуктах и объектах окружающей среды;
-
Изучить основные закономерности эпидемиологии и экологии бактерий Listeria monocytogenes, роль физических, химических и биологических стрессовых факторов в формировании различных типов поведения патогенных листерий, контаминирующих пищевые продукты в процессе их производства и хранения, и обосновать необходимость введения нового норматива безопасности для основных групп пищевых продуктов;
-
Разработать новые методические подходы, позволяющие проводить ускоренную индикацию L. monocytogenes в различных видах пищевых продуктов с использованием высокоспецифичных комбинированных схем бактериологического и молекулярно-генетического анализа;
-
На основе изучения культурально-биохимических свойств и генетических характеристик нового вида патогенных микроорганизмов E. sakazakii сделать анализ диагностической значимости ряда фенотипических и генотипических тестов идентификации и разработать на их основе схему и методику выделения возбудителя; теоретически и экспериментально обосновать необходимость введения нового микробиологического норматива для продуктов питания детей раннего возраста;
-
Определить значение некоторых потенциально патогенных микроорганизмов в возникновении эмерджентных пищевых токсикозов; изучить условия, влияющие на жизнедеятельность токсигенных стафилококков и биосинтез энтеротоксинов в пищевых продуктах; разработать методы выделения и количественной оценки стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах с применением иммуноферментного анализа; исследовать токсигенные свойства новых видов мицелиальных грибов – возбудителей пищевых микотоксикозов.
-
Провести сравнительные испытания методов ПЦР, ДНК- гибридизации и иммуномагнитной сепарации для выделения патогенных микроорганизмов родов Salmonella, Listeria, Campylobacter и Escherichia с традиционными стандартизованными методами анализа; на основе полученных данных разработать критерии стандартизации и гармонизации бактериологических и молекулярно-генетических методов с целью создания единой системы внедрения современных диагностических систем и средств измерений в лабораторную практику микробиологического контроля пищевых продуктов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Изменение свойств микроорганизмов в условиях развитого индустриального производства и антропогенной трансформации внешней среды сопровождается нарастанием патогенного потенциала некоторых видов бактерий, появлением новых или эволюционно измененных возбудителей заболеваний с пищевым путем передачи (эмерджентных пищевых патогенов).
-
В свете современных концепций микроорганизмы Listeria monocytogenes, Salmonella, энтерогеморрагические E.coli, Campylobacter jejuni, Enterobacter sakazakii, S.aureus характеризуются экологическим своеобразием, детерминированностью источников выделения и по частоте обнаружения являются доминирующими среди обширной группы возбудителей пищевых зоонозов.
-
Феномен появления новых и вновь возникающих патогенов сопровождается усилением роли оппортунистических инфекций и их возбудителей: обнаружение среди энтеробактерий нового вида Enterobacter sakazakii характеризует тенденцию изменения экологической ниши и расширения спектра эмерджентных патогенных бактерий среди хорошо изученных популяций семейства Enterobacteriaceae; уточнение таксономических характеристик потенциальных патогенов с неясным систематическим положением повышает надежность системы микробиологического контроля.
-
Изучение основных закономерностей эпидемиологии, экологии и биологических свойств Listeria monocytogenes, а также экспериментальное исследование поведения этих микроорганизмов в модельных системах, имитирующих условия производства пищевых продуктов, позволит расширить базу данных для разработки новых критериев безопасности и анализа степени микробиологического риска возникновения пищевого листериоза.
-
Появление среди известных токсических метаболитов бактерий и грибов «суперантигенов» и других модуляторов системных иммунных реакций повышает степень риска, связанную с накоплением в пищевых продуктах токсинов потенциально патогенных и токсигенных микроорганизмов (S.aureus, B.cereus, микромицеты и др.), что диктует необходимость изучения условий токсинообразования и создания методов их выявления и идентификации.
-
Изучение биологии эмерджентных патогенов и системных механизмов регуляции экспрессии генов факторов патогенности этих бактерий позволяет разработать новые методические подходы с использованием высокоспецифичных комбинированных схем бактериологического и молекулярно-генетического анализа путем подбора наиболее информативных биохимических тестов и генотипирования.
Научная новизна.
Впервые детально изучены экологические особенности, распространение, видовой состав и свойства эмерджентных патогенов Listeria spp., Escherichia coli, Salmonella spp., Enterobacter sakazakii , выделенных из сырья молочного и мясного происхождения, пищевой продукции на различных этапах изготовления и объектов внешней среды (свыше 1500 образцов). Полученные новые данные о характере и количественных уровнях контаминации различных звеньев пищевой цепи позволили выявить наиболее вероятные источники попадания опасных возбудителей в готовые продукты, обуславливающие высокую степень риска даже при соблюдении технологических режимов производства и хранения продукции.
Обоснованы теоретические положения о возможном присутствии в пищевых продуктах новых видов патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae, подтвержденные наличием филогенетических связей между таксономически родственными группами микроорганизмов родов Enterobacter и Pantoea с обнаруженными возбудителями неонатальных инфекций. Впервые в РФ из детских инстантных смесей выделены колиформные микроорганизмы с измененными биологическими свойствами, детальное исследование которых позволило идентифицировать их как малоизученный вид Enterobacter sakazakii. Установлена высокая степень идентичности фенотипических профилей выделенного нового патогена с бактериями вида E.cloacae и фитопатогенными вариантами P.agglomerans, свидетельствующая о возможных единых генетических регуляторных механизмах экспрессии вирулентных свойств этих микроорганизмов.
С использованием новейшей классификации теоретически обоснована таксономическая принадлежность ряда штаммов Е.sakazakii и Pantoea spp., выделенных из детских продуктов, к роду Cronobacter. Введение новых таксономических единиц расширяет перечень потенциальных патогенов, которые не входят по традиционной классификации в группу колиформных бактерий и не учитываются при оценке безопасности детских инстантных продуктов. С учетом значимости E. sakazakii как оппортунистического патогена для новорожденных и вариабельности биологических свойств возбудителя разработана новая схема идентификации.
Анализ основных закономерностей эпидемиологии, экологии и биологических свойств эмерджентных бактерий L.monocytogenes, а также экспериментальное изучение поведения этих микроорганизмов в модельных системах, имитирующих условия производства пищевых продуктов и основные физико-химические параметры технологических процессов, позволили расширить отечественную базу данных о функциональных признаках возбудителя для разработки новых критериев безопасности и анализа степени микробиологического риска возникновения пищевого листериоза. Впервые подробно изучены особенности выживания листерий в процессе длительного хранения в молоке при низких температурах. Установлены исключительно высокая жизнеспособность штаммов L.monocytogenes в этих условиях и длительный период выживания, составивший более 7 месяцев. Выявлена изменчивость основных морфологических и культурально-физиологических свойств штаммов в процессе их длительного хранения в молоке, в частности, постепенное ослабление патогенности, вплоть до полной утраты этого признака после 6-7 месячного периода наблюдения.
В результате изучения биологии L. monocytogenes и системных механизмов регуляции экспрессии генов факторов патогенности этих бактерий разработаны новые методические подходы, позволяющие проводить ускоренную индикацию возбудителя в различных видах пищевых продуктов с использованием высокоспецифичных комбинированных схем бактериологического и молекулярно-генетического анализа на основе подбора наиболее информативных биохимических тестов и их генотипирования с применением ПЦР. Разработанные методические подходы могут быть распространены на другие виды эмерджентных возбудителей заболеваний, имеющих близких непатогенных представителей в пределах рода, идентификация которых должна основываться на определении патогенетических признаков.
На основе проведенного анализа и экспериментального сравнения эффективности существующих модификаций молекулярно-биологических методов, обладающих технологической новизной и универсальностью в отношении различных групп эмерджентных бактериальных патогенов, осуществлены подбор и адаптация твердофазного метода ДНК-гибридизации. Метод включает использование специфических ДНК-зондов для выявления кодируемых признаков патогенности L.monocytogenes или видоспецифических последовательностей рибосомальной ДНК бактерий рода Salmonella, c последующей хемилюминесцентной детекцией продуктов гибридизации нуклеиновых кислот.
Разработана новая методология внедрения современных диагностических систем и средств измерения на основе создания специальных требований и общих критериев стандартизации методик для гармонизации их с традиционными и общепринятыми схемами контроля в пищевой микробиологии; интеграция новых методов молекулярной биологии в действующую систему микробиологического контроля позволит повысить эффективность проводимых исследований, обеспечит сопоставимость и достоверность результатов испытаний.
Практическая значимость.
В результате проведенных аналитических и экспериментальных исследований:
обоснованы и введены в действие новые дифференцированные микробиологические нормативы безопасности, регламентирующие отсутствие патогенных микроорганизмов Listeria monocytogenes в основных группах пищевых продуктов, предназначенных для различных категорий населения;
предложено введение нового микробиологического норматива («отсутствие E. sakazakii в 300 г продукта») для снижения риска возникновения новой пищевой инфекции и обеспечения безопасности продуктов, предназначенных для новорожденных, недоношенных и больных детей раннего возраста;
экспериментально обоснован системный подход к исследованию пищевых продуктов на обсемененность S.aureus и наличие стафилококковых энтеротоксинов, который включает разработанный способ экстракции токсинов из различных пищевых продуктов и использование высокоразрешающих методов иммуноферментного анализа.
Разработаны, адаптированы и стандартизованы новые методы исследования условно-патогенных и патогенных микроорганизмов - контаминантов пищевых продуктов, основанные на применении бактериологического, биохимического, иммуноферментного анализа, ДНК-гибридизации и ПЦР в реальном времени. Апробированы и внедрены в практику микробиологического контроля пищевых продуктов:
методы выявления Listeria monocytogenes в пищевых продуктах (МУК 4.2.1122-02);
метод выявления и определения бактерий рода Salmonella и Listeria monocytogenes на основе гибридизационного ДНК-рРНК анализа (МУК 4.2.1955-05);
метод определения бактерий Enterobacter sakazakii в продуктах для питания детей раннего возраста (МУК 4.2.2428-08);
методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов (МУК 4.2.577-96);
метод определения Campylobacter spp. в пищевых продуктах (МУК 4.2.2321-08);
метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах (МУК 4.2.2429-08);
метод real-time ПЦР для идентификации патогенных бактерий, выделенных при контроле пищевых продуктов (МР № 02.036-08);
количественный микробиологический анализ пищевых продуктов НВЧ-методом при использовании автоматического анализатора ТЕМПО (МР № 02.031-08).
Результаты работы использованы при разработке 27 нормативных и методических документов, в том числе СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы определения и выделения Listeria monocytogenes», СанПиН 2.3.2.1324-03 «Гигиенические требования к срокам годности и условиям хранения пищевых продуктов», МУК 4.2.1847-2004 «Санитарно-эпидемиологическая оценка обоснования сроков годности и условий хранения пищевых продуктов».
Апробация работы. Полученные материалы и основные положения диссертации представлены в 40 докладах и тезисах, которые были доложены и обсуждались на 15 международных научных форумах, 13 всероссийских конгрессах, симпозиумах, межрегиональных совещаниях и научно-практических конференциях.
Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации опубликованы в 2 монографиях и 66 научных работах, в том числе 20 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 327 страницах машинописного текста, состоит из введения, 11 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 445 наименований, в том числе 355 на иностранных языках. Работа содержит 102 таблицы и 61 рисунок.
