Содержание к диссертации
Введение
Часть I
Обзор литературы
Глава 1. Введение 8
Глава 2. Использование методов концентрирования для устранения ингибиторов от-пцр 11
Глава 3. Использование методов выделения рнк вирусов для устранения ингибиторов от-пцр 17
Глава 4. Сравнение методов культуры клеток и от-пцр для индикации энтеровирусов в пробах воды 21
Глава 5. Использование метода от-пцр, интегрированной с культурой клеток (икк от-пцр) для анализа энтеровирусного
Загрязнения проб воды 24
Глава 6. Возможности использования от-пцр для контроля инфекционных энтеровирусов в пробах воды, прошедшей обработку
Уфо и хлором 27
Материалы и методы 31
Часть ii
Собственные исследования
Глава 1. Использование метода от-пцр, интегрированной с культурой клеток, для индикации рнк цитопатогенных энтеровирусов в пробах воды 41
Глава 2. Отработка метода выделения рнк из концентратов сточных вод и вод поверхностных водоисточников 45
Глава 3. Изучение оптимальных режимов элюции полиовируса для обеспечения высокой эффективности их последующей детекции методом от-пцр 54
3.1. Изучение оптимальных режимов элюции энтеровирусов для обеспечения высокой эффективности их последующей детекции методом от-пцр, используя метод концентрирования на колонках с ионообменной смолой ав 17-8 57
3.2. Изучение оптимальных режимов элюции энтеровирусов для обеспечения высокой эффективности их последующей детекции методом от-пцр, используя метод концентрирования на мембранном фильтре ммк 63
Глава 4. Изучение возможности использования от-пцр для контроля цитопатогенных энтеровирусов в пробах воды, прошедшей обработку дезинфектантами 69
4.1. Изучение возможности использования от-пцр для контроля цитопатогенных энтеровирусов в пробах воды, прошедшей обработку уфо 70
4.2. Изучение возможности использования от-пцр для контроля цитопатогенных энтеровирусов в пробах воды, прошедшей обработку
Уфо, хлором и комбинированную обработку уфо и хлором 72
Глава 5. Апробация методов от-пцр и икк от-пцр на натурных объектах в условиях вспышечной заболеваемости и в межэпидемический период
Глава 6. Разработка схем санитарно-вирусологического контроля воды с использованием методов от-пцр и икк от-пцр 87
Глава 7. Обсуждение результатов исследований 92
Выводы 107
Список литературы
- Использование методов выделения рнк вирусов для устранения ингибиторов от-пцр
- Использование метода от-пцр, интегрированной с культурой клеток (икк от-пцр) для анализа энтеровирусного
- Отработка метода выделения рнк из концентратов сточных вод и вод поверхностных водоисточников
- Изучение оптимальных режимов элюции энтеровирусов для обеспечения высокой эффективности их последующей детекции методом от-пцр, используя метод концентрирования на мембранном фильтре ммк
Введение к работе
Актуальность проблемы
Проблема обеспечения эпидемической безопасности населения России при различных видах водопользования является приоритетной государственной задачей в системе предупредительного санитарно-эпидемиологического надзора (Рахманин Ю.А., 2005, Онищенко Г.Г., 2005). Будучи одним из ведущих факторов в реализации фекально-орального механизма передачи кишечных вирусных инфекций, водный путь передачи в настоящее время является одним из основных в формировании спорадической и вспышечной заболеваемости (Савилов Е.Д., Мамонтова Л.М., 2005, Недачин А.Е., 2005).
Согласно действующим в нашей стране нормативным документам водно-санитарного законодательства, эпидемическая безопасность водных объектов в отношении кишечных вирусных инфекций обеспечивается отсутствием патогенных вирусов в воде.
Отсутствие до настоящего времени мер специфической профилактики в отношении кишечных вирусных инфекций диктует необходимость совершенствования неспецифических мер, ограничивающих циркуляцию вирусов в объектах окружающей среды, важной составляющей которых является контроль за циркуляцией вирусов в окружающей среде.
Для индикации цитопатогенных вирусов, распространяющихся водным путем в практической лабораторной службе используется метод их выделения на чувствительных культурах клеток. Однако данный метод имеет ряд недостатков, снижающих его практическую значимость: длительность процесса (3-4 недели), невозможность выделения нецитолитических и поврежденных вирусных агентов, не способных вызывать продуктивную цитолитическую инфекцию в системе in vitro, но, тем не менее, представляющих эпидемическую опасность для живого организма (Амвросьева Т.В., 2002). Эти проблемы, возникающие при
6 изучении вирусологического качества вод различных водных объектов, могут быть решены путем использования метода детекции РНК энтеровирусов - полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР), который позволяет в течение 12-24 часов обнаружить в исследуемом материале энтеровирусную РНК (Reynolds К.А., 2004).
Целью работы является разработка научно обоснованной схемы санитарно-вирусологического контроля качества воды водных объектов на основе индикации вирусов с помощью метода полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). Основные задачи диссертационной работы:
Разработать оптимальные режимы элюции энтеровирусов с целью обеспечения высокой эффективности их последующей индикации методом ОТ-ПЦР из проб воды;
Разработать эффективный метод выделения РНК энтеровирусов из концентратов проб поверхностных и сточных вод;
Отработать методику ОТ-ПЦР, интегрированной с культурой клеток (ИКК ОТ-ПЦР), для индикации РНК цитопатогенных энтеровирусов в пробах воды;
Провести сравнительную, оценку методов индикации вирусного загрязнения воды при ее обеззараживании с использованием культурального, ОТ-ПЦР, ИКК ОТ-ПЦР и метода выделения колифагов;
Апробировать используемые методы на натурных объектах в условиях вспышечной заболеваемости и в межэпидемический период;
6. Разработать схему санитарно-вирусологического контроля с
использованием метода ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР.
Научная новизна работы. Впервые
- разработан эффективный метод выделения РНК энтеровирусов из концентратов проб поверхностных и сточных вод;
разработана комплексная схема санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды различных водных объектов энтеровирусами с использованием метода ИКК ОТ-ПЦР;
разработана комплексная схема санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды энтеровирусами при ее обеззараживании с использованием метода ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР;
- проведена сравнительная оценка методов индикации вирусного
загрязнения воды при ее обеззараживании с использованием
культурального, ОТ-ПЦР, ИКК ОТ-ПЦР и метода выделения колифагов.
Основные положения, выносимые на защиту
- разработанная схема санитарно-вирусологического контроля с
использованием метода ИКК ОТ-ПЦР для индикации РНК
цитопатогенных энтеровирусов в пробах воды различных водных
объектов;
разработанная схема санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды энтеровирусами при ее обеззараживании с использованием метода ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР;
разработанный метод выделения РНК из концентратов проб поверхностных и сточных вод для эффективного устранения ингибиторов ОТ-ПЦР;
экспериментальное обоснование применения метода ИКК ОТ-ПЦР при санитарно-вирусологическом анализе проб воды, обработанных дезинфектантами.
ЧАСТЫ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.ВВЕДЕНИЕ
Проблема обеспечения населения России доброкачественной питьевой
водой - безопасной в эпидемическом отношении является одной из
актуальных в системе предупредительного санитарно-
эпидемиологического надзора. Это обусловлено общим ухудшением состояния поверхностных водоисточников в результате продолжающегося постоянного воздействия хозяйственно-бытовых сточных вод, поступающих в водоемы без необходимой очистки и обеззараживания и являющихся основным источником вирусного загрязнения водных объектов.
В воде обнаруживают более 100 типов потенциально опасных вирусных агентов [105], однако надежные методы выделения из воды и подтверждения инфекционности разработаны только для цитопатогенных энтеровирусов [17].
Человеческие кишечные вирусы, экскретируемые в фекалиях
инфицированных людей (108-1010 частиц на 1г фекалий), могут прямо или
косвенно контаминировать воду, предназначенную для питья. Группа
кишечных вирусов включает энтеровирусы, ротавирусы, Норфолк и
норфолкоподобные вирусы, аденовирусы, реовирусы и др. Энтеровирусы
(Полиовирусы, Коксаки А и В, и ECHO) могут вызывать разнообразные
болезни: от гастроэнтерита до миокардита и асептического менингита [72].
Описано множество случаев заболеваемости населения, вызванные
потреблением воды, контаминированной этими вирусами [3, 34, 41, 45].
Наиболее полно изученной группой кишечных вирусов в загрязненной
воде являются члены семейства Picornaviridae (рісо-маленьктй, rna-
рибонуклеиновая кислота). Многочисленные исследования
свидетельствуют о присутствии энтеровирусов в водопроводной
[37,110,142,], подземной [38,94], морской [115,124], речной [115], сточных [3,46,103] и вторично очищенных сточных водах [138]. Энтеровирусы в окружающей среде создают опасность для общественного здоровья, так как они передаются фекально-оральным путем через контаминированную воду и даже низкая их численность способна инициировать инфекционный процесс у людей [90].
Отсутствие до настоящего времени мер высокоспецифической
профилактики в отношении кишечных вирусных инфекций диктует
необходимость совершенствования неспецифических мер,
ограничивающих циркуляцию вирусов в объектах окружающей среды. Важнейшей составной частью неспецифических мер профилактики является предупредительный эпидемиологический надзор за состоянием водных объектов, контроль за эффективностью работы очистных сооружений и водопроводных станций по санитарно-вирусологическим показателям.
С введением СанПиН 2.1.4.559-96 "Питьевая вода "(СП1) и СанПин 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод» [32] создана новая нормативная база, впервые предусматривающая необходимость прямого определения вирусов в питьевой воде, поверхностных и сточных водах.
Для контроля воды водных объектов по этим показателям необходимо наличие методического обеспечения, дающего возможность осуществления быстрой и адекватной оценки реального вирусного загрязнения воды.
Для индикации цитопатогенных вирусов, распрострагяющихся водным путем, достаточно широко в практической лабораторной службе используется метод их выделения на чувствительных культурах ткани, заслуженно признанный «золотым стандартом». Однако, при всей своей репрезентативности данный метод имеет ряд недостатков, существенно снижающих его практическую значимость: длительность процесса (3-4
недели), недостаточно высокая эффективность выделения вирусов, невозможность выделения нецитолитических и поврежденных вирусных агентов, не способных вызывать продуктивную цитолитическую инфекцию в системе in vitro, но, тем не менее, представляющих эпидемическую опасность для живого организма [74,121]. Эти проблемы, возникающие при изучении вирусологического качества вод различного вида водопользования, могут быть решены путем использования современных методов молекулярной биологии по детекции генетического материала (РНК) энтеровирусов. К числу таких наиболее широко применяемых сегодня в мировой практике методов относится полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для индикации вирусов, геном которых представлен РНК, используется ПЦР с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). Этап обратной транскрипции представляет собой ферментативную реакцию, с помощью которой выделенная РНК переводится в комплементарную ей ДНК (кДНК). Метод ОТ-ПЦР позволяет быстро (в течение 12-24 часов) обнаружить в исследуемом материале энтеровирусную РНК, а также обладает высокой чувствительностью и специфичностью, что чрезвычайно важно с учетом низкого содержания вирусов в питьевых водах [2].
В последние годы ПЦР применяют для определения кишечных вирусов в пробах окружающей среды [7,34,61,70,96,97,117,136,149]. ПЦР -один из наиболее чувствительных методов, используемых для мониторинга вирусного загрязнения объектов окружающей среды [53,91,125].
ПЦР используется для амплификации последовательностей нуклеиновой кислоты вирусных агентов, которые присутствуют в пробах воды в низких концентрациях. Быстрота анализа, чувствительность, специфичность, низкая стоимость и простота этой процедуры - все это привело к использованию ПЦР для исследования объектов окружающей среды.
11 2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ДЛЯ УСТРАНЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ ОТ-ПЦР
Каждая проба окружающей среды уникальна, поэтому трудно предположить, какой именно компонент может вызвать ингибирование ОТ-ПЦР. Это могут быть гуминовые вещества, которыми так богата вода поверхностных водоисточников, фекалии в сточных водах и многообразные химические загрязнения. Такие загрязняющие комплексы содержат неидентифицированные ингибирующие вещества.
Чрезвычайно многообразны и сложны по химическому составу ингибиторы, поступающие в пробу из окружающей среды [84,133,134]. В работе Ijzerman, М.М., Dahling, D.R., et al [82] предлагается такие ингибиторы удалять многоэтапным методом, включающим: 1) диализ; 2) солевая экстракция; 3) ультрафильтрация. После этапа ультрафильтрации эффективность концентрирования составляла 90%. Концентрация гуминовых кислот, при которых возможно определение энтеровирусов методом ОТ-ПЦР была 0,5 мг, а фульвокислот - 5,0 мг на объем реакционной смеси для ПЦР.
Вирусы в питьевой воде содержатся в низких концентрациях, поэтому неизбежным является этап концентрирования вирусов из больших объемов воды (10- 1000л и более) [1]. Эффективность индикации вирусного загрязнения воды в равной степени зависит от эффективности концентрирования вирусов и от эффективности метода индикации.
Учитывая большую значимость вирусного загрязнения воды, разработка методов концентрирования кишечных вирусов из больших объемов воды проводилась учеными разных стран, начиная с 60-х годов XX века. Анализ разработанных методов позволяет их классифицировать как методы, основанные на: 1) ультрафильтрации через микропористые мембраны, 2) сорбции на искусственных и естественных сорбентах и 3) преципитации или осаждении высокополимерными системами и гелями.
Все эти методы существенно отличаются по эффективности, продолжительности и сложности процедуры концентрирования, ее эффективности, экономичности и возможности использования в широкой санитарной практике. Кроме того, применение большинства из этих методов имеет определенные ограничения, обусловленные зависимостью эффективности метода от качества исследуемой воды, присутствия в ней органических и неорганических солей и примесей.
Для исследования чистых вод и, в основном питьевой воды, за рубежом наиболее широко используются фильтрационные методы с применением различных фильтрующих мембран: "Millipore" [10,98], "Sartorius", 1MDS , AS [89,98], Virosorb [63,98], стеклянные фильтры Filterite, Whatman [98], а также с применением картридж-фильтров Zeta Plus, MK, AMF Cuno, Meriden, CT [115], которые можно использовать как в стационарных, так и в полевых условиях.
Содержание ингибирующих веществ значительно повышается при
использования высокоэффективного метода концентрирования,
основанного на сорбции на микропористых фильтрах. К тому же,
различные белки, углеводы и другие органические соединения,
задерживаемые фильтром, могут связывать ионы магния, что затрудняет
ОТ-ПЦР [134]. Для снижения ингибирующего эффекта и повышения
эффективности метода используют метод вторичного концентрирования
осаждением полиэтиленгликолем (ПЭГ) [93]. Для этого метода
эффективность концентрирования, определенная культуральным методом, составила 88% для полиовируса I типа и 64% для ВГА.
Известно, что большинство кишечных вирусов сорбируются на отрицательно заряженных мембранах в присутствии Mg [139] или других мультивалентных катионов, или в кислой среде [143].
Согласно Броку [8], в адсорбции вирусов на мембранном фильтре главную роль играют электростатистические силы. Поверхности
мембранных фильтров обычно заряжены отрицательно. Вирусы же, как правило, при нейтральных значениях рН также заряжены отрицательно и не адсорбируются. Однако если рН среды становится меньше 4, матрица мембраны перезаряжается, она становится положительно заряженной и начинает адсорбировать вирусные частицы. Таким образом, если водную пробу подкислить, а затем профильтровать через мембрану, то практически все вирусные частицы свяжутся с мембраной [8,50]. Добавление катионов, особенно многовалентных, таких как алюминий, увеличивает эффективность перезарядки матрицы мембраны [54,98,148].
Разработаны фильтры, несущие в нейтральной области рН положительный заряд [8,83], что позволяет избежать необходимости подкисления воды на стадии адсорбции вирусов. Кроме того, фильтры модифицируют и другими методами. В качестве примера можно привести метод обработки фильтра растворами солей хлорида железа и после высушивания - гидридом магния, алюминия, натрия или аммония [148].
Концентрирование вирусов из воды на положительно заряженных мембранах [141] в настоящее время является одним из наиболее используемых методов [40]. Этот метод применяется для водопроводной воды [37,110,142], подземной [38], речной [115], вторично очищенных сточных вод [138] и морских вод [115,124].
Использование положительно заряженных мембранных фильтров подходит для устранения веществ, ингибирующих ОТ-ПЦР, без дополнительной очистки проб [118]. Однако, эффективность концентрирования вирусов из морской воды не всегда высока из-за низкой адсорбции вирусов на положительно заряженной мембране. Это происходит из-за влияния солей [98].
Некоторыми авторами [38,88], правда, было отмечено, что и при использовании положительно заряженных фильтров для концентрирования воды поверхностных водоисточников также наблюдалось и
концентрирование веществ, ингибирующих ОТ-ПЦР. При использовании стекловолокна концентрация ингибиторов ОТ-ПЦР значительно снижается [65].
В качестве сорбентов вирусов широкое применение нашли пористые кремнеземы [26], различным образом модифицированные [18], стекловата [76,77], негативно или позитивно заряженный стеклянный порошок [76].
В 70-80-х годах XX века в нашей стране для концентрирования вирусов широко использовались ионно-обменные смолы АВ-17-ИК, АВ-17-8, ЭДЭ-ЮП [20]. Эффективность метода концентрирования на различных марках ионитов вне зависимости от условий проведения сорбции вирусов (статические и динамические), как правило, не превышает 60-70%. На эффективность метода при фильтрации больших объемов воды могут оказывать неблагоприятное влияние уровни органического загрязнения исследуемой воды, затрудняющие ее фильтрацию через колонку со смолой. Однако следует отметить, что этот метод чрезвычайно прост для использования в лабораторных условиях [24].
Метод концентрирования на стеклянном порошке появился как очень перспективный метод для индикации ВГА в натурных пробах воды [22,63]. Эффективность концентрирования варьировала в зависимости от типа воды от 61% - для неочищенной сточной воды до 100% для питьевой воды. Для проб морской и пресной воды эффективность концентрирования составляла 75 и 80% соответственно.
Эффективность концентрирования после осаждения сульфатом аммония (ОСА): для пресной воды - 3%, для морской - 4%. Органическая флокулляция вносит значительные изменения в рН, которые могут значительно снизить инфекционность вирусов, стабильных при рН 9,5, но нестабильных при рН 3,5. Высокая концентрация солей при ОСА может вносить свой вклад в инактивацию некоторых энтеровирусов [115]. Однако, использование органической флоккуляции после этапа
концентрирования на макропористом стекле оправдано в случае использования ОТ-ПЦР для индикации вирусного загрязнения. Так, процент положительных проб, концентрированных на макропористом стекле, составил 48%, а после этапа органической флоккуляции он увеличился до 72% [66].
Другим методом, совмещающим концентрирование вирусов и очистку пробы от ингибирующих ОТ-ПЦР веществ, является метод с использованием ПЭГ и Pro-Cipitate (коммерческое название реагента для очистки и концентрирования белков). Вирусы из элюатов, подвергнутых осаждению ПЭГ, были концентрированы при помощи хлороформной экстракции и очистки Pro-Cipitate. Pro-Cipitate был также использован для концентрирования вирусов и очистки от ПЭГ-осадителей. Средний уровень эффективности концентрирования, определенный методом заражения культуры клеток после осаждения ПЭГ и ресуспендирования осадка, составил 88% для PV1 и 64% для HAV. Однако, оставшийся после фенол-хлороформной экстракции ПЭГ приводил к низким и сильно варьирующим результатам по эффективности концентрирования (4-68%), определяемым методом ОТ-ПЦР. Поэтому метод адсорбции-элюции с Pro-Cipitate изучают как альтернативный шаг в очистке вирусов [134].
Для элюции адсорбированных вирусов с фильтров и других сред наиболее широко используется мясной экстракт. Он содержит высокую концентрацию недостаточно изученных компонентов, которые могут мешать молекулярной детекции вирусов [38,39,40,115]. Тем не менее, элюирование мясным экстрактом - распространенный во всем мире прием, поскольку его использование совместимо с методом культуры ткани, используемом в вирусологическом исследовании [134].
Элюция вирусов с поверхности фильтра осуществляется добавлением 3% мясного экстракта при рН 8,5-9,5 [50,83,100] или 10% мясного экстракта [116]. Кроме того, используют раствор 1М NaCl [116] или 5М
16 NaCl при тех же рН, а также 1М NaCl в комбинации с 0,1% Твин-80 [116] и триптозофосфатный бульон при рН 9,5 [119].
После модификации в 1970-х годах процесса производства мясного экстракта снизилась его способность к осаждению вирусов. Для увеличения этого показателя в мясной экстракт стали добавлять такие осадители, как FeCl3 и диатомовые земли [113], которые проявляют высокий ингибирующий эффект на ОТ-ПЦР [135]. Многие исследователи пытались снизить ингибирующий эффект элюента [38,79]. Ингибиторы ОТ-ПЦР удаляли одностадийной экстракцией гуанидин изотиоцианатом. Чувствительность определения энтеровирусов при этом составила 0,6-0,003 тканевых цитопатогенных доз в мл (ТЦД5о/мл) для энтеровирусов, определенных в лизатах культуры клеток методом ОТ-ПЦР [137].
Исследователями Schwab, K.J., R. De Leon, et al. было показано, что использование 1,0% мясного экстракта вместо 1,5% или 3% приводит к уменьшению уровня ингибиторов по сравнению с концентрированным мясным экстрактом [135]. В качестве альтернативы элюции мясным экстрактом предлагается метод энзиматической элюции [128] с использованием лизоцима, папаина и химотрипсина.
В работе Katayama с соавторами [85] утверждается, что мясной экстракт не является лучшим элюентом для ОТ-ПЦР-анализа. Авторы предлагают новую серию процедур для концентрирования вирусов методом адсорбции-элюции на отрицательно заряженной мембране с применением этапа кислотного смыва для удаления катионов и других ингибиторов без элюирования вирусов с мембраны между этапами адсорбции и элюции. Было показано также, что неорганическая элюирующая среда на этапе пробоподготовки является лучшей для ОТ-ПЦР-анализа вирусов.
3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ РНК ВИРУСОВ ДЛЯ УСТРАНЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ ОТ-ПЦР
Обычно при выделении ДНК и РНК используют детергенты (такие как Triton XI00, Tween 20, Nonidet Р40), которые ингибируют ОТ-ПЦР в концентрации выше 5%, а также ионный детергент додецил сульфат натрия, который ингибирует Taq-полимеразу в концентрации выше 0,01%. Taq-полимераза - термостабильный фермент, обеспечивающий репликацию ДНК, обладает обратнотранскриптазной активностью, то есть позволяет получать из РНК комплементарную ей ДНК. Этот фермент способен удлинять короткие олигонуклеотидные последовательности (праймеры), присоединяя к их 3' -концу дополнительный нуклеотид.
Часто выделение генетического материала из загрязненных белковыми веществами сред проводят в присутствии протеиназы К -протеазы, способной разрушить денатурированный белок. Taq-полимераза чувствительна к присутствию протеиназы К и, следовательно, последняя должна быть удалена или инактивирована. Для этого достаточно нагревания до 95С с последующей фенол-хлороформной экстракцией, при которой протеиназа К остается в фенольно-органической фазе, а ДНК и РНК - в водной. Остаточные количества фенола, которые также могут вызвать ингибирование ОТ-ПЦР, удаляют при помощи обработки хлороформом [109].
Очень эффективным в отношении удаления мешающих компонентов является метод, состоящий в лиофилизации 0,5 мл. образцов, регидратации в 25 мл. дистиллированной воды, свободной от нуклеаз, лизисе гуанидинтиоцианатом, сорбции на частицах силикагеля, и элюции водным слабосолевым буфером [39]. Комплекс «нуклеиновая кислота - частицы силикагеля» отмывают дважды буфером, содержащим гуанидинтиоцианат, дважды - буфером, содержащим 70% этанол, 1 раз ацетоном и
высушивают. Нуклеиновые кислоты элюируют слабосолевым буфером [62,81].
В условиях концентрирования большого объема воды (378л) для устранения веществ, ингибирующих ОТ-ПЦР проводили сравнение 3-х методов очистки концентратов проб воды от ингибиторов ПЦР[135]:
Обработка проб на колонках Sephadex G-100 и Chellex-100;
Обработка проб на колонках Sephadex G-50 и Chellex-100 с последующей термической обработкой для высвобождения вирионной РНК;
Фенол-хлороформная экстракция.
Метод 2 не позволил устранить ингибирующий эффект. Метод 1 позволил удалить ингибирующие вещества, но при этом с колонок были также удалены и 99% вирусов. Фенол-хлороформная экстракция была наиболее эффективным методом для удаления ингибирующих веществ применительно к ОТ-ПЦР. Чувствительность метода составила 0,2 БОЕ/Юмкл элюата, что соответствует 0,2 БОЕ/1л водопроводной воды.
В работе М. Abbazadegan et al. [39] в качестве метода подготовки пробы воды к выделению нуклеиновой кислоты предлагается метод фенол-хлороформной экстракции с последующей очисткой при помощи гель-фильтрации на Sephadex G-100 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden). Таким образом, при этом применялись как химические, так и физические методы очистки пробы от ингибирующих веществ.
R. Gajardo с соавторами [62] предлагают следующие варианты подготовки концентратов проб воды для определения в них вирусов методом ОТ-ПЦР:
Метод А обработки проб воды состоит в выделении нуклеиновых кислот прогреванием при 65С в течение 1 ч. в присутствии 10 мкг. протеиназы К на мл. и 1% натрий додецил сульфата, обработке фенол -хлороформом и осаждении этанолом. Результат детекции продуктов
амплификации в агарозном геле отрицательный, возможно из-за присутствия веществ, ингибирующих этап обратной транскрипции. Когда пробы подвергали фильтрации через Sephadex G-200/G-25 перед обработкой протеиназой К и фенол - хлороформной экстракции (метод В), наблюдалось частичное удаление мешающих компонентов. Для еще более эффективного их удаления и повышения чувствительности анализа пробы были подвергнуты осаждению цетилтриметилммония бромидом (ЦТАБ) и этанолом (метод О. Осадок нуклеиновых кислот ресуспендировали в 1,25% ЦТАБ и 0,45% NaCl и центрифугировали при 12000g 30 мин., конечный осадок ресуспендировали в 1М NaCl. Нуклеиновые кислоты вновь осаждали этанолом и подвергали гель-фильтрации.
Методика (D) состоит в инкубировании проб с поливинилпирролидоном сразу после гель-фильтрации. Это успешно применяется для очистки ДНК, выделенной из почв (4-4). 1% (вес/объем) поливинилпирролидона (ПВП) (Sigma, средний молекулярный вес 360000) добавляли к пробе и смесь инкубировали при комнатной температуре 30 мин., а затем подвергали обработке протеиназой К и фенол-хлороформной экстракции. Такая обработка позволяет получить отчетливый сигнал продуктов амплификации в агарозном геле. Метод Е состоит в лиофилизации 0,5 мл. образцов, регидратации в 25 мл. дистиллированной воды, свободной от нуклеаз, лизисе гуанидинтиоцианатом, адсорбции на частицах стекла, и элюции водным слабосолевым буфером. Комплекс нуклеиновая кислота-стекло дважды отмывали буфером, содержащим гуанидинтиоцианат, дважды - буфером, содержащим 70% этанол, 1 раз ацетоном и высушивали. Нуклеиновые кислоты элюировали слабосолевым буфером. Этот метод оказался наиболее удачным в отношении удаления мешающих компонентов и получении чистого сигнала продуктов амплификации [138].
Хотя концентрация энтеровирусов в водах может быть очень низкой, с помощью метода ОТ-ПЦР можно обнаружить присутствие молекул
энтеровирусной РНК. Было показано, однако, что некоторые натурные пробы маскируют вирусную РНК, даже когда они заражены вирусами в высокой концентрации. Так, в пробе с высокой степенью химического загрязнения, зараженной PV1 в концентрации 10 вирусных частиц в 100 мкл, сигнала амплификации продуктов не наблюдалось, в то время как при разведении ее в 10 раз сигнал появился, а при разведении в 100 раз он даже усилился [39].
4. СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК И ОТ-ПЦР ДЛЯ ИНДИКАЦИИ ЭНТЕРОВИРУСОВ В ПРОБАХ ВОДЫ
Результаты, полученные на культуре ткани и в ОТ-ПЦР могут не вполне коррелировать. Минимальный уровень детекции вирусов в пробе при использовании культурального метода равен 1 БОЕ, что может быть эквивалентно как 1, так и нескольким вирионам. К тому же методом культуры ткани можно определить только культивируемые и цитолитические вирусы.
ОТ-ПЦР является более чувствительным тестом на присутствие энтеровирусов, так как позволяет определить единичные молекулы РНК. Однако, при ОТ-ПЦР-анализе невозможно разделить цитолитические и нецитолитические вирусы [38]. Тем не менее, этот метод активно используется для постановки диагноза у больных. Так, по данным Hosoya М, Honzumi К, et-al [74] из цереброспинальной жидкости 23 детей с различными неврологическими симптомами методом культуры ткани энтеровирусы были выделены из 2-х проб, в то время, как методом ОТ-ПЦР - из 9 проб. Эти данные подтвердили, что заболевание вызвано энтеровирусной инфекцией центральной нервной системы. Некоторые серотипы энтеровирусов, вызывающие инфекции центральной нервной системы плохо выделяются на культуре клеток. По данным Santos с соавторами 173 пробы фекалий больных дали отрицательный результат при анализе на клеточных линиях RD и Нер-2, а при использовании метода ОТ-ПЦР 15% из них дали положительный результат на присутствие энтеровирусов [129].
Результатами ОТ-ПЦР показано, что, по крайней мере, некоторые энтеровирусы не остаются адсорбированными на частицах почвы или осадков сточных вод. Вирусы способны к вертикальной и латеральной миграции. Эти данные отвергают ранее существовавшую гипотезу о том,
что в сточных водах и почве инактивация вирусов происходит из-за высвобождения нуклеиновой кислоты и последующей деградации генома [155]. Если инактивация вируса происходит из-за изменений в капсиде, то данные ОТ-ПЦР и культурального анализа могут не иметь полной корреляции [58,144]. При определении чувствительности культурального метода на вирусах, адаптированных к данной культуре соотношение инфекционных и дефектных вирусных частиц должно быть не менее 1:10. Методом ПЦР показано, что это соотношение может быть 1:104 для проб окружающей среды и более, если механизм инактивации затрагивает только незначительные структурные изменения, а не деструкцию нуклеотидной последовательности [144]. В процессе элюции могут денатурироваться вирусные капсиды. Это, а также то, что в ОТ-ПЦР можно определять инактивированные или неспособные к репликации вирусные частицы, объясняет возможные различия в результатах, получаемых в ОТ-ПЦР и культуральным методом [108].
При исследовании натурных проб количество положительных проб на РНК энтеровирусов бывает значительно выше, чем проб положительных в отношении цитолитических энтеровирусов. Такое различие объясняется присутствием нецитолитических вирусных капсидов, содержащих геном или наличием цитолитических энтеровирусов, которые не проявляют ЦПД на культуре клеток BGM (такие как Коксаки А). До тех пор, пока не будут соблюдены оптимальные условия для выделения всех типов энтеровирусов, невозможно определить точную взаимосвязь между присутствием РНК энтеровирусов и концентрацией цитолитических энтеровирусов [65].
Правильная интерпретация положительных результатов ОТ-ПЦР важна для оценки риска здоровью, связанного с вирусами, передающимися водным путем, так как вирусные геномы и цитопатогенные вирусы имеют разные модели поведения в воде [57,65,68,140]. Показано, что
цитопатогенные частицы разрушаются быстрее, чем вирусные геномы при одинаковой температуре. При 35С наблюдалась редукция инфекционности полиовируса I типа на 4 log через 19 дней, в то время, как эквивалентная редукция вирусных геномов составила бы 75 лет (по результатам математического моделирования) [67].
Таким образом, можно заключить, что положительный результат на присутствие вирусных геномов в воде нужно интерпретировать с большой осторожностью из-за недостаточной корреляции между присутствием вирусных геномов и вирусной цитопатогенномтью. Индикация вирусных геномов может быть необходимой для определения инфекционного риска населению, но не достаточной.
По данным Hot D., et al. и Gantzer, A., et al. РНК энтеровирусов можно считать индикатором вирусного загрязнения [67,75], поскольку в пробах, отрицательных на цитопатогенные энтеровирусы не было обнаружено и РНК энтеровирусов, а также потому, что РНК энтеровирусов может быть определена с высокой специфичностью и чувствительностью, в 10-1000 раз превышающей таковую культурального метода [67].
Ранее для индикации вирусов в пробах воды считалось перспективным использование иммуноферментного анализа (ИФА). Недавними исследованиями [27,28] показано, что экспериментальная чувствительность метода ОТ-ПЦР в 10000 раз превосходит чувствительность ИФА, что указывает на большие перспективы использования тест-систем на основе ПЦР для контроля качества воды различного вида водопользования.
5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ОТ-ПЦР, ИНТЕГРИРОВАННОЙ С КУЛЬТУРОЙ КЛЕТОК (ИКК ОТ-ПЦР) ДЛЯ АНАЛИЗА ЭНТЕРОВИРУСНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПРОБ ВОДЫ
В настоящее время стандартный метод для определения энтеровирусов в образцах окружающей среды включает анализ на культуре клеток, который является очень дорогостоящим и длительным. Культура клеток очень чувствительна к присутствию органических и неорганических веществ, содержащихся в образцах ОС, которые могут быть токсичными для клеток культуры.
Альтернативным методом для индикации энтеровирусов в пробах ОС является ОТ-ПЦР. Сокращение времени анализа и стоимости и более высокая чувствительность ОТ-ПЦР позволяет обнаружить РНК в низких концентрациях, что обычно имеет место в образцах ОС. Однако, используя этот метод невозможно определить, амплифицируется последовательность цитолитического или нецитолитического вируса. Эта проблема может быть решена путем комбинирования методики культуры клеток и ОТ-ПЦР. При этом используются основные преимущества этих методик и устраняются отдельные недостатки [114].
Результатами Greening G.E., Hewitt J., et al. было показано, что ингибирование ОТ-ПЦР может быть устранено при высокой концентрации мишеней. Следовательно, при пассировании вирусов на культуре клеток увеличение концентрации цитопатогенных вирусов и разведение пробы средой уменьшает влияние ингибирующих веществ, что представляется особенно важным для ОТ-ПЦР-анализа [69]. При комбинировании молекулярной и культуральной методик уменьшается влияние токсических веществ на культуру клеток и ингибирующих веществ на ОТ-ПЦР. Таким образом, появляется возможность быстрого определения цитопатогенных вирусов. Метод ОТ-ПЦР, интегрированной с культурой ткани, включает заражение концентратом пробы воды монослоя клеток, который затем
инкубируют 24 часа при 37С. Затем проводят ОТ-ПЦР-анализ с лизатами клеток культуры. При использовании данной методики энтеровирусы обнаруживались в пробах воды методом ОТ-ПЦР лизата клеток культуры как до, так и после проявления цитопатического действия.
По данным Reynolds A., Gerba С, et al комбинированная методика культуры клеток и ОТ-ПЦР была более чувствительной, чем просто ОТ-ПЦР. При ОТ-ПЦР предел определения энтеровирусов составил 0,28 БОЕ/реакцию ПЦР. При использовании комбинированной методики чувствительность определения повышается до 0,028 БОЕ/флакон с культурой ткани для заражения [122]. Это становится возможным благодаря возрастанию количества цитопатогенных вирусных частиц, которые затем добавляют в ПЦР-смесь [14].
Комбинированная методика культуры ткани и ОТ-ПЦР позволяет быстрее и с большей чувствительностью, чем на культуре ткани определить наличие энтеровирусов в низких концентрациях [80,122].
Использование только ОТ-ПЦР или только заражения культуры клеток может привести к ошибочным результатам при анализе проб окружающей среды. Использование комбинации этих 2-х методик является более эффективным. По данным Reynolds К.А., et al. положительный сигнал ПЦР отмечался в случае пробы с концентрацией ЭВ 10 БОЕ, инкубированной 5 часов на культуре ткани; 1 БОЕ определялась в ОТ-ПЦР после инкубирования в течение 20 часов. После заражения морской, сточной и поверхностной водами все 100% проб лизатов культур клеток дали положительный результат в ИКК ОТ-ПЦР, в то время как в классической постановке ОТ-ПЦР положительными были только 30% проб [121].
Метод ИКК ОТ-ПЦР позволяет определить наличие энтеровирусов в пробе в течение 2-3 суток, а культуральный метод - только нескольких недель. Бактериальные индикаторные организмы, используемые для оценки фекального загрязнения и потенциального риска здоровью
населения, часто не коррелируют с наличием вирусов в пробах. В то же время с помощью ИКК ОТ-ПЦР можно определить наличие цитопатогенных энтеровирусов в короткие сроки. Метод ИКК ОТ-ПЦР объединяет два ранее используемых метода детекции вирусов: метод заражения культуры ткани и ОТ-ПЦР, являясь принципиально новой методологией по сравнению с ранее используемыми [120].
6.ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ОТ-ПЦР ДЛЯ КОНТРОЛЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ЭНТЕРОВИРУСОВ В ПРОБАХ ВОДЫ, ПРОШЕДШЕЙ ОБРАБОТКУ УФО и ХЛОРОМ
Одними из наиболее эффективных мероприятий по снижению заболеваемости энтеральными кишечными инфекциями являются санитарно-гигиенические, направленные на разрыв эпидемической цепочки "больной —> пути (факторы) передачи —> здоровый человек" в средней ее части, а именно "пути —> факторы передачи". В этой связи основное внимание уделяется ограничению циркуляции возбудителей вирусной природы в ОС, в частности в воде.
Основным источником микробного загрязнения рек, водохранилищ, озер являются неочищенные хозяйственно-бытовые сточные воды. Среди широкого спектра микроорганизмов, поступающих со сточными водами в водоемы, большое место занимают энтеровирусы, обладающие высокой хлорустойчивостью и, в связи с этим, проходящие барьеры очистных сооружений [5,11,12,15,36].
Совершенствование санитарно-вирусологических методов
исследования качества питьевой воды позволило получить данные, свидетельствующие о прохождении энтеровирусов через барьеры водопроводных сооружений и попадания их в распределительную сеть. По данным ряда исследователей [9,13,29,106] современные способы обработки воды не полностью удаляют энтеровирусы. Это представляет определенную опасность для человека, т.к. известно, что проникновение даже одной цитопатогенной вирусной частицы в организм человека с питьевой водой может привести к заболеванию.
Недостаточная эффективность различных этапов водоподготовки в отношении вирусов была показана Keswick et al. [86]. Авторы установили,
что после полного цикла очистки питьевой воды, включая хлорирование, 12% проб содержали вирусы.
С развитием методов молекулярной биологии, стали использовать зонды и ПЦР для исследования механизмов обеззараживания. Jim Wen Li, Zhong Tao Xin et al было проведено исследование для изучения возможности использования ОТ-ПЦР для оценки степени инактивации вирусов в воде, объяснения механизма инактивации ВГА при хлорировании [95]. Результаты на культуре клеток показывают полную утрату цитопатогенных свойств вируса через 30 мин. после обработки хлором в концентрации 10-20 мг/л. Обеззараживание хлором принято во всем мире, чтобы обеспечить безопасность питьевой воды, поскольку ВГА, как и энтеровирусы, распространяется в основном через питьевую воду и продукты.
Трудно разрешимая проблема, наиболее часто встречаемая при подобных исследованиях, следующая: после обеззараживания вирусная нуклеиновая кислота продолжает определяться в ПЦР, хотя вирус теряет свою цитопатогенность. Исходя из этого, ряд авторов придерживается мнения, что методы молекулярной биологии не могут быть использованы для оценки эффекта и механизма обеззараживания [55,92,99,101,152].
Утрата цитопатогенных свойств вируса - наиболее важный и прямой показатель для оценки эффективности обеззараживания. Разными исследователями показано, что утрата инфекционных свойств вируса при хлорировании наблюдается при концентрациях хлора 1-25 мг/л [131,153] и времени воздействия 30 мин.
Исследование, проведенное Jun Wen Li et al. [95] показало, что антигенность вируса гепатита А, определенная методом ELISA, инактивируется при концентрации хлора 10 мг/л и времени воздействия 60 мин. Это значит, что исчезновение антигенности происходит после инактивации инфекционности. Эти данные соответствуют приведенным в работе Scarpino et al. [131]. Это наводит на мысль, что мишень
инактивации хлором ВГА может находиться не в капсидном белке, а скорее в нуклеиновой кислоте.
Для оценки механизмов обеззараживания вирусов была использована ОТ-ПЦР. В работе Leveque et al показано, что при облучении УФ морской воды в течение 60 мин., ВГА не проявляет инфекционности, но его РНК продолжает определяться в ОТ-ПЦР [92]. В работе Han et al опубликованы сходные выводы [71]. Авторы этих работ также придерживаются мнения о некорректности использования молекулярных методов для оценки эффективности обеззараживания воды от вирусов.
Blackmer,F et al сделана попытка применить комбинацию молекулярного и культурального методов для оценки эффективности обеззараживания воды. Стандартным культуральным методом показано, что полиовирус инактивируется 0,5мг свободного хлора на литр через 2 минуты. Объединенной методикой культуры ткани и ОТ-ПЦР вирусы определялись более чем через 8 мин. после начала воздействия при той же концентрации хлора [43]. Для полной инактивации РНК требовалось 10 мин. Таким образом, время контакта с хлором при обеззараживании половирусов в 5 раз выше, чем предполагали ранее. ЦПД наблюдали через 3-14 дней [122].
Более ранние исследования показали, что инактивация полиовируса свободным хлором наблюдалась при 0,5 мг/л через 2 мин. При проведении 1-го пассажа были получены данные, подтверждающие эти. Второй пассаж подтвердил, не просто наличие полиовируса, а его цитопатогенность. Более того, для получения положительных результатов методом ИКК-ПЦР необходимо всего 2 дня по сравнению с 14 днями для культурального метода. За 8 минут большинство проб было полностью обеззаражено 0,5 мг свободного хлора.
В методе ИКК ОТ-ПЦР соединилась быстрота и чувствительность ОТ-ПЦР с репрезентативностью культурального анализа, формируя метод
зо молекулярной детекции, позволяющий быстро определить РНК цитопатогенных энтеровирусов в низких концентрации [122].
По приведенным литературным данным можно сделать заключение, что ИКК ОТ-ПЦР наиболее чувствительный и быстрый метод для детекции цитопатогенных энтеровирусов после обработки хлором по сравнению с культуральным анализом. Это новое применение ИКК ОТ-ПЦР оказалось наиболее эффективным для определения времени дезинфекции, сводя к минимуму количество ложноположительных результатов, по сравнению с анализом на I пассаже культуры клеток. Это является чрезвычайно актуальным, так как точное определение скорости инактивации вирусов, передающихся водным путем, представляет особую важность для процесса водоподготовки на станциях по водоочистке.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Объекты исследования
Настоящее исследование по разработке схемы санитарного контроля загрязнения воды различных водных объектов энтеровирусами с использованием метода полимеразной цепной реакции проводилось в натурных исследованиях на основе экспериментальных разработок.
Объектами исследования были дехлорированная водопроводная, речная, подземная и сточная воды из различных климато-географических зон РФ. Пробы водопроводной воды отбирали из водоразборного крана московской городской водопроводной сети в стерильные широкогорлые бутыли и оставляли при комнатной температуре на 24 часа для удаления свободного хлора.
Апробирование молекулярно-биологических методов для санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды различных водных объектов энтеровирусами осуществлялась в 2 этапа.
На первом этапе исследования был проведен анализ поверхностных, подземных и питьевых вод городов Домодедово, Ступино, Чехов, Подольск, Калуга, Рязань, Тольятти, Приокское в отсутствие вспышечной заболеваемости населения кишечными вирусными инфекциями. Всего было исследовано 167 проб воды источников различного типа (поверхностные водоисточники, подземные, вода распределительной сети).
На втором этапе исследования был проведен анализ воды поверхностных, подземных водоисточников, а также воды распределительной сети городов Протвино и Серпухов в период вспышки вирусного гепатита А среди населения этих городов. Всего была исследовано 51 проба.
Аттенуированный штамм вируса полиомиелита был выбран нами исходя из следующих соображений: он является наиболее устойчивым
среди других вирусов кишечной группы к факторам обеззараживания [6,21], широко используется в качестве модельного вируса в экспериментальных исследованиях при отработке методов индикации вирусов из различных объектов окружающей среды, что позволяет получить воспроизводимые результаты [11,19,43,111,132,154]. Кроме того этот штамм является авирулентным и работа с ним не сопряжена с риском распространения инфекции.
2. Штамм вируса
При проведении экспериментальных исследований были использованы модельные штаммы полиовируса I типа (штамм LSc2ab), полученный в НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.И. Чумакова РАМН и РНК- содержащий колифаг MS-2 (штамм РН 1505), в качестве лизабельной бактериальной культуры использовали E.coli 3254 (штамм К 12 F+ StrR), полученные в ГНИЙ Генетика - Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов.
Аттенуированный штамм вируса полиомиелита был выбран нами исходя из следующих соображений: он является наиболее устойчивым среди других вирусов кишечной группы к факторам обеззараживания [6, 21], широко используется в качестве модельного вируса в экспериментальных исследованиях при отработке методов индикации вирусов из различных объектов окружающей среды, что позволяет получить воспроизводимые результаты [11,19,111,154,132,43). Кроме того этот штамм является авирулентным и работа с ним не сопряжена с риском распространения инфекции.
Исходный титр вируса составляет 7,0-7,5 lg ТЦД5о/мл. Исходный титр . фага MS-2 составляет 101 - 104 БОЕ/мл.
3. Методы выделения вирусов
Концентрирование вирусов из вод различного вида осуществляли на макропористом стекле (МПС-1000 ВГХ), на ионообменной смоле АВ 17-8 и фильтрующей мембране ММК.
Элюаты перед исследованием методом ОТ-ПЦР отбирали и хранили при температуре -20С. Перед вирусологическим исследованием с целью подавления сопутствующей микрофлоры и удаления токсических веществ, действующих на культуру ткани, элюаты обрабатывали хлороформом (встряхиванием в течение 5 мин.) и антибиотиками (натриевая соль пенициллина 1000 ед. на 1мл пробы) [24].
3.1 Выделение вирусов в культурах клеток
Выделение цитопатических вирусов из исследуемых проб проводили на перевиваемых линиях культуры ткани по общепринятым вирусологическим методикам [24]. Для выделения вирусов были использованы перевиваемые культуры ткани RD (рабдомиосаркома человека) и BGM (почки зеленой мартышки Буффало), полученные из института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН и культивируемые в лаборатории санитарной микробиологии и паразитологии НИИ ЭЧиГОС им. Сысина РАМН.
Выделение вирусов из исследуемых проб проводили количественным и качественным методами в соответствии с Рекомендациями по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. Женева. [30]. Количественное определение вирусов проводили, высевая пробу на культуру ткани, используя метод конечного разведения [24].
При качественной оценке по ЦПД натурных проб проводили 3 пассажа на культуре ткани, что позволяло выявить вирусы в том случае, если они присутствовали в незначительных количествах. Результат считался отрицательным, если в 3-х пассажах отсутствовал цитопатический эффект.
3.2,Определение РНК энтеровирусов в концентратах проб воды
Наличие РНК энтеровирусов методом ОТ-ПЦР в элюатах определяли, используя коммерческие тест-системы "АмплиСенс Enterovirus-20T\ производимые Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии МЗ РФ. Наличие РНК определяли 3-мя методами:
Методом афинной сорбции на частицах силикагеля по Boom et al [44], используя для выделения РНК комплект "РИБО-сорб".
Методом гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформной экстракции [52], используя комплект для выделения "РИБО-золь".
Комбинацией методов 1 и 2.
3.2.1. Методика выделения РНК методом афинной сорбции
Лизирующий раствор и раствор для отмывки прогревали при 60С до полного растворения кристаллов.
В пробирки на 1,5 мл с плотно закрывающимися крышками вносили по 100 мкл сыворотки крупного рогатого скота, добавляли 450 мкл лизирующего раствора. Перемешивали на вортексе и центрифугировали в течение нескольких секунд для сброса жидкости с крышек пробирок.
Вносили в пробирки наконечником с воздушным барьером по 100 мкл контрольных штаммов энтеровирусов, исследуемых проб воды, отрицательного контрольного образца (стерильная водопроводная вода) встряхивали на вортексе и осаждали на центрифуге для сброса капель жидкости с крышек.
Ресуспендировали сорбент, интенсивно взбивая на вортексе. Добавляли в каждую пробирку отдельным наконечником по 25 мкл ресуспендированного сорбента.
Перемешивали содержимое пробирок на вортексе и оставляли на 1 мин. в штативе. Перемешивали содержимое пробирок еще раз на вортексе и оставляли их в штативе до полного осаждения сорбента.
Центрифугировали пробирки на микроцентрифуге при 10 Tbic.g 30 сек.
Отбирали надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсос.
Добавляли в пробирки по 450 мкл раствора для отмывки. Перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Центрифугировали пробирки на микроцентрифуге при 10 Tbic.g 30 сек. Отбирали надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсос.
Повторяли отмывку раствором для отмывки.
Добавляли в пробирки по 500 мкл 70% этанола. Перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Центрифугировали пробирки на микроцентрифуге при 10 Tbic.g 30 сек. Отбирали этанол из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсос.
Повторяли отмывку этанолом.
Добавляли в пробирки по 500 мкл ацетона. Перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Центрифугировали пробирки на микроцентрифуге при 10 тыс. g/мин 30 сек. Полностью отбирали ацетон из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсос.
Высушивали сорбент, поместив пробирки в термостат на 56С на 5 мин.
Ресуспендировали сорбент в 25 мл РНК-элюента, используя наконечник с барьером. Прогревали в термостате при 56С 2 мин, перемешивали на вортексе и осаждали сорбент на центрифуге при 10 Tbic.g 60 сек.
Полученные таким образом РНК-пробы готовы к постановке реакции обратной транскрипции. (РНК-пробы хранили не дольше 30 мин. при +2 -+8С, для длительного хранения пробы замораживали при -20С).
3.2.2. Методика выделения РНК с помощью гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформной экстракции, используя комплект для выделения "РИБО-золь"
1. Раствор D*, лизирующий раствор и раствор для отмывки (если они
хранились при 2-8С) прогревали при 60С до полного растворения
кристаллов.
2. Отбирали необходимое количество пробирок на 1,5мл, включая
контрольную. В пробирки вносили по 250 мкл раствора D.
В пробирки с раскатанными 250 мкл раствора D вносили по 100 мкл осветленных проб концентратов воды, перемешивали на вортексе, осаждали и добавляли внутренний контрольный образец.
В отдельную пробирку добавляли 300 мкл раствора D, перемешивали на вортексе, осаждали и добавляли 100 мкл отрицательного контрольного образца (стерильная водопроводная вода).
Добавляли к раствору 30 мкл ацетата натрия. Перемешивали на вортексе. Центрифугировали для удаления капель с крышек пробирок.
Добавляли к раствору 0,3 мл кислого фенола, перемешивали на вортексе. Центрифугировали для удаления капель с крышек пробирок.
Добавляли к раствору 0,1мл хлороформ:изоамила. Перемешивали на вортексе 1-2 минуты.
Ставили пробирки в ледяную баню (0-+4С) на 10 мин.
Центрифугировали пробирки при 14-16 тыс. g/мин 10 минут. В процессе центрифугирования раствор разделялся на 2 фазы: нижнюю -фенол, содержащий белки и ДНК, и верхнюю - водную, содержащую РНК.
10. Аккуратно отбирали верхнюю фазу (приблизительно 0,3 мл),
содержащую РНК, используя наконечники с аэрозольным барьером.
* - Раствор D: К 293 мл Н20 добавляют 250г GuSCN, 17,6мл 0,75М цитрата натрия (рН7,0) и 26,4мл 10% лаурилсаркосината натрия. Перемешивать при температуре 65С до полного растворения компонентов. Хранить при комнатной температуре, а перед использованием добавлять 0,36мл 14,4М р-меркаптоэтанола на 50мл раствора D. Раствор D может храниться месяцами при комнатной температуре в темноте. Важно помнить, что в растворе гуанидина при низкой температуре могут выпадать кристаллы [107].
3.2.3. Комбинация методов гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформной экстракции и метода афинной сорбции
Описание методики представлено в главе 2 "Отработка метода выделения РНК из концентратов сточных вод и вод поверхностных водоисточников".
3.3. Проведение реакции обратной транскрипции
Готовили реакционную смесь: в отдельной пробирке смешивали реактивы для обратной транскрипции из расчета на одну пробу: 4мкл реакционного буфера, 4мкл нуклеотидтрифосфатов, 1мкл затравочного праймера, 0,5мкл DEPC-воды, 0,5 мкл обратной транскриптазы.
Раскапывали в пробирки по 10 мкл готовой смеси.
Используя наконечник с барьером, добавляли 10 мкл готовой РНК-пробы в пробирку с реакционной смесью, осторожно перемешивали пипетированием.
Инкубировали пробирки в амплификаторе при 37С в течение 30 минут.
3.4. Проведение полимеразной цепной реакции
Смешивали праймеры и нуклеотидтрифосфаты в равных частях в одной пробирке.
Пробирку с воском прогревали в термостате при 95С до полного его расплавления.
В микропробирки для проведения ПЦР добавляли по 10 мкл готовой смеси праймеров и нуклеотидтрифосфатов, сверху наслаивали 15 мкл расплавленного воска.
Готовили верхнюю реакционную смесь из расчета на одну пробу: 10 мкл 5-кратного реакционного буфера, 9 мкл деионизированной воды, 1 мкл Taq-полимеразы (5 ед/мкл).
В пробирки для ПЦР на поверхность застывшего воска раскапывали по 20 мкл верхней реакционной смеси, сверху раскапывали по 1 капле масла для ПЦР.
Под масло, используя наконечники с аэрозольными барьерами, вносили по 20 мкл кДНК.
Амплификацию проводили на амплификаторе "Терцик" ("ДНК-технология") с активным регулированием по следующей программе: 95С -2 мин - 1 цикл; 42 цикла: 95С - 10 сек, 58С - 10 сек, 72С - 10 сек; 72С - 1 мин - Іцикл, 10С - хранение.
3.5. Детекция продуктов амплификации методом электрофореза в
1,8% агарозном геле
Готовили рабочий электрофорезный буфер. В мерный цилиндр вливали 25 мл концентрированного ТБЕ, доводили дистиллированной водой до 500 мл, закрывали цилиндр парафильмом и перемешивали.
Агарозу - 1,8 г пересыпали в стеклянную колбу из термостойкого стекла, наливали 100 мл готового 0,5-кратного буфера и расплавляли на электроплитке или в микроволновой печи до полного растворения агарозы,
после чего доводили агарозу до кипения еще 2 раза и слегка остужали, вращая колбу.
Заливали расплавленный гель толщиной около 6 мм в форму камеры. Ставили гребенки на расстоянии друг от друга не менее 3 см. После полного застывания геля (30 минут при комнатной температуре), осторожно вынимали из него гребенки, не повреждая лунки. Помещали подложку с готовым гелем в камеру, лунки при этом располагались ближе к отрицательному электроду (кДНК, соответственно, двигалась к положительному). Заливали в камеру 0,5-кратного буфера столько, чтобы он покрывал гель на 5 мм сверху.
Пробирки с продуктами амплификации выставляли последовательно, отбирали из-под слоя масла по 15 мкл пробы и вносили в лунки геля.
Подключали камеру к источнику тока, соблюдая полярность (кДНК движется к положительному электроду), и включали источник. Оптимальное напряжение 150-200 В на 10 см геля.
Когда краситель (ксиленцианол) проходил примерно половину длины геля, выключали источник, переносили гель на трансиллюминатор и рассматривали расположение полос кДНК в ультрафиолетовом свете. Электрофореграмму документировали с помощью специальной видеосистемы "Биотест-1". Длина амплифицированного фрагмента РНК составляла 207 пар нуклеотидов.
4. Выделение колифагов
Выделение и качественный учет колифагов проводили в соответствии с МУК 4.2.1018-01 "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды"[23].
5.Статистическая обработка результатов
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета статистических программ STATISTICA for Windows. Результаты анализа по каждому показателю сравнивали в исследуемых группах с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни и критерия X2. Массивы данных по каждому показателю оценивали с помощью корреляционного анализа, используя коэффициент Спирмена. Объемы выполненных санитарно-вирусологических исследований прведены в Приложении 1.
Использование методов выделения рнк вирусов для устранения ингибиторов от-пцр
Обычно при выделении ДНК и РНК используют детергенты (такие как Triton XI00, Tween 20, Nonidet Р40), которые ингибируют ОТ-ПЦР в концентрации выше 5%, а также ионный детергент додецил сульфат натрия, который ингибирует Taq-полимеразу в концентрации выше 0,01%. Taq-полимераза - термостабильный фермент, обеспечивающий репликацию ДНК, обладает обратнотранскриптазной активностью, то есть позволяет получать из РНК комплементарную ей ДНК. Этот фермент способен удлинять короткие олигонуклеотидные последовательности (праймеры), присоединяя к их 3 -концу дополнительный нуклеотид.
Часто выделение генетического материала из загрязненных белковыми веществами сред проводят в присутствии протеиназы К -протеазы, способной разрушить денатурированный белок. Taq-полимераза чувствительна к присутствию протеиназы К и, следовательно, последняя должна быть удалена или инактивирована. Для этого достаточно нагревания до 95С с последующей фенол-хлороформной экстракцией, при которой протеиназа К остается в фенольно-органической фазе, а ДНК и РНК - в водной. Остаточные количества фенола, которые также могут вызвать ингибирование ОТ-ПЦР, удаляют при помощи обработки хлороформом [109].
Очень эффективным в отношении удаления мешающих компонентов является метод, состоящий в лиофилизации 0,5 мл. образцов, регидратации в 25 мл. дистиллированной воды, свободной от нуклеаз, лизисе гуанидинтиоцианатом, сорбции на частицах силикагеля, и элюции водным слабосолевым буфером [39]. Комплекс «нуклеиновая кислота - частицы силикагеля» отмывают дважды буфером, содержащим гуанидинтиоцианат, дважды - буфером, содержащим 70% этанол, 1 раз ацетоном и высушивают. Нуклеиновые кислоты элюируют слабосолевым буфером [62,81]. В условиях концентрирования большого объема воды (378л) для устранения веществ, ингибирующих ОТ-ПЦР проводили сравнение 3-х методов очистки концентратов проб воды от ингибиторов ПЦР[135]: 1) Обработка проб на колонках Sephadex G-100 и Chellex-100; 2) Обработка проб на колонках Sephadex G-50 и Chellex-100 с последующей термической обработкой для высвобождения вирионной РНК; 3) Фенол-хлороформная экстракция.
Метод 2 не позволил устранить ингибирующий эффект. Метод 1 позволил удалить ингибирующие вещества, но при этом с колонок были также удалены и 99% вирусов. Фенол-хлороформная экстракция была наиболее эффективным методом для удаления ингибирующих веществ применительно к ОТ-ПЦР. Чувствительность метода составила 0,2 БОЕ/Юмкл элюата, что соответствует 0,2 БОЕ/1л водопроводной воды.
В работе М. Abbazadegan et al. [39] в качестве метода подготовки пробы воды к выделению нуклеиновой кислоты предлагается метод фенол-хлороформной экстракции с последующей очисткой при помощи гель-фильтрации на Sephadex G-100 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden). Таким образом, при этом применялись как химические, так и физические методы очистки пробы от ингибирующих веществ.
R. Gajardo с соавторами [62] предлагают следующие варианты подготовки концентратов проб воды для определения в них вирусов методом ОТ-ПЦР:
Метод А обработки проб воды состоит в выделении нуклеиновых кислот прогреванием при 65С в течение 1 ч. в присутствии 10 мкг. протеиназы К на мл. и 1% натрий додецил сульфата, обработке фенол -хлороформом и осаждении этанолом. Результат детекции продуктов амплификации в агарозном геле отрицательный, возможно из-за присутствия веществ, ингибирующих этап обратной транскрипции. Когда пробы подвергали фильтрации через Sephadex G-200/G-25 перед обработкой протеиназой К и фенол - хлороформной экстракции (метод В), наблюдалось частичное удаление мешающих компонентов. Для еще более эффективного их удаления и повышения чувствительности анализа пробы были подвергнуты осаждению цетилтриметилммония бромидом (ЦТАБ) и этанолом (метод О. Осадок нуклеиновых кислот ресуспендировали в 1,25% ЦТАБ и 0,45% NaCl и центрифугировали при 12000g 30 мин., конечный осадок ресуспендировали в 1М NaCl. Нуклеиновые кислоты вновь осаждали этанолом и подвергали гель-фильтрации.
Методика (D) состоит в инкубировании проб с поливинилпирролидоном сразу после гель-фильтрации. Это успешно применяется для очистки ДНК, выделенной из почв (4-4). 1% (вес/объем) поливинилпирролидона (ПВП) (Sigma, средний молекулярный вес 360000) добавляли к пробе и смесь инкубировали при комнатной температуре 30 мин., а затем подвергали обработке протеиназой К и фенол-хлороформной экстракции. Такая обработка позволяет получить отчетливый сигнал продуктов амплификации в агарозном геле. Метод Е состоит в лиофилизации 0,5 мл. образцов, регидратации в 25 мл. дистиллированной воды, свободной от нуклеаз, лизисе гуанидинтиоцианатом, адсорбции на частицах стекла, и элюции водным слабосолевым буфером. Комплекс нуклеиновая кислота-стекло дважды отмывали буфером, содержащим гуанидинтиоцианат, дважды - буфером, содержащим 70% этанол, 1 раз ацетоном и высушивали. Нуклеиновые кислоты элюировали слабосолевым буфером. Этот метод оказался наиболее удачным в отношении удаления мешающих компонентов и получении чистого сигнала продуктов амплификации [138].
Использование метода от-пцр, интегрированной с культурой клеток (икк от-пцр) для анализа энтеровирусного
Лизирующий раствор и раствор для отмывки прогревали при 60С до полного растворения кристаллов.
1. В пробирки на 1,5 мл с плотно закрывающимися крышками вносили по 100 мкл сыворотки крупного рогатого скота, добавляли 450 мкл лизирующего раствора. Перемешивали на вортексе и центрифугировали в течение нескольких секунд для сброса жидкости с крышек пробирок.
2. Вносили в пробирки наконечником с воздушным барьером по 100 мкл контрольных штаммов энтеровирусов, исследуемых проб воды, отрицательного контрольного образца (стерильная водопроводная вода) встряхивали на вортексе и осаждали на центрифуге для сброса капель жидкости с крышек.
3. Ресуспендировали сорбент, интенсивно взбивая на вортексе. Добавляли в каждую пробирку отдельным наконечником по 25 мкл ресуспендированного сорбента.
4. Перемешивали содержимое пробирок на вортексе и оставляли на 1 мин. в штативе. Перемешивали содержимое пробирок еще раз на вортексе и оставляли их в штативе до полного осаждения сорбента.
5. Центрифугировали пробирки на микроцентрифуге при 10 Tbic.g 30 сек.
6. Отбирали надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсос.
7. Добавляли в пробирки по 450 мкл раствора для отмывки. Перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Центрифугировали пробирки на микроцентрифуге при 10 Tbic.g 30 сек. Отбирали надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсос.
8. Повторяли отмывку раствором для отмывки.
9. Добавляли в пробирки по 500 мкл 70% этанола. Перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Центрифугировали пробирки на микроцентрифуге при 10 Tbic.g 30 сек. Отбирали этанол из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсос.
10. Повторяли отмывку этанолом.
11. Добавляли в пробирки по 500 мкл ацетона. Перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Центрифугировали пробирки на микроцентрифуге при 10 тыс. g/мин 30 сек. Полностью отбирали ацетон из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсос.
12. Высушивали сорбент, поместив пробирки в термостат на 56С на 5 мин.
13. Ресуспендировали сорбент в 25 мл РНК-элюента, используя наконечник с барьером. Прогревали в термостате при 56С 2 мин, перемешивали на вортексе и осаждали сорбент на центрифуге при 10 Tbic.g 60 сек.
Полученные таким образом РНК-пробы готовы к постановке реакции обратной транскрипции. (РНК-пробы хранили не дольше 30 мин. при +2 -+8С, для длительного хранения пробы замораживали при -20С).
1. Раствор D , лизирующий раствор и раствор для отмывки (если они хранились при 2-8С) прогревали при 60С до полного растворения кристаллов.
2. Отбирали необходимое количество пробирок на 1,5мл, включая контрольную. В пробирки вносили по 250 мкл раствора D.
3. В пробирки с раскатанными 250 мкл раствора D вносили по 100 мкл осветленных проб концентратов воды, перемешивали на вортексе, осаждали и добавляли внутренний контрольный образец.
4. В отдельную пробирку добавляли 300 мкл раствора D, перемешивали на вортексе, осаждали и добавляли 100 мкл отрицательного контрольного образца (стерильная водопроводная вода).
5. Добавляли к раствору 30 мкл ацетата натрия. Перемешивали на вортексе. Центрифугировали для удаления капель с крышек пробирок.
6. Добавляли к раствору 0,3 мл кислого фенола, перемешивали на вортексе. Центрифугировали для удаления капель с крышек пробирок.
7. Добавляли к раствору 0,1мл хлороформ:изоамила. Перемешивали на вортексе 1-2 минуты.
8. Ставили пробирки в ледяную баню (0-+4С) на 10 мин.
9. Центрифугировали пробирки при 14-16 тыс. g/мин 10 минут. В процессе центрифугирования раствор разделялся на 2 фазы: нижнюю -фенол, содержащий белки и ДНК, и верхнюю - водную, содержащую РНК.
10. Аккуратно отбирали верхнюю фазу (приблизительно 0,3 мл), содержащую РНК, используя наконечники с аэрозольным барьером.
Отработка метода выделения рнк из концентратов сточных вод и вод поверхностных водоисточников
1. Раствор D, лизирующий раствор и раствор для отмывки (если они хранились при 2-8С) прогреть при 60С до полного растворения кристаллов.
2. Отобрать необходимое количество пробирок на 1,5мл с плотно закрывающейся крышкой, включая контрольную. В пробирки внести по 250мкл раствора D. Промаркировать пробирки.
3. Лизис материала: В пробирки с раскапанными 250мкл раствора D внести по ЮОмкл осветленных проб концентратов воды, перемешать на вортексе, осадить и добавить внутренний контрольный образец.
4. Подготовка отрицательного контроля этапа выделения РНК. В отдельную пробирку добавить ЗООмкл раствора D, перемешать на вортексе, осадить и добавить ЮОмкл отрицательного контрольного образца (ОКО).
5. Добавить к раствору ЗОмкл ацетата натрия. Перемешать на вортексе. Центрифугировать для удаления капель с крышек пробирок.
6. Добавить к раствору 0,3 мл кислого фенола, перемешать на вортексе. Центрифугировать для удаления капель с крышек пробирок.
7. Добавить к раствору 0,1мл хлороформшзоамила. Перемешать на вортексе 1-2 минуты (раствор должен стать молочно-белым).
8. Поставить пробирки в ледяную баню (0-+4С) на Юмин.
9. Центрифугировать пробирки при 14-16тыс. об/мин 10 минут. В процессе центрифугирования раствор разделится на 2 фазы: нижнюю фенол, содержащий белки и ДНК, и верхнюю - водную, содержащую РНК.
10. Раскапать в пробирки на 1,5мл по 450 мкл лизирующего раствора.
11. Аккуратно отобрать верхнюю фазу (приблизительно 0,3мл), используя наконечники с аэрозольным барьером, перенести в подготовленные пробирки с лизирующим раствором. Перемешать пробы на вортексе. Центрифугировать для удаления капель с крышек пробирок.
12. Ресуспендировать сорбент, интенсивно взбивая на вортексе.
Добавить в каждую пробирку отдельным наконечником по 25 мкл
ресуспендированного сорбента.
13. Перемешать содержимое пробирок на вортексе и оставить на 1 мин. в штативе. Перемешать содержимое пробирок еще раз на вортексе и оставить их в штативе до полного осаждения сорбента.
14. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге при 10 Tbic.g 30 сек.
15. Отобрать надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсос.
16. Добавить в пробирки по 450 мкл раствора для отмывки. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге при 10 Tbic.g 30 сек. Отобрать надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсос.
17. Добавить в пробирки по 500 мкл 70% этанола. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге при 10 Tbic.g 30 сек. Отобрать этанол из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсос.
18. Повторить отмывку этанолом.
19. Добавить в пробирки по 500 мкл ацетона. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге при 10 тыс. об/мин 30 сек. Полностью отобрать ацетон из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсос.
20. Высушить сорбент, поместив пробирки в термостат на 56С на 5 мин.
21. Ресуспендировать сорбент в 25 мл РНК-элюента, используя наконечник с барьером. Прогреть в термостате при 56С 2 мин, перемешать на вортексе и осадить сорбент на центрифуге при 10 Tbic.g 60 сек. РНК-пробы готовы к постановке реакции обратной транскрипции. (РНК-пробы не рекомендуется хранить дольше 30 мин. при +2 - +8С, для длительного хранения необходимо пробы замораживать при -70С).
Результаты исследования представлены на электрофореграммах (Рис.За, 36, Зв).
Изучение оптимальных режимов элюции энтеровирусов для обеспечения высокой эффективности их последующей детекции методом от-пцр, используя метод концентрирования на мембранном фильтре ммк
В связи с возросшим в последнее время антропогенным воздействием чрезвычайно важной является проблема индикации вирусного загрязнения в воде централизованного водоснабжения, которое может вызвать спорадическую или вспышечную заболеваемость населения. Среди широкого спектра микроорганизмов со сточными водами в водоемы поступают, энтеровирусы, обладающие высокой устойчивостью и, в связи с этим, способные проходить барьеры водопроводных сооружений.
Вопрос о возможности использования ОТ-ПЦР особенно остро стоит при исследовании проб воды, обработанной различными дезинфектантами, а также при оценке эффективности воздействия дезинфектантов на энтеровирусы, т.к ОТ-ПЦР-анализ дает представление о наличии в пробах всех энтеровирусов, в том числе и поврежденных, не культивирующихся на культурах клеток, но потенциально опасных, а не только цитопатогенных вирусных частиц. Для ответа на этот вопрос был проведен эксперимент по облучению проб воды, зараженной полиовирусом, различными дозами УФ с последующим концентрированием на мембранных фильтрах ММК и анализом вирусов на культуре клеток, в ОТ-ПЦР и в ИКК ОТ-ПЦР.
Задачей этого исследования было оценить возможность использования ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР для контроля энтеровирусного загрязнения воды, прошедшей УФ-обработку.
Исследования проводились на вирусе полиомиелита I типа, штамм LSc2ab и РНК-содержащем фаге MS-2, использующемся в экспериментальных исследованиях в качестве модели вирусного загрязнения.
Пробы дехлорированной водопроводной воды облучали УФ в дозах 16, 25, 23, 40, 50 и 60 мДж/см . После проведения УФО анализ на культуре клеток BGM выявил инактивацию полиовируса во всех пробах, подвергавшихся облучению, т.е. было показано, что даже доза облучения 16 мДж/см вызывает инактивацию вируса (Таблица7). ОТ-ПЦР-анализ выявил отсутствие инактивации РНК во всех пробах с дозами облучения от 16 до 60 мДж/см . Это подтверждает данные других исследователей [92,101].
В пробах, облученных 16,25,30 и 40 мДж/см результат ИКК ПЦР-анализа после 2-х суток инкубирования во всех повторностях был положительным. На 4-е сутки результат в этих вариантах опыта был положительным в каждой второй повторности, что свидетельствует о наличии цитопатогенных вирусов в этих пробах. В пробах, облученных дозами 50 и 60 мДж/см в культуральной жидкости на 2 и 4 сут. РНК энтеровирусов не была обнаружена. Это говорит об отсутствии размножения вирусов в культуре клеток в этих пробах.
Данные об отсутствии цитопатогенных вирусов при облучении 60мДж/см были подтверждены анализом фагов MS-2, которые, являясь наиболее адекватными индикаторами вирусного загрязнения, так как имеют равную с энтеровирусами устойчивость к обеззараживающим агентам, отражают эффективность очистки воды и ее обеззараживания в отношении кишечных вирусов [16], не были обнаружены в этих пробах. С использованием метода корреляционного анализа по критерию Спирмена установлена статистически достоверная связь (R=l,57, р=0,03) между обнаружением фагов и РНК цитопатогенных энтеровирусов, определенных методом ИКК ОТ-ПЦР, в пробах воды, обработанных УФО.
Исследования проводились с использованием полиовируса I типа (штамм LSc2ab) и РНК-содержащего фага MS-2. В первой серии экспериментов пробы водопроводной дехлорированной воды облучали УФ в дозах 16, 25, 45, и 60 мДж/см . Во второй серии пробы воды, обработанной хлором в концентрации 0,5мг/л свободного остаточного хлора (время контакта 30 минут) облучали УФ в дозах 16, 25 и 45 мДж/см . В третьей серии экспериментов пробы дехлорированной водопроводной воды обрабатывали хлором в дозах 0,5; 1,0 и 1,5мг/л свободного остаточного хлора (время контакта 30 минут).
Результаты исследования показали, что во всех сериях эксперимента с хлором (хлор и УФО, и хлор в различных дозах) всеми используемыми методами был получен отрицательный результат, то есть эти пробы не содержали ни цитопатогенных энтеровирусов, ни РНК энтеровирусов, ни РНК цитопатогенных энтеровирусов, ни фагов.
При заражении монослоя культуры клеток цитопатическое действие проявилось в I пассаже (при исключении неспецифической дегенерации клеток культуры) при дозе облучения 16 мДж/см и в III пассаже при дозах 25 и 45 мДж/см. При дозе облучения 60 мДж/см наблюдается инактивация цитопатогенных вирусных частиц (Табл.8).
