Разработка системы морфометрического анализа для скрининга эффектов нестабильности генома в гигиенических исследованиях : на примере наноматериалов Мошков, Николай Евгеньевич

Введение к работе

Актуальность проблемы. В настоящее время сферы применения наноматериалов (НМ) расширяются очень быстрыми темпами, но растет и количество публикаций, доказывающих, что наночастицы (НЧ) обладают более высокой токсичностью, чем микроформы тех же веществ (Maynard A.D. et al, 2006; Elder A., et al, 2007). Кроме того, у НЧ и НМ обнаружена способность индуцировать эффекты нестабильности генома (комплекс изменений, происходящих при трансформации стабильного генома нормальной клетки в нестабильный, характерный для клеток опухоли (Smith M. et al, 2003). Так, например, показана индукция повреждений ДНК при воздействии НЧ TiO₂ на культуру фибробластов человека (Rahman Q., 2002), НЧ Al₂O₃ и TiO₂ - на эпителиальные клетки мыши (Barillet S., 2010; Weisheng L., 2008), НЧ Fe₃O₄, TiO₂ и Al - на клетки печени крыс (Hussain S. M., 2005). Обнаружены цитотоксические эффекты действия НЧ Fe₂O₃ на нейроны крыс (Pisanic I.I., 2007), НЧ аморфного кварца - на макрофаги крыс (Waters K.M., 2009), НЧ гидроксидов некоторых металлов - на опухолевые эпителиальные клетки языка человека А549 (Choi S.J., 2009) и пр. Однако биологическая активность НМ определяется не только их химическим составом, но структурой вещества, размером и формой частиц, особенностями покрытия и пр. (Онищенко Г.И., Рахманин Ю.А. и др, 2007), что требует оценки безопасности каждого НМ.

Для многопараметровой оценки эффектов нестабильности генома in vitro наиболее адаптирован микроядерный тест на клетках крови человека, культивируемых в условиях цитокинетического блока (Fenech M., 1985; Yager J. W. et al, 1988; Pascoe S. A. et al, 1990; Fenech M. et al, 2003), поскольку расширенный протокол цитогенетического анализа в этом тесте (Ингель Ф.И., 2006) позволяет определить практически весь комплекс показателей нестабильности генома (генетические повреждения, анеуплоидию, изменения пролиферации клеток и частоты апоптоза) в одной постановке и на одном цитогенетическом препарате. Однако один из основных прогностических показателей риска развития опухоли - анеуплоидия (Тимошевский В.А., Назаренко С.А., 2006), возникающая в результате асимметричного распределения генетического материала между ядрами дочерних клеток, в классическом варианте этого теста не определяется, а расширенный протокол позволяет ее оценить только в клетках, прошедших в условиях цитокинетического блока более одного цикла деления. В прочих современных исследованиях оценка неспецифической анеуплоидии проводится, в основном, путем fish- окрашивания, что связано с использованием дорогих реактивов, приборов и программного обеспечения. Кроме того, все современные исследования эффектов нестабильности генома довольно продолжительны (Santos S.J., 1997; Yurov Y. B., 2007; Пикалова Л.В., 2007; Comet assay interest group, 2011), а число новых веществ, нуждающихся в оценке безопасности, постоянно растет. Например, количество наноматериалов, в принципе, может увеличиваться до бесконечности, а экстраполяция биологических эффектов одних наноматериалов на другие невозможна (Luther W., 2004; Tran C. L., 2005; The Royal Society & The Royal Academy of Engineering, 2004; Онищенко Г.И., Рахманин Ю.А. и др, 2007). Поэтому существует острая необходимость разработки экспериментального подхода для скрининга эффектов, указывающих на возможность индукции нестабильности генома клетки вообще и асимметрии распределения генетического материала при делении клетки - в частности. Известно, что размеры ядер клеток с различным содержанием ДНК могут значимо различаться, причем наибольшие различия наблюдаются между гипо- и гипердиплоидными ядрами (Cavalier-Smith T., 2005; Pellman D., 2007; Agerholm I.E., 2008; Webster M., 2009). Т.е. можно предположить, что сравнение размеров двух дочерних ядер, произошедших от одного материнского, может выявить неравновесное распределение ДНК между ними. Кроме того, изменение размеров клеточных ядер наблюдается при изменении структуры и степени компактизации хроматина (He Yin-Cheng, 2003; Wolfe P., 2004), а также - пролиферативной активности клеток (Collins P. C., 1999; Derenzini M., 2000; Roca-Cusachs P., 2008). На этом основании можно предположить, что изменение размеров клеточных ядер по сравнению с контролем может свидетельствовать об индукции как эффектов нестабильности генома, и, следовательно, повышении риска опухолевой трансформации клеток, так и об изменении структуры и степени компактизации хроматина. Давно использующийся в цитологии морфометрический анализ, предметом которого является измерение размеров клетки и ее компонентов, до сих пор применяется только для одноядерных клеток, что не позволяет сопоставлять размеры ядер, произошедших из одной материнской клетки и, тем самым, определять степень асимметрии распределения генетического материала. В то же время, блок цитотомии, используемый в микроядерном тесте in vitro, создает условия для образования двуядерных клеток и, следовательно, позволяет сравнивать размеры ядер, образовавшихся в результате деления одного материнского ядра, причем только того, которое разделилось после введения изучаемого вещества.

Цель исследования: на примере эффектов, индуцированных наноматериалами на лимфоцитах крови человека, культивируемых в условиях блока цитотомии, разработать метод морфометрического анализа площадей клеточных ядер в двуядерных клетках, пригодный для скрининга нестабильности генома.

Задачи исследования

1. Создать математическое описание и методическую базу для анализа симметрии площадей ядер в двуядерных клетках, образовавшихся при культивировании клеток крови человека в условиях цитокинетического блока.

2. Проанализировать изменения симметрии площадей ядер двуядерных клеток в культурах лимфоцитов крови человека, экспонированных стандартным мутагеном, а также нано- и микроформами ряда материалов, предполагаемых к применению в различных областях техники, в частности, при водоподготовке.

3. Провести сравнительный анализ цитогенетических эффектов, индуцированных теми же веществами, с использованием расширенного протокола микроядерного теста, и сравнить полученные результаты с данными морфометрического анализа.

4. На основании полученных данных обосновать алгоритм и критерии использования морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках для экспресс-прогноза эффектов нестабильности генома на клетках крови человека, культивированных в условиях блока цитотомии.

Научная новизна

4. 1. Предложен новый подход к морфометрическому анализу, основанный на сравнении площадей ядер в двуядерных клетках, образовавшихся из одной материнской при культивировании лимфоцитов крови человека в условиях цитокинетического блока; созданы его математическое обоснование и методическая база.

   2. Разработана система морфометрических показателей, которые могут быть использованы для скрининга эффектов нестабильности генома человека, индуцированных действием НМ, применимая также для анализа эффектов химических соединений и других видов воздействий.

   3. Впервые показано, что при экспозиции лимфоцитов крови человека в условиях цитокинетического блока НЧ магнетита в оболочке из силиката, микро- и НЧ диоксида титана, нановолокнами (НВ) и микродисперсией (УД) гидроксида алюминия, а также ^метил-Ы-нитро- N-нитрозогуанидином, дающим истинный раствор, и микрочастицами латекса, наблюдаются:

      1. дозозависимое повышение частоты клеток с микроядрами (МЯ) и нуклеоплазменными мостами (НПМ), причем для НМ - преимущественно среди клеток, прошедших 2й митотический цикл за время культивирования, а также повышение частоты апоптоза и укорочении клеточного цикла у значительного числа клеток, способных к делению;

      2. в клетках, прошедших 2й митотический цикл - дозозависимое повышение доли асимметричных 3-ядерных клеток;

      3. дозозависимые изменения площадей ядер и степени их симметрии в двуядерных клетках, прошедших 1 митотический цикл.

      Выявлены повторяющиеся высокоуровневые корреляции между морфометрическими индексами, определенными по соотношению и сумме площадей ядер в двуядерных клетках, и рядом цитогенетических показателей, характеризующих нестабильность генома в клетках, прошедших второй митоз, что доказывает релевантность разработанного подхода для выявления и прогноза эффектов нестабильности генома, включая анеуплоидию.

      Показано, что увеличение степени асимметрии площадей ядер в двуядерных клетках ассоциировано с повышением частоты генетических повреждений в клетках, прошедших второй митоз, а увеличение суммарной площади ядер - с ускорением пролиферации клеток в культуре.

      Практическая значимость

      Для решения задач генетико-токсикологического скрининга разработан простой и быстрый способ отбора соединений, нуждающихся в углубленном изучении эффектов нестабильности генома, что позволяет в несколько раз сократить продолжительность рабочего времени на анализ по сравнению с цитогенетическим исследованием.

      Создана минимальная система морфометрических индексов, которые могут быть использованы для скрининга эффектов нестабильности генома человека, индуцированных действием генотоксикантов, включая НМ.

      Разработанный математический аппарат и созданная методика анализа делают метод пригодным для автоматизации.

      Получен патент РФ №2467329 «Способ экспресс-оценки степени потенциальной генотоксической активности веществ и факторов среды по наличию анеуплодии в лимфоцитах периферической крови человека, образовавшихся в результате культивирования в условиях цитокинетического блока», Патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Приоритет изобретения: 03 марта 2011г., Зарегистрировано в Гос.реестре (публикация) 20 ноября 2012г. Срок действия - до 03 марта 2031г.

      Получена справка о внедрении результатов в научно практическую деятельность по изучению канцерогенной активности, подписанная заместителем председателя комисси

      по канцерогенным факторам при Роспотребнадзоре РФ профессором Пылевым Л.Н.

      6. Личный вклад автора заключается в участии в работе на всех этапах ее проведения: выборе цели и постановке задач, планировании экспериментов и их проведении, разработке математического описания и методики морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках, проведении цитогенетического анализа в микроядерном тесте с использованием расширенного протокола и морфометрического анализа эффектов стандартного мутагена МННГ и микрочастиц латекса, а также НЧ магнетита в оболочке из силиката, микро- и НЧ диоксида титана, НВ и УД гидроксида алюминия, разработке подходов к статистическому анализ и - по разработанной методике - статистической обработке комплекса морфометрических индексов и данных цитогенетического анализа эффектов нестабильности генома, обосновании выбора критериев и разработке алгоритма морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках. Часть исследований проведена совместно с сотрудниками лаборатории генетического мониторинга ФГБУ «НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина» Минздрава России. Положения выносимые на защиту:

      Математический аппарат метода морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках, который базируется на близости формы ядра ФГА- стимулированного лимфоцита к эллипсоиду (8 < 9%) и наличии прямой слабостепенной зависимости между площадью и объемом ядра.

      Стандартный мутаген МННГ, а также НВ и УД гидроксида алюминия, микрочастицы латекса, НЧ и микрочастицы диоксида титана и НЧ магнетита в оболочке из силиката индуцируют в лимфоцитах крови человека, культивируемых в условиях блока цитокинеза, повышение уровней нестабильности генома, причем различия в индукции генотоксических эффектов нано- и микродисперсных материалов наблюдаются преимущественно в клетках, прошедших 2 и более митотических цикла. Некоторые различия в эффектах одних и тех же материалов на клетках разных доноров обусловлены, преимущественно, разницей в индивидуальных особенностях пролиферативной активности клеток каждого донора в культуре.

      Для всех изученных соединений обнаружены повторяющиеся значимые корреляции:

      между частотами генетических повреждений в клетках, прошедших второй митоз, и отношением площадей ядер в двуядерных клетках;

      между показателями пролиферативной активности лимфоцитов в культуре и суммарной площадью ядер в двуядерных клетках.

      Алгоритм морфометрического анализа в двуядерных клетках, основанный на оценке изменений средних значений соотношения (S1/S2) и суммы (S1+S2) площадей ядер, эффективен для скрининга эффектов нестабильности генома.

      Работа выполнена в лаборатории генетического мониторинга ФГБУ НИИ ЭЧиГОС им А.Н.Сысина МЗ РФ в рамках следующих Государственных тем: «Исследование закономерностей регулируемой структурно-энергетической саморганизации

      фазоассоциированной воды для формирования питьевых вод с направленным биологическим действием», «Разработка и внедрение в практику профилактической токсикологии методов испытаний химических веществ по их влиянию на здоровье человека, гармонизированные с рекомендациями ОЭСР», «Эпидемиологическое обоснование модели оценки вклада факторов среды обитания в формирование экологически зависимых заболеваний и их причинной обусловленности».

      Апробация диссертации проведена 06 июля 2012 г на совместном заседании межотдельческой комиссии по апробации докторских и кандидатских диссертаций ФГБУ «НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина» Минздравсоцразвития России (протокол №12 от 12.07.2012). Материалы диссертации доложены на: I Международном форуме по нанотехнологиям «Rusnanotech 08» (Москва, 3-5 декабря 2008); V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, (Москва, 21-27 июня 2009); VI Съезда Российского общества медицинских генетиков (Ростов- на-Дону, 14-18 мая 2010); III Международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий «Rusnanotech 2010» (Москва, 1-3 ноября 2010); пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды «Актуализированные проблемы здоровья человека и среды обитания и пути их решения» (14-15 декабря 2011); IV Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 22-25 сентября 2011), IV Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье. Молодые ученые за устойчивое развитие страны в глобальном мире» (Москва, 27-28 сентября 2012), а также Conference of International Society for Environmental Epidemiology (ISEE 2009), "Environmental, Food and Global Health" (Ирландия, Дублин, 25-29 августа 2009) и 42 Annual Meeting of European Environmental Mutagenic Society (EEMS) (Польша, Варшава, 16-21 сентября 2012).

      Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

      Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, описания результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Текст изложен на 113 страницах машинописи, включая приложения, иллюстрирован 56 таблицами и 34 рисунками. Указатель литературы содержит 106 источников.

      Похожие диссертации на Разработка системы морфометрического анализа для скрининга эффектов нестабильности генома в гигиенических исследованиях : на примере наноматериалов

      

      Новые бактериальные патогены в пищевых продуктах: экспериментальное обоснование и разработка системы контроля с применением методов микробиологического и молекулярно-генетического анализаЕфимочкина, Наталья Рамазановна

      

      Совершенствование методики оценки иммунного статуса в гигиенических исследованиях на примере организованного детского населения МосквыМаковецкая Анна Кирилловна

      

      Система информационного обеспечения гигиенических исследованийЛалова Наталья Федоровна

      

      Исследование объективных и субъективных предпосылок для обеспечения радиационной безопасности населения региона (на примере Рязанской обл.)Кучумов Владимир Владимирович

      Эколого-гигиеническая оценка радиационной обстановки и разработка комплекса мер по ограничению облучения населения субъекта Российской Федерации : на примере Мурманской областиЧернев Андрей Васильевич

      Гигиеническая оценка условий труда и разработка медико-профилактических мероприятий для сохранения здоровья работников пищевой промышленности (на примере кондитерской фабрики)Ситдиков Рустам Зиннятуллович

      

      Разработка научных основ системного анализа и прогнозирования воздействия факторов окружающей среды на интегральные демографические показателиКорчевский Андрей Александрович

      

      Научное обоснование и разработка системы оценки мутагенного эффекта химических загрязнений окружающей среды у млекопитающих in vivo с учетом органной специфичностиСычёва Людмила Петровна

      

      Гигиеническое обоснование и разработка системы реабилитации детского населения в условиях хронического воздействия химических факторов малой интенсивностиНемцева Анастасия Анатольевна

      

      Разработка системы оперативного регулирования качества атмосферного воздуха на территориях Московской областиМишина, Анна Леонидовна