Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Генно-инженерно-модифицированные микроорганизмы -биотехнологические разработки, использование при производстве пищевых продуктов 10
1.2. Гигиеническое обоснование системы контроля за оборотом ГММ в пищевой продукции 22
1.3. Законодательное и нормативно-методическое регулирование оборота пищевой продукцией, полученной с применением ГММ. Международные и национальные подходы 33
Глава 2. Материалы и методы исследования 50
2.1. Объекты и объем исследований 50
2.2. Методы исследования 51
Глава 3. Результаты собственных исследований и обсуждение 57
3.1. Анализ мирового биотехнологического и продовольственного рынка ГММ 57
3.2. Изучение и анализ использования ГММ на продовольственном рынке Российской Федерации 70
3.3. Разработка информационных баз ГММ и традиционных аналогов, применяемых в производстве пищевой продукции 84
3.4. Разработка алгоритмов проведения лабораторного контроля ГММ в различных видах пищевой продукции 91
3.5. Разработка скрининговых методов и средств лабораторного контроля ГММ в пищевых продуктах 97
Глава 4. Заключение 105
Глава 5. Выводы 109
Глава 6. Внедрение в практику 110
Глава 7. Список литературы 111
- Генно-инженерно-модифицированные микроорганизмы -биотехнологические разработки, использование при производстве пищевых продуктов
- Законодательное и нормативно-методическое регулирование оборота пищевой продукцией, полученной с применением ГММ. Международные и национальные подходы
- Анализ мирового биотехнологического и продовольственного рынка ГММ
- Разработка скрининговых методов и средств лабораторного контроля ГММ в пищевых продуктах
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
Широкое применение современных методов биотехнологии, и в первую очередь, генной инженерии при производстве продовольствия сегодня признается наиболее перспективным направлением совершенствования качества и увеличения объемов пищевых продуктов. Разработка и использование генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов (ГММ) с улучшенными технологическими свойствами (повышенная продукция ферментов, биологически активных веществ, устойчивость к микробному загрязнению) выгодны прежде всего экономически, поскольку требуют значительно меньших объемов исходного натурального продовольственного сырья, трудозатрат и времени, чем применение традиционных промышленных микроорганизмов (Рогов НА., Воробьев А.И., 2004; Тутельян В.А., 2003; Клер Робинсон, Глик Б., Пастернак Дж., 2002; Народицкий Б.С, 2006; MacKenzie D. J., 2000; James С, 2009; Chrispeels M.J., 2008).
Вместе с тем, большинство экспертов признает, что новые качества ГММ, особенно не имеющие истории безопасного использования в пищу, могут быть связаны с потенциальным риском для человека и окружающей среды, а созданные генетически модифицированные продукты (ГМ-продукты) перед выпуском на потребительский рынок в обязательном порядке должны подвергаться комплексным испытаниям на безопасность. При этом должно быть доказано отсутствие рисков неблагоприятного воздействия на человека и окружающую его среду, обусловленных как самими целевыми генами, так и кодируемыми ими новыми белками (в первую очередь, патогенности, аллергенности, токсичности). Одним из главных аргументов против использования трансгенных технологий в производстве пищи является нестабильность генетической конструкции, возможное присутствие генов антибиотикоустойчиво-сти, потенциально способных к трансмиссии в представителей резидентной микрофлоры желудочно-кишечного тракта и контаминации пищевых продуктов (ВОЗ, 2005; Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л., 2006; Тутельян В.А., 2007; Кирпичников М.П, 2008).
Во избежание потенциального неблагоприятного воздействия продуктов, полученных с применением ГММ, на здоровье человека, животных и благополучие окружающей среды, при государственном регулировании генно-инженерной деятельности предусмотрены специальные требования к допуску ГММ и трансгенных продуктов на продовольственный рынок. Несмотря на существующие различия подходов, во всех национальных схемах регулирования ГММ предрегистрационный этап является определяющим в обеспечении безопасности новых ГМ-продуктов. Он включает индивидуальную оценку риска каждого конкретного ГММ, итогом которого должно быть доказательство такой же степени его безопасности, как и традиционного аналога (Рогов И.А., 2003; Стандарты ЕС CAC/GL 44-2003, CAC/GL 46-2003; Сорокина Е.Ю., Тутельян В.А., 2005; ФАО/ВОЗ, 2006, 2008).
В настоящее время в мире не существует единых, гармонизированных подходов к созданию ГММ, к оценке их безопасности, маркировке и допуску трансгенных продуктов на международный рынок продовольствия.
В некоторых технологически развитых странах (США, Канада, Великобритания) в отдельных случаях не придают большого значения мерам контроля за ГММ. При этом мировые производители ссылаются на высокий научный и технологический потенциал при разработке ГММ, должный научно-методический уровень оценки и практически не подвергают сомнению, что любые риски от трансгенных продуктов, признанных безопасными, маловероятны (FDA, 1991; Food Chemicals Codex, 2001; Тутельян В.А., 2005).
Международные организации ФАО/ВОЗ и европейское законодательство стоят на позициях обеспечения прав потребителей на информированный выбор любых новых пищевых продуктов и предупреждения рисков. Механизмы регулирования ГММ должны включать систематический контроль за оборотом разрешенных и допущенных на продовольственный рынок пищевых продуктов, полученных с применением ГММ, а также использование специальной маркировки таких продуктов и технологии их производства (ILSI Europe, 1999; Директивы 18/2001/ЕЕС, 90/220ЕЕС)
Вместе с тем, во многих странах, в т.ч. государствах Европейского сообщества, не предусматривается маркировка допущенных на рынок трансгенных продуктов, выработанных по технологиям, предусматривающих полную очистку конечных продуктов от ГМ штаммов-продуцентов. В последние годы вследствие причин экономического характера производство по данным технологиям переносится в регионы с менее развитой культурой производства и дешевой рабочей силой. Данное обстоятельство является причиной риска некачественного полного удаления ГМ штаммов из продуктов и может привести к попаданию на рынок продовольствия живых ГММ (Правила ЕС 1829/2003, 1830/2003; Брукс Г., Барфут П., 2006).
Поступление на мировой продовольственный рынок ГМ-продуктов без маркировки в результате нерегулируемого статуса ГММ на пострегистрационном этапе, помимо нарушений прав потребителей, создает серьезную проблему в оценке безопасности при ввозе ГММ, которая должна проводиться с учетом требований законодательства импортирующих стран.
Наряду с мониторингом ГММ, разрешенных для реализации на внутреннем потребительском рынке, необходимо обеспечивать контроль и защиту от потенциально небезопасных, не прошедших процедур допуска и поступающих в страну нелегально, а используемые методы должны опережать развитие технологий создания ГММ и базироваться на современных приоритетных исследованиях биологической и медицинской науки, молекулярной биотехнологии.
Поэтому контроль за оборотом ГММ в настоящее время является одной из наиболее актуальных проблем, решение которых направлено на охрану здоровья населения и имеет большое социальное значение. Разработка системы гигиенического контроля ГММ в пищевых продуктах была начата в 2003-2004 гг., включает новейшие отечественные и зарубежные научные подходы и основана на всестороннем научно-организационном, информационном, методическом обеспечении мероприятий по изучению, обнаружению и оценке безопасности ГММ, разработке соответствующих им маркерных систем; продуктов, в которые они вводятся; объемов мирового производства и торговли ГМ-продовольствием, в том числе поступающего на внутренний рынок Российской Федерации; а также на разработку и применение адекватных, чувствительных и высокоспецифичных методов и средств обнаружения, анализа безопасности ГММ (Скрябин К.Г., 2003; Народицкий Б.С.,2004; Онищенко Г.Г., Филатов Н.Н., Гульченко Л.П., 2008).
Исследования проводились в соответствии с планами НИР по теме № 098: «Генно-инженерно-модифицированные источники пищи: безопасность и контроль».
Целью настоящей работы являлась разработка информационного и нормативно-методического обеспечения системы гигиенического контроля за оборотом пищевой продукции, полученной с использованием ГММ.
Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:
на основании анализа данных литературы, изучения объемов мирового производства ГММ, структуры и объемов импорта в РФ пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, и их традиционных аналогов, разработать информационные (справочные) базы данных о ГММ с учетом безопасности классических промышленных микроорганизмов и пищевых продуктов - потенциальных объектов генетических модификаций;
провести выборочные исследования репрезентативного перечня различных видов пищевой продукции, изготавливаемой с использованием биотехнологических микроорганизмов, на наличие ГММ с целью оценки риска допуска на рынок продовольствия потенциально опасных трансгенных продуктов;
на основании сравнительного анализа применяемых методов обнаружения и оценки безопасности ГММ в пищевой продукции и результатов лабораторного тестирования пищевых продуктов обосновать необходимость применения скрининговых методов и средств для детекции ГММ при ввозе из-за рубежа и реализации продукции на продовольственном рынке;
разработать унифицированный метод, диагностический набор и алгоритм проведения анализов для лабораторного контроля и мониторинга продукции в обороте для специалистов учреждений санитарно-эпидемиологической службы.
Впервые разработаны новые подходы к информационному анализу и нормативно-методическому обеспечению системы контроля пищевой продукции, основанные на молеку-лярно-генетических методах обнаружения и оценки безопасности ГММ в трансгенных и традиционных продуктах, которые могут служить объектами генно-инженерных модификаций.
Проведен научный анализ и разработаны информационные базы промышленных ГММ и их классических аналогов, представленных на мировом продовольственном рынке, статус легитимности, безопасности, уровень внедрения в производство (коммерциализации), определены ведущие страны и разработчики ГММ и пищевых продуктов на их основе.
Научно обоснована необходимость контроля (мониторинга), направленного на выявление живых ГММ в пищевых продуктах, содержащих пробиотическую микрофлору, на подтверждение отсутствия штаммов ГМ-продуцентов в ферментных препаратх, биологически активных веществах, пищевых добавках, используемых при производстве пищевых продуктов и подлежащих удалению из конечного продукта.
Изучена распространенность ГМ-штаммов, представленных на мировом продовольственном рынке. Представлены методы идентификации, важные при осуществлении контроля на наличие в пробах ГММ, применяемых при производстве пищевой продукции. Рассмотрены результаты микробиологических и молекулярно-генетических анализов пищевых ингредиентов, важные при контроле пищевых продуктов на наличие ГММ, указаны методы их определения и оценки безопасности, адекватные степени риска нелегитимного использования ГММ при производстве пищевых продуктов.
Информационные базы ГММ, их традиционных аналогов, пищевой продукции, вырабатываемой с использованием промышленных микроорганизмов, алгоритмы лабораторного контроля были использованы при разработке Санитарно-эпидемиологических правил и нормативов СанПиН 2.3.2.2340-08 (Дополнения и изменения № 6 к СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов»).
Разработаны и внедрены в практику лабораторного контроля пищевой продукции в обороте Методические указания МУК 4.2.2305-07 «Определение генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги, в пищевых продуктах методами полимеразной цепной реакции (ГЩР) в реальном времени и ПЦР с электрофоретической детекцией».
Разработан Набор реагентов («ГМ-БАКТ-1») для выявления ГММ бактериальной природы методом полимеразной цепной реакции в пищевых продуктах (ТУ 9398-001-01897357-2008), который применяется при контроле ГММ в учреждениях Роспотребнадзора.
Результаты работы используются в учебном процессе МПФ ГОУ ППО Первого Московского медицинского университета им. И.И.Сеченова Росздрава на кафедре инфектологии, кафедре гигиены питания и токсикологии и кафедре социальной гигиены и организации санитарно-эпидемиологической службы с курсом основ лабораторного дела на базе ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора.
Основные положения диссертационной работы были доложены на 6-й и 7-й всероссийских конференциях «Молекулярная диагностика - 2007, 2010» (Москва, 28-30 ноября 2007 г. и 24-26 ноября 2010 г.), диссертация апробирована на совместной научной конференции ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России и НИИ питания РАМН 22 декабря 2010 г.
По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки РФ, методические указания, санитарные правила и нормы.
Диссертация изложена на 201 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, обоснования цели и выбора методов исследования, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, приложения, включает 5 схем, 7 таблиц и 17 рисунков и диаграмм. Список литературы содержит 124 отечественных и 81 зарубежных источников.
Генно-инженерно-модифицированные микроорганизмы -биотехнологические разработки, использование при производстве пищевых продуктов
В 1980 году с научного признания работ в области молекулярной биологии и присуждения Нобелевской премии за создание первой рекомбинантной молекулы началось стремительное развитие биотехнологии - направления науки и бизнеса, которое по темпам развития не уступает компьютерным и коммуникационным технологиям. Уже в 1982 году трансгенные технологии с использованием микроорганизмов были успешно применены при синтезе человеческого инсулина, в 1986 году - при создании генно-инженерной вакцины от гепатита В. Не менее успешное развитие в последние 20 лет получили биотехнологии с использованием микроорганизмов в пищевой индустрии. В 1990 году в Великобритании впервые были зарегистрированы модифицированные дрожжи [49, 73, 75].
Применение биотехнологий может существенно влиять на повышение объемов и качества произведенного продовольствия в каждой отдельной стране и в мире в целом. При этом они должны соответствовать и удовлетворять потребностям населения в пище с целью обеспечения жизнедеятельности организма, сохранения и укрепления здоровья, повышения качества жизни. Одной из многих проблем современного мирового сообщества, имеющей глобальный характер, является дефицит продовольствия. [40, 84, 116, 117, 118]. В связи с тем, что объемы производства и запасов продовольствия существенно зависят от климатических, геополитических, экономических факторов и имеют определенный непродолжительный срок пригодности для употребления в пищу совершенно обосновано применение биотехнологических подходов [42, 44].
Производители пищевой продукции активно ведут поиск новаторских продуктов и процессов, а также технологий, которые могут способствовать эволюции, росту объемов и совершенствованию качества продовольствия [39,. 85]. Во второй половине 20 века резко возрос технологический потенциал производства и переработки пищевых продуктов, в связи с чем появились новые возможности безопасного производства традиционных и новых пищевых продуктов.
В прошлом основная задача новых технологий заключалась в достижении более высокой производительности, сокращении расходов и повышении надежности процессов. Учитывая сдвиг в сторону подхода, ориентированного на потребителя, определяющими факторами в настоящее время становятся требования в отношении качества и безопасности пищевых продуктов, а также охраны окружающей среды [63, 77].
Успехи молекулярной генетики оказали серьезное влияние на технологии производства пищевых продуктов, кормов для животных, фармакологических и ветеринарных препаратов. Потенциал генной инженерии обеспечил возможность перехода от случайных находок полезных мутаций, способствующих формированию пригодных в пищу человеку видов и сортов растений, животных, микробов, к направленному, точному изменению генома организма для получения заданных потребительских свойств [3, 4, 72, 73].
Генетическая инженерия позволяет существенно расширить возможности микробиологического производства, повысить микробную продуктивность и сделать биосинтез экономически более выгодным по сравнению с химическим производством. Клонирование в микробную клетку генов определенных метаболических путей позволяет не только существенно увеличить количество конечного целевого продукта, но и добиться синтеза таких несвойственных для микробного метаболизма веществ как, например, инсулин. Генная инженерия позволяет перевести т.н. «индуцибельные» гены (экспрессируются при наличии в среде определенного соединения), в «конститутивные» (экспрессируются постоянно на высоком уровне). В том случае, если необходимое вещество синтезируется микроорганизмом, неприспособленным для роста в среде, достаточно клонировать гены, отвечающие за синтез этого соединения в другой, хорошо адаптированный для роста в биореакторе штамм. Методы генной инженерии позволяют передавать как один, так и несколько генов от одного организма другому, причем донор и реципиент не обязательно должны быть близкородственными. Это резко увеличивает разнообразие изменяемых свойств, ускоряет процесс получения организмов с заданными свойствами, а также, что очень важно, облегчает прослеживание генетических изменений и их последствий [70, 80, 81].
Благодаря направленным генетическим манипуляциям, удается не только увеличить продуктивность биосинтеза, но и получать вещества, химическое производство которых ранее было невозможно. Пищевые добавки, аминокислоты, витамины, ароматизаторы, ферменты - это далеко не полный перечень веществ, которые получают при помощи ГММ. В ряде случаев, биотехнологические методы производства этих соединений уже заменили традиционный химический синтез.
Преимущества биотехнологического производства с использованием ГММ очевидны, так как микроорганизмы быстро растут и, в большинстве случаев, легко культивируются. В отличие от традиционного химического синтеза, биосинтез протекает при нормальных условиях, а значит, для него не требуется создание таких дополнительных условий как повышенная температура, давление, или применение агрессивных химикатов. Очевидна экологическая привлекательность биосинтеза, основанного на использовании возобновляемых природных ресурсов, а также того факта, что неиспользованная продукция легко подвергается биодеградации и оказывает минимальное загрязняющее воздействие на сточные воды [49, 76, 91].
Роль и значение биотехнологий с использованием промышленных микроорганизмов можно проиллюстрировать на объемах продаж за 2009 год компании ДСМ (DSM), Нидерланды, имеющей 14 заводов в Европе, США, Южной Америке, Австралии, Азии и являющейся одним из ведущих разработчиков и производителей пищевой продукции. Так, за 2009 год продажи компании ДСМ составили 1,2 миллиарда евро, из них объем продаж ферментных препаратов, производимых из микроорганизмов, составил 178 млн. евро (15 %), а доля продаж ферментных препаратов и пищевых добавок, произведенных с применением ГММ, составила 106 млн. евро (10 %) [200, 204].
В настоящее время ГММ применяются во многих областях: для решения вопросов стабилизации биосферы и утилизации отходов (вплоть до остановки наступления пустынь и восстановления плодородия земель, уменьшения парникового эффекта путем использования штаммов, способных эффективно поглощать и связывать влагу атмосферы, осуществлять биодеградацию полимеров), производства в целлюлозно-бумажной промышленности [75, 92, " 116].
Одной из первых генная инженерия была применена в фармацевтической биотехнологии при создании высокопродуктивных микробных продуцентов ряда антибиотиков, аминокислот, ферментов и витаминов. В 1982 году был зарегистрирован и внедрен в промышленное производство новый лекарственный препарат - человеческий инсулин, вырабатываемый бактериями E.coli. Далее были синтезированы гормон роста, интерферон, тауматин.
В число зарегистрированных лекарственных средств для медицины и ветеринарии, полученных с помощью современных методов биотехнологии входит более ста наименований генно-инженерных вакцин и других иммунобиологических препаратов (интерфероны, интерлейкины и др.), продуцентов пептидных гормонов, ферментов [4, 21, 67].
Законодательное и нормативно-методическое регулирование оборота пищевой продукцией, полученной с применением ГММ. Международные и национальные подходы
По мнению ВОЗ, несмотря на разнообразие, обусловленное внутренними приоритетами, в мире сформировались общие подходы в регулировании ГММ. При обосновании системы контроля за ГММ необходимо учитывать:
- общую политику государства и стратегию в отношении производства и использования ГММ;
- систему формирования законодательной и нормативно-правовой базы;
- порядок допуска на потребительский рынок;
- систему обязательного последующего контроля за оборотом новых ГМ-продуктов на рынке;
- систему информационного обеспечения потребителей.
Законодательные основы биобезопасности при использовании ГМО впервые были сформулированы в Рио-де-Жанейрской Декларации, принятой в 1992 году на конференции ООН по окружающей среде и развитию. В основе формирования нормативной базы лежит принцип предварительной предосторожности.
В настоящее время в рамках в документах ООН принцип «принятия мер предосторожности» рассматривается прежде всего как подход, подразумевающий принятие корректирующих мер там, где существует значительная опасность нанесения ущерба и состоянию окружающей среды, даже если в настоящее время ее возникновение однозначно недоказуемо [27, 29].
Принцип «принятия мер предосторожности» - это один из подходов, который основан на неопределенности аптропогенных воздействий на окружающую человека среду. Такой подход выдвигает на передний план необходимость учета потенциального и будущего ущерба и является одним из методов прогнозирования, превентивной мерой влияния на возможные неблагоприятные события, которые еще не произошли. Именно в таком контексте следует рассматривать 15-й принцип Рио-де-Жанейрской Декларации: «В целях защиты окружающей среды государства, в соответствии со своими возможностями, широко применяют принцип принятия мер предосторожности. В тех случаях, когда существует угроза серьёзного или необратимого ущерба, но в то же время присутствует научная неопределенность о степени опасности угрозы, - это не может являться причиной для отсрочки принятия эффективных мер по предупреждению ухудшения состояния окружающей человека среды» [27, 29, 52, 75].
Таким образом были провозглашены важные принципы новых взаимоотношений между социально-экономическими, политическими аспектами жизнедеятельности человека и обеспечением безопасности окружающей человека среды.
Принцип «принятия мер предосторожности» включает в себя следующие четыре элемента: риск, ущерб, научную неопределенность и дифференцированные возможности.
Риск - это определяющая характеристика принципа принятия мер предосторожности. Риск представляет собой более или менее предсказуемую потенциальную угрозу, которая может привести к ущербу.
Ущерб - это характеристика определенного уровня опасности. Этот - уровень определяется такими понятиями, как «серьёзность» и «необратимость», в результате чего часто возникает проблема, обусловленная сложностями, связанными с оценкой, устранением и возмещением ущерба.
Научная неопределенность - это отсутствие однозначного научного понимания обстоятельств, явлений и факторов, относящихся к конкретной проблеме. Научная неопределенность считается непременным условием для применения принципа «принятия мер предосторожности» и придания ему правового статуса.
Дифференцированные возможности - это учет возможностей различных государств соотнести принцип предосторожности с соразмерным подходом в зависимости от уровня развития государства. К государствам, находящимся на разных уровнях развития, нельзя предъявлять одинаковые требования по применению принципа «принятия мер предосторожности» вследствие разного уровня возможностей. В данном случае возможности государства - это совокупность человеческих, финансовых, экономических и технических средств, имеющихся в распоряжении государства для оценки, предотвращения рисков и лучшего управления ими.
Риск, ущерб, научная неопределенность и дифференцированные возможности государства как базовые понятия принципа предварительной предосторожности в полной мере должны применяться при обосновании и разработке системы контроля за пищевой продукцией, полученной с применением молекулярной биотехнологии.
Как при развитии новых технологий так и при создании системы контроля за продуктами этих технологий неизбежно должен быть сформирован алгоритм реализации и управления. Прежде всего должны быть созданы регуляторные механизмы - нормативная база. По этому принципу строится все мировое законодательство в сфере использования новых технологий и контроля за их применением.
Существенной составляющей системы контроля является постоянный регистрационный мониторинг с обратной связью. Эксперты в области контроля за ГМО должны наблюдать за тем, что происходит, и обеспечивать безопасность. Прослеживать судьбу разрешенного к использованию человеком _. организма и продуктов, полученных из него, для того, чтобы в случае появления каких-либо негативных проявлений немедленно обеспечить рассмотрение или пересмотр решения об использовании технологии [33, 87, 90, 103, 116].
Методы обнаружения, идентификации и медико-биологической оценки ГММ и пищевой продукции, полученной с применением ГММ занимают важное место в системе контроля за ГММ, используемыми при производстве пищевых продуктов. Разработка методов обнаружения, идентификации и анализа безопасности ГММ началась одновременно с их выходом на мировой продовольственный рынок.
В условиях бурного развития биотехнологии современные исследования биобезопасности ГММ и полученных из них продуктов питания должны непременно опережать их широкомасштабное коммерческое использование. Данное положение является непременным условием при разработке законодательной и нормативной базы гигиенического контроля за оборотом ГММ [64, 68, 74, 88]. Нормативно-методическое регулирование применения ГММ зависит от вида продукции (живые микроорганизмы, инактивированные, продуценты штаммов-микрорганизмов), биотехнологических приемов, применяемых при ее изготовлении [22].
Несмотря на готовность биотехнологических компаний использовать живые ГММ, в настоящее время в мировом сообществе на законодательном уровне нет прецендентов разрешения производства продуктов питания человека, содержащих живые ГММ и, тем более, разрешений их импорта.
В Великобритании (Соединенное Королевство) несколько лет назад были одобрены две культуры генетически модифицированных дрожжей. Это пекарские дрожжи, ускоряющие приготовление теста, и пивные дрожжи, использующиеся при изготовлении диетического пива. Вместе с тем, данные культуры дрожжей не представлялись для одобрения в ЕС или в других странах, до настоящего времени, не присутствуют на рынке в странах ЕС и не используются в крупных коммерческих масштабах [202].
Законодательные и нормативные акты и методы обнаружения ГММ направлены на предотвращение несанкционированного или непреднамеренного импорта ГМ продуктов в коммерческих целях. В связи с этим лабораторному контролю подвергаются микроорганизмы, имеющие генетически модифицированные аналоги (МГМА) и соответственно пищевые продукты, изготовленные с их использованием.
Необходимость законодательного регулирования подходов и стратегии в детекции ГММ, гармонизации методик подчеркиваются в Картахенском протоколе по биобезопасности (статья 18) к Конвенции о биологическом разнообразии стран Организации Объединенных Наций (ООН) [28, 29, 30, 31].
Международная организация стандартизации (МОС) разработала основные технические стандарты, касающиеся ГМО [16, 17, 18, 19, 20, 82].
Исследования по оценке рисков использования ГММ законодательно регламентированы в странах ЕС (стандарты Комиссии «Кодекс Алиментариус»-принципы анализа рисков пищевых продуктов, полученных с помощью современной биотехнологии (CAC/GL 44-2003), руководящие указания по проведению оценки безопасности пищевых продуктов, произведенных с применением микроорганизмов с рекомбинантной ДНК (CAC/GL 46-2003).
Существует два классических подхода, которые используются для обнаружения ГММ: обнаружение новой трансгенной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), которая была введена в микроорганизм, или обнаружение белка (белков), вызванных появлением трансгенной ДНК.
Анализ мирового биотехнологического и продовольственного рынка ГММ
При анализе тенденций развития и достижений в области современных биотехнологий, при структуры и объемов производства ГММ, наряду с литературными источниками, активно использовались электронные сайты официальных международных организаций, органов по контролю за оборотом ГМО стран Европейского союза, США, а также открытые данные о производстве биотехнологической продукции ведущих компаний - основных экспортеров продукции на продовольственный рынок России [196-207].
Вследствие отсутствия веских доказательств безопасности и наличия рисков в мировом сообществе в настоящее время ГММ в жизнеспособном состоянии при производстве пищевых продуктов не применяются.
Изучение национальных законодательств основных зарубежных стран, являющихся ведущими разаработчиками и производителями ГММ, анализ структуры и объема пищевой продукции, полученной с применением ГММ, медико-биологические, микробиологические и молекулярно-генетические исследования данной продукции, поступившей на продовольственный рынок России по импорту позволяют исключить из анализа мирового продовольственного рынка живые ГММ.
Доля пищевой продукции, содержащей инактивированные (убитые) ГММ крайне незначительна, не получила большого распространения, так как требует обязательной маркировки. Инактивация ГММ в ряде случаев приводит к снижению пищевой ценности, качества и ухудшению потребительских свойств продукта.
Подавляющую часть мирового биотехнологического рынка, получившего наибольшее развитие в последнее десятилетие и соответствующего требованиям безопасности, занимает пищевая продукция, где ГМ-штаммы применяются только в качестве продуцентов пищевых ингредиентов на производственном этапе и подлежат полной очистке продукта от штаммов-продуцентов на конечном технологическом этапе.
К этой группе относятся пищевые компоненты и вещества, пищевые добавки и микронутриенты: ферментные препараты, витамины (бета-каротин, рибофлавин и др.), гамма-линоленовая кислота, ароматизаторы, подсластители, консерванты (низин, молочная кислота и др.), пищевые органические кислоты (лимонная, винная, яблочная и др.), пребиотики (фруктоолигосахариды), декстрины и другие продукты крахмалопаточной промышленности, белковые гидролизаты на основе молочного и других видов сырья.
По данным исследований структуры пищевой продукции, полученной с использованием ГММ или МГМА, на мировом продовольственном рынке, ГММ применяются в основном при производстве технологических вспомогательных средств и пищевых добавок, представляющих собой, в первую очередь, ферментные препараты. Основной областью применения ферментных препаратов является производство спирта, пива, напитков, хлебопекарных изделий. В сыроделии широко применяются молокосвертывающие ферменты микробного происхождения. Так доля ферментных препаратов в общей структуре пищевой продукции составляет 31,4%. Доля пищевых добавок и микронутриентов в общей структуре составляет 15,3%. При этом необходимо отметить, что 97,7% ферментных препаратов производятся зарубежными биотехнологическими компаниями, мировыми лидерами производства данной категории продукции. Соотношение основных групп пищевой продукции, полученной с использованием промышленных штаммов представлено в таблице
Исходя из того, что преимущественной областью использования ГММ является производство ферментных препаратов и пищевых ингредиентов сравнительный анализ структуры и объемов производства ГММ на мировом провольственном рынке целесообразно проводить по рейтингам производства и продаж данной категории продукции ведущими иностранными компаниями.
При разработке системы гигиенического контроля за оборотом ГММ важным является формирование четких представлений о величине и структуре пищевой продукции, полученной с использованием пищевых микроорганизмов. " Значение биотехнологий видно при сравнительном анализе объемов продаж ферментных препаратов. Так, по данным Ассоциации производителей и разработчиков ферментных продуктов (Amfep) за 2009 год мировой объем продаж составил 440 млн. евро, в том числе ферментов, произведенных с применением традиционных (классических) штаммов-продуцентов - 180 млн. евро (41% от общего объема продаж), гомологичных ГММ 1-2 классов безопасности - 132 млн. евро (30% от общего объема продаж). Объем продаж ферментов из гетерологичных ГММ 3 класса безопасности составил 128 млн. евро (29% от общего объема продаж на мировом продовольственном рынке), что представлено на диаграмме
При разработке системы гигиенического контроля за оборотом ГММ важными показателями являются рейтинги и соотношения объемов продаж различных видов пищевой продукции.
На диаграммах представлены данные о доле ГММ, применяемых при производстве хлебопекарных изделий (сдобы - иностр.), молочной продукции и напитков. По данным рейтингов продаж основных зарубежных компаний, являющихся основными производителями ГММ, трансгенные микроорганизмы делятся на две основные группы - ферментные препарата полученные из гомологичных ГММ (I и 2 классы безопасности) и гетерологичных ГММ (3 класс безопасности).
Данная пищевая продукция является основной областью применения как традиционных (классических) так и трансгенных микроорганизмов.
О преимущественном использовании ГММ при микробиальном синтезе ферментов для производства хлебопекарных изделий свидетельствуют данные диаграммы
Объем продаж ферментных препаратов для производства хлебопекарных изделий за 2009 год составил около 100 млн. евро.
Анализ продаж хлебопекарных изделий показывает, что традиционные пищевые микроорганизмы в качестве продуцентов ферментов применяются только в 40 % (39 млн. евро), а гомологичные и гетерологичные ГММ 22% (22 млн. евро) и 38% (38 млн.евро) соответственно, что свидетельствует о значительной доле пищевых ГММ в этом секторе производства продовольствия.
Объем и структура продаж ферментных препаратов для производства молочной продукции за 2009 год представлен на диаграмме и составил около 136 млн. евро. Анализ продаж показывает, что в основном в этом секторе в качестве продуцентов ферментов применяются традиционные пищевые микроорганизмы - 104 млн. евро (76 % продаж), а доля продукции из гетерологичных ГММ составляет 32 млн. евро (24% продаж) от общего числа продаж соответственно. Молокосвертывающие ферменты на основе ГММ применяются в данной области в основном для сквашивания молока и производства сыров, что свидетельствует о значительной доле пищевых ГММ в этом секторе производства продовольствия.
Разработка скрининговых методов и средств лабораторного контроля ГММ в пищевых продуктах
Результаты по обнаружению потенциально опасных для здоровья потребителей ГММ в ряде ферментных препаратов, полученные в ходе лабораторных исследований репрезентативной выборки пищевых продуктов, свидетельствуют о возможности нелегитимного использования трансгенных технологий и подтверждают необходимость лабораторного контроля за ГММ после допуска продукции на рынок продовольствия.
Анализ наиболее распространенных ГМ-штаммов и обобщение опыта проведения молекулярно-генетического и микробиологического анализа пищевых продуктов на наличие ГММ в ИЛЦ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи позволили обосновать и разработать скрининговые методы детекции ГММ, направленные на выявление наиболее типичных маркерных и селективных генов, используемых в генетических конструкциях по технологии рекомбинантных ДНК в различных группах микроорганизмов (бактерии и грибы), используемых в пищевой промышленности.
Для применения в лабораториях учреждений Роспотребнадзора, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор и контроль, были разработаны методы определения ГММ в пищевой продукции, полученной из/или с использованием микроорганизмов. Методы основаны на постановке ГЩР в реальном времени или ПЦР с детекцией результатов методом электрофореза.
С целью обеспечения единого методического подхода для определения ГММ при мониторинге пищевой продукции применение этих методов нормировано и утверждено Главным государственным санитарным врачом в Методических указаниях МУК 4.2.2305-07.
Требования, которые учитывались при разработке методов детекции ГММ, включали доступность оборудования и материалов, типовая оснащенность ПЦР-лаборатории, уровень подготовки врача-микробиолога (вирусолога) Центра гигиены и эпидемиологии. Методы выделения ДНК из образцов пищевой продукции, проведение амплификации с детекцией продуктов ПЦР с помощью электрофореза или в режиме реального времени с использованием специального оборудования, документирования и анализа результатов, являются обязательными при проведении как качественных, так и количественных исследований ГММ и их традиционных аналогов. Соблюдение данных требований необходимо для исключения ложноположительных результатов.
Для разных видов пищевых продуктов были подобраны специальные методы пробоподготовки и экстракции ДНК.
Для выявления генетических модификаций у микроорганизмов бактериальной природы был выбран и скомпонован в виде тест-систем ряд праймеров для анализа маркерных генов, наиболее часто употребляющихся при конструировании ГММ. Поскольку эти маркерные гены происходят из не пищевых микроорганизмов, то обнаружение таких последовательностей в штаммах, используемых при производстве пищевых продуктов, может свидетельствовать о произведенных генетических модификациях. В систему входят праймеры, фланкирующие следующие последовательности: "
1. гена егтС, кодирующего устойчивость к эритромицину у плазмиды рЕ194 Staphylococcus aureus (размер фрагмента 349 п.н.);
2. гена tetO, кодирующего устойчивость к тетрациклину хромосомы Streptococcus pneumoniae, (размер фрагмента 242 п.н.);
3. гена amp, кодирующего устойчивость к ампициллину плазмиды pBR322, (размер фрагмента 321 п.н.);
4. гена lacZ, кодирующего фермент р-галактозидазу хромосомы Esherichia coli, (размер фрагмента 158 п.н.).
5. гена ori, кодирующего ориджин репликации, плазмиды р15А Esherichia coli, (размер фрагмента 382 н.п.);
6. гена hph, кодирующего устойчивость к гигромицину, хромосомы Streptomyces hygroscopicus, (размер фрагмента 288 н.п);
7. гена Sh Ые, кодирующего устойчивость к блеомицину, хромосомы Streptomyces verticillus (размер фрагмента 301 н.п.). Лабораторные исследования включают последовательные процессы: подготовка проб, выделение ДНК из образца пищевых продуктов, амплификацию ДНК, детекцию ДНК методом электрофореза, анализ и интерпретацию результатов.
Метод ПНР с электрофоретической детекцией является наиболее доступным и приемлемым для целей лабораторного контроля наличия ГММ при мониторинге пищевых продуктов на пострегистрационном этапе оборота.
Развитие системы идентификации ГММ в пищевой продукции связано с количественным определением специфических последовательностей нуклеиновых кислот. Наиболее перспективным является метод ПНР в реальном времени, основанный на детекции флюоресценции, отражающей накопление ампликонов на каждой стадии амплификации ДНК определенного ГММ в пище.
Молекулярно-генетический анализ пищевой продукции на наличие ГММ методом ПЦР в реальном времени проводится с использованием амплификаторов с оптической приставкой типа Rotor Gene - 3000, ABI Prism 7000, iCycler IQ или отечественные аналоги производства «Синтол», «ДНК-технология».
Исследования проводят с использованием модифицированного комплекта реагентов для амплификации ДНК. Модификация заключается в использовании в реакционной смеси не только праймеров, но и флуоресцентно-меченых зондов "Taqman", а также использование контрольной ДНК в нескольких десятикратных разведениях известной концентрации.
Флуоресцентно-меченые зонды представляют собой олигонуклеотиды, комплементарные амплифицируемой последовательности-мишени, содержащие на 5 -конце флуорофор - донорфлуоресцентного излучения, а на 3 - конце - его акцептор (гаситель).
Нарастание флуоресцентного свечения наблюдают после физического разобщения флуорофора и гасителя. Разобщение флуорофора и гасителя происходит при гибридизации с амплифицируемым фрагментом ДНК за счет 5 -экзонуклеазной активности Taq-полимеразы, разрушающей зонд после его гибридизации с амплифицируемой последовательностью. Рост регистрирумого флуоресцентного свечения происходит пропорционально нарастанию числа ампликонов, что позволяет при наличии соответствующего оборудования следить за кинетикой накопления продуктов амплификации в реальном времени (real time - PCR). Сравнение кинетики флуоресценции ДНК-стандартов (несколько 10-кратных разведений контрольной ДНК известной концентрации) и исследуемого образца позволяет определить относительную концентрацию ДНК в образце в диапазоне разведений контрольных препаратов. Регистрация результатов этим методом исключает необходимость открывания пробирки после окончания амплификации и, следовательно, значительно снижает вероятность возникновения контаминации.
Метод ПЦР в реальном времени является информативным и одновременно более сложным и требует специального оборудования и навыков работы с генетическим материалом.
Метод ПЦР с электрофоретической детекцией более подходит для скрининговых исследований пищевых продуктов на наличие ГММ. Анализ наиболее типичных ГММ, применяемых в производстве пищевых продуктов, позволили оптимизировать число праймеров для разработки тест-системы для лабораторного контроля ГММ в обороте.
Для реализации целей контроля в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН был разработан набор реагентов ГМ-БАКТ-1 (ТУ 9398-001-01897357-2008) для выявления ГММ в пищевых продуктах, который позволяет производить детекцию ГММ подготовленному врачу-микробиологу (вирусологу) в условиях ГЩР-лаборатории.
