Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
2.1. Новые источники пищи: проблемы и перспективы 14
Продукты микробиологического синтеза
Гидробионты
Генетически модифицированные растения
2.2. Методические подходы к оценке качества и 28
безопасности новых и генетически модифицированных
источников пищи
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 44
Обоснование цели и выбора методов исследования 44
Материалы и методы исследования 49
Исследуемые материалы, экспериментальные 49 животные, условия эксперимента
Характеристика и способы подготовки 54 реагентов
Методы исследования, характеристики 57 приборов:
тонкослойная хроматография
колоночная хроматография
газожидкостная хроматография
хромато-масспектрометрия
УФ- и спектрофотометрия
полимеразная цепная реакция
3.2.4. Метрологическая оценка методов 61
3.3 Результаты собственных исследований 62
Разработка методов анализа ароматических 62 углеводородов
Изучение содержания ароматических 80 углеводородов в новых видах кормового белка, полученного с использованием микробиологического синтеза
Изучение содержания ароматических 85 углеводородов в тканях с/х животных, получавших в составе корма бактериальные биомассы
Изучение содержания ароматических 91 углеводородов в гидробионтах
Разработка метода анализа специфических 96 (бактериальных) жирных кислот
Изучение содержания специфических 112 (бактериальных) жирных кислот в новых видах кормового белка, полученного с использованием микробиологического синтеза («меприн», «гаприн»)
Изучение содержания специфических 122 (бактериальных) жирных кислот в органах и тканях лабораторных и с/х животных, получавших в составе корма бактериальные биомассы («меприн», «гаприн»)
Разработка методических подходов к 136 гигиенической оценке пищевой продукции из генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения
Изучение содержания ГМО растительного 163 происхождения в пищевых продуктах, произведенных с использованием растительного сырья, имеющего генетически модифицированные аналоги
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 171
ВЫВОДЫ 183
ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ 185
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БВК - белково-витаминный концентрат
БА - бициклические ароматические углеводороды
ГЖХ - газовая хроматография
ГЖХ-МС - газо-хромато-масс-спектрометрия
ГМ - генетически модифицированные
ГМО - генно-инженерно-модифицированные организмы
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ЖК - жирные кислоты
КХ - колоночная хроматография
МА - моноциклические ароматические углеводороды
МЭЖХ - метиловые эфиры жирных кислот
ПАУ - полициклические ароматические углеводороды
ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты
ПНУ - парафиновые нормальные углеводороды
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ТА - трициклические ароматические углеводороды
ТСХ - тонкослойная хроматография
УФ - ультрафиолетовая спектрофотометрия
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время одной из глобальных задач является решение проблемы увеличения продовольственных ресурсов, актуальной не только для развивающихся, но и для развитых стран, включая Россию.
В долгосрочной стратегии по обеспечению продовольственной безопасности Российской Федерации приоритетное место занимает устойчивое развитие сельского хозяйства и других отраслей агропромышленного комплекса, что нашло отражение в «Концепции государственной политики в области здорового питания населения Российской Федерации на период до 2005 п> принятой Постановлением Правительства Российской Федерации от 10 августа 1998 г. №917.
Центральная роль в покрытии мирового дефицита пищи отводится
интенсификации сельскохозяйственного производства путем
совершенствования методов селекции и внедрения новых технологий. Для создания высокопродуктивных и сбалансированных агросистем, обеспечивающих значительное повышение урожайности сельскохозяйственных культур и продуктивности животных требуются качественно новые подходы. Одним из перспективных решений этой задачи является использование биотехнологий и поиск новых нетрадиционных источников пищи.
Современная биотехнология позволяет во многих отраслях промышленности заменить традиционные методы получения пищевых продуктов биотехнологическими процессам, такими как выращивание дрожжей и бактерий с целью получения аминокислот, витаминов, ферментов и белка одноклеточных [90, 91, 81, 41]. Выход на новый уровень эффективности с/х производства путем коммерциализации достижений биотехнологии позволяет
6 улучшить качество продовольствия, обеспечить нужный темп прироста урожайности при минимальном ущербе окружающей среде [92,47].
Общая площадь возделывания биотехнологических с/х культур в мире постоянно увеличивается, что приносит заметные социальные и экономические преимущества для потребителей и общества в целом, обеспечивает более устойчивое развитие окружающей среды и улучшение здоровья граждан [147]. В настоящее время более 900 линий ГМ растений, относящихся более чем к 50 видам [145-147], созданы и доведены до испытаний в полевых условия, при этом более 100 линий ГМ растений допущено к промышленному производству [163]. В Российской Федерации 15 линий ГМ культур разрешены для использования в питании.
Значительный материал, накопленный, как отечественными, так и зарубежными исследователями, подтверждает перспективность методов микробиологического синтеза в решении задачи увеличения общих белковых ресурсов за счет производства белка одноклеточных на нетрадиционных субстратах: углеводороды нефти и продукты их переработки, этиловый и метиловый спирт, природный газ и др., путем выращивания на них различных видов дрожжей и бактерий, что способствует созданию кормовой базы для развития традиционного животноводства [63,103, 89].
Задача обогащения рациона человека может быть решена также путем дальнейшего рационального и эффективного освоения разнообразных биологических ресурсов Мирового океана [50]. Медицинские аспекты проблемы изыскания и использования новых пищевых ресурсов связаны как с оценкой их пищевой и кормовой ценности, так и с гарантиями безопасности нетрадиционных источников пищи [72, 54]. В связи с этим, наряду с использованием общепринятых химических, токсикологических и других гигиенических исследований, большое внимание уделяется оценке безопасности пищевой продукции, полученной с использованием новых технологий или из нетрадиционных источников.
Потенциальная опасность при создании новых видов кормового белка микробиологического происхождения, заключается в возможности накопления в составе биомасс компонентов субстрата, в частности, необычных (бактериальных) жирных кислот и ароматических углеводородов нефти [1,4]. Жирные кислоты бактериальных биомасс, полученных на основе микробных продуцентов, отличаются постоянством структуры и не метаболизируют в организме человека. Ароматические углеводороды относятся к приоритетным загрязнителям, как в списке всемирной организации здравоохранения [12], так и в Российской Федерации [13]. Глобальное загрязнение водных акваторий и суши химическими поллютантами приводит к накоплению в объектах окружающей среды и биосредах, в том числе гидробионтах, техногенных загрязнителей (токсичные элементы, пестициды, ароматические углеводороды) [45, 70, 71]. Систематическое потребление контаминированных продуктов ослабляет защитные возможности организма человека, снижая антитоксическую функцию печени, почек, легких, кожи, провоцируя образование канцерогенов и коканцерогенов в организме [54, 55, 71].
Создание новых видов рекомбинантных генов, ранее отсутствовавших в природе, бесконтрольное применение генно-инженерных технологий при создании новой пищи, может привести к выходу на рынок пищевой продукции, представляющей опасность для здоровья человека, что обуславливает необходимость оценки безопасности и разработки методов контроля за данной продукцией, в том числе, и при случайном или преднамеренном выпуске в окружающую среду новых видов генно-инженерно-модифицированных растений [90,91, 81].
При гигенической оценке реальных последствий воздействия нетрадиционных источников пищи на здоровье человека принципиально важен поиск и обоснование гигиенически значимых показателей этой оценки. Развитие современных гигиенических проблем не может быть полным без научно-методического и критериального обеспечения медико-биологического мониторинга с учетом установленных приоритетных загрязнителей и
маркерных веществ в объектах среды и организме, формирования интегральных оценок, основанных на показателях риска поступления вредных веществ в организм человека в условиях комплексной техногенной нагрузки. В связи с этим, особую актуальность приобретает разработка и совершенствование методических подходов к контролю за новыми технологическими процессами производства и к оценке качества вновь вовлекаемых в сферу использования человеком новых биологических объектов и веществ для минимизации неблагоприятного воздействия на здоровье человека.
Цель исследования
Целью исследований явилась разработка методических подходов к оценке безопасности пищевой продукции, полученной с использованием новых технологий или не являющейся традиционным источником пищи.
Задачи исследования
1. Определить основные гигиенически значимые показатели безопасности
пищевой продукции, полученной с использованием новых технологий или не
являющейся традиционным источником пищи.
Разработать метод идентификации и количественного определения ароматических углеводородов в биологических объектах. Изучить характер аккумулирования остаточных нефтяных углеводородов в тканях лабораторных и с/х животных, получавших в составе корма дрожжи, выращенные на нефтяном субстрате, а также в тканях гидробионтов.
Разработать метод идентификации специфических (бактериальных) жирных кислот в биологических объектах. Изучить характер аккумулирования специфических (бактериальных) жирных кислот в тканях лабораторных и с/х животных, получавших в составе корма бактериальные биомассы.
4. Разработать методические подходы к гигиенической оценке пищевой продукции из генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения. Изучить возможность использования в качестве маркеров генетической модификации регуляторные последовательности, целевые гены и трансформационные события. Изучить возможность использования разработанных методических подходов для определения ГМО растительного происхождения в пищевой продукции, имеющей генно-инженерно-модифицированные аналоги (в т.ч., со сложным ингредиентным составом, подвергнутой глубокой технологической обработке).
Научная новизна работы
Разработан метод количественного определения углеводородов в биологических объектах с помощью хромато-масс-спектрометрии и УФ-спектрофотометрии.
Впервые с использованием разработанного метода изучен групповой, гомологический и индивидуальный состав ароматических углеводородов дрожжей, выращенных на нефтяном субстрате.
Впервые проведен детальный анализ углеводородного состава тканей лабораторных и с/х животных, получавших дрожжи «паприн» в составе корма.
Показано, что использование в качестве кормовой добавки «паприна» приводит к аккумулированию в жировой ткани и печени животных ароматических углеводородов, характерных для нефтяного субстрата дрожжей.
Установлена идентичность группового и гомологического состава фракции ароматических углеводородов гидробионтов и нефтепродуктов, загрязняющих акватории.
Разработан метод определения состава жирных кислот в микроорганизмах.
Впервые с использованием разработанного метода изучен состав фракции жирных кислот бактериальных биомасс.
Впервые проведен детальный анализ жирнокислотного состава тканей лабораторных и с/х животных, получавших в составе корма бактериальные биомассы.
Показано, что использование в качестве кормовой добавки бактериальных биомасс приводит к аккумулированию в жировой ткани и печени животных специфических (бактериальных) жирных кислот.
Стандартизованы и унифицированы методы индикации, идентификации и количественного определения рекомбинантной ДНК в продовольственном сырье и в пищевых продуктах (в т.ч. многокомпонентных и подвергнутых глубокой термической или технологической обработке), основанные на использовании метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) и позволяющие выполнять контроль за пищевой продукцией, произведенной из сырья растительного происхождения, имеющего ГМ аналоги.
Для мониторинга за ГМО растительного происхождения в продовольственном сырье и пищевой продукции применен метод идентификации рекомбинантной ДНК с использованием праймеров на регуляторные последовательности, маркерные и целевые гены, трансформационные события.
Унифицированы и стандартизованы методы идентификации трансформационных событий, прошедших регистрацию в РФ, в пищевых продуктах, произведенных из ГМО растительного происхождения, позволяющие осуществлять пострегистрационный контроль.
Практическая значимость работы
В практику здравоохранения внедрены высокочувствительные инструментальные методы анализа пищевых продуктов (Авторское свидетельство № 1337764, 06.08.1984 г. Способ количественного определения углеводородов в биологических объектах; Авторское свидетельство №232606, 03.02.1986г. Способ определения состава жирных кислот в микроорганизмах;
II
Методические указания по выделению, идентификации и количественному
определению насыщенных и моно-, би- и три-, ряда полициклических
ароматических углеводородов в пищевых продуктах № 4721-88 МЗ СССР;
ГОСТ Р 52173-2003 «Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации
генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного
происхождения»; Методические указания МУК 4.2.1902-04 «Определение
генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного
происхождения методом полимеразной цепной реакции»; Методические
указания МУК 4.2.1913-04 «Методы количественного определения
генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного
происхождения в продуктах питания»).
На кафедре гигиены питания и токсикологии Медико-профилактического факультета послевузовского профессионального образования Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова диссертантом проведена подготовка специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека из всех регионов Российской Федерации и административных округов г. Москвы по теме «Генетически модифицированные источники пищи (ГМИ): методы лабораторного контроля».
Основные положения, выносимые на защиту
Разработан метод количественного определения насыщенных, моно-, би-, три-, и ряда полициклических ароматических углеводородов в пищевых продуктах, позволяющий определять групповой, гомологический и индивидуальный состав ароматических углеводородов, являющихся приоритетными загрязнителями, как в списке Всемирной организации здравоохранения [12], так и в Российской Федерации [13]. Показана
зависимость степени аккумулирования ароматических углеводородов в тканях лабораторных животных от количества дрожжевого белка в составе рациона.
Разработан метод определения состава жирных кислот в микроорганизмах, позволяющий идентифицировать специфические жирные кислоты, характерные для бактериальных биомасс, в биоматериале. Показано, что при включении в рацион биомассы «гаприн», в жировой ткани и печени лабораторных животных происходит достоверное накопление изомеров гексадеценовой кислоты (Д10, А11) в отличие от контроля.
Использование унифицированных и стандартизованных методов индикации, идентификации и количественного определения ГМО растительного происхождения в продовольственном сырье и в пищевых продуктах сложного ингредиентного состава (в том числе, подвергнутых глубокой термической или технологической обработке), основанных на детекции рекомбинантной ДНК с использованием метода ПЦР, позволяет выполнять контроль за пищевой продукцией, произведенной из ГМО растительного происхождения.
Апробация работы
Материалы и основные положения доложены и обсуждены на Научной конференции «Теоретические и практические аспекты изучения питания человека» (Москва, 1980); «Окружающая среда и здоровье населения» (Таллинн, 1984); на IV Всесоюзной конференции по масс-спектрометрии (Сумы, 1986); на V Всесоюзной конференции по методам получения и анализа химических реактивов (Юрмала, 1987); на Всесоюзной научной конференции «Совершенствование ветсанитарной экспертизы продуктов животноводства и повышение уровня гигиены производства в перерабатывающей промышленности АПК» (Москва, 1988); на I Всесоюзной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 1989); на Всесоюзном симпозиуме «Белковые продукты микробиологического синтеза: анализ качества, медико-биологическая оценка и эффективность применения в
сельском хозяйстве» (Москва, 1989); на Симпозиуме «Функциональное питание, пищевая безопасность и здоровье людей в условиях мегаполиса.» (Москва, 2003); на 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 48 работ, в том числе 9 статей в журналах, рекомендуемых ВАК РФ, 2 авторских свидетельства, 1- ГОСТ Р, 3 -Методических указания.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов, списка цитируемой литературы. Указатель литературы содержит 103 отечественных и 103 зарубежный источника. Диссертация изложена на 208 страницах машинописного текста, включает 62 таблицы, 43 рисунка.
Автор приносит искреннюю благодарность научным руководителям: доктору медицинских наук, профессору, академику РАМН В.А. Тутельяну, доктору химических наук К.И. Эллеру, а также, к.м.н. Е.Ю. Сорокиной, к.б.н. Л.Ш. Воробьевой, к.х.н. Ф.А. Медведеву, к.х.н. Т.М.Ушаковой за помощь в выполнении работы.
![Гигиеническая оценка птицеводческих комплексов как источников загрязнения атмосферного воздуха пахучими и раздражающими веществами [Электронный ресурс]](/i/i/4277/182567.png "Гигиеническая оценка птицеводческих комплексов как источников загрязнения атмосферного воздуха пахучими и раздражающими веществами [Электронный ресурс] Орлова Анна Владимировна")
